文摘gydF4y2Ba

酒精是一种潜在的2型糖尿病的危险因素,但其潜在的机制还不清楚。探索这个问题,Wistar鼠鼠肝癌细胞(Hepa 1 - 6)暴露于乙醇,8 g·公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}3个月和100毫米48 h,分别。葡萄糖和胰岛素耐受性测试gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba进行,蛋白质含量11gydF4y2Ba-hydroxysteroid脱氢酶1型(11gydF4y2Ba-HSD1)和糖皮质激素受体(GR)在肝脏和Hepa 1 - 6细胞测量。改变的关键酶糖质新生磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase (PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase),以及糖原合成酶激酶3 (GSK3gydF4y2BaαgydF4y2Ba),也检查了。结果显示,血糖水平增加,胰岛素敏感性是伴随着受损肝损伤大鼠暴露于乙醇与控制。11gydF4y2BaGSK3 -HSD1、GR、PEPCK G6Pase,gydF4y2BaαgydF4y2Ba老鼠的肝脏中蛋白质增加乙醇处理与控制。Ethanol-exposed Hepa 1 - 6细胞还显示11的高表达gydF4y2BaGSK3 -HSD1、GR、PEPCK G6Pase,gydF4y2BaαgydF4y2Ba比控制细胞的蛋白质。治疗后Hepa 1 - 6细胞暴露于乙醇与GR抑制剂RU486 11的表达gydF4y2Ba-HSD1和GR显著下降。同时增加PEPCK, G6Pase, GSK3gydF4y2BaαgydF4y2BaHepa乙醇引起的水平1 - 6细胞被RU486也减弱。结果表明,乙醇会导致葡萄糖耐受不良增加肝11的表情gydF4y2Ba-HSD1 GR,导致增加gluconeogenic和glycogenolytic酶的表达。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

在几十年里,许多从医学流行病学队列研究文献发现乙醇消费和2型糖尿病之间的密切联系(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。一些研究表明,过量饮酒引起2型糖尿病的发展,是一个潜在的糖尿病的风险因素;然而,食用适量的酒精报道降低糖尿病的发病率(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。到目前为止,酒精和糖尿病之间的关系尚未研究的很透彻了。值得注意的是,酒精诱发糖尿病的机制仍不确定。gydF4y2Ba

2型糖尿病是一种代谢综合征的特点是胰岛素抵抗和胰岛素分泌减少(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。之前的2型糖尿病是葡萄糖耐量(IGT)和空腹血糖受损(IFG)全球称为前驱糖尿病,这是增加患2型糖尿病的发展(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。受试者IFG增加肝葡萄糖输出和早期胰岛素分泌功能障碍,而主题IGT有严重肌肉中胰岛素抵抗gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。众所周知,磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase (PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)病原反应酶在肝醣类,而糖原合成酶激酶3 (GSK3)中扮演一个重要的角色在葡萄糖生产和存储(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

对手的胰岛素作用,糖皮质激素是增加葡萄糖的主要来源的生产在2型糖尿病虽然upregulation糖质新生的关键酶。多余的组织糖皮质激素行动可能导致高血糖和胰岛素抵抗与2型糖尿病有关。不活跃的糖皮质激素(可的松,11-dehydrocorticosterone)转化为活性形式(皮质醇,皮质甾酮)11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-hydroxysteroid脱氢酶1型(11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1) [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。活跃的糖皮质激素糖皮质激素受体(GR)绑定到刺激PEPCK和G6Pase的表达,提高葡萄糖生产糖质新生和肝脏中糖原降解[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

良好,长期过量乙醇消费损害葡萄糖耐量,诱发胰岛素抵抗,导致2型糖尿病的发展。乙醇导致胰腺氧化和内质网应激gydF4y2BaβgydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),这可能导致胰岛素分泌障碍[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。在目前的研究中,我们调查是否改变与11葡萄糖耐量gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR在大鼠长期接受大量的乙醇对应于人类慢性酒精中毒。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。材料gydF4y2Ba

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),胎牛血清(的边后卫)、青霉素、链霉素,0.25%胰蛋白酶EDTA溶液从Gibco BRL购买(美国纽约大岛)。RU486购买从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。胰岛素是购自礼来,长春,中国。葡萄糖氧化酶工具包获得北京BHKT临床试剂有限公司,北京,中国。(gydF4y2Ba^{125年gydF4y2Ba}我)胰岛素放射免疫检定法装备是购自天津九个三脚医学与生物工程有限公司,天津,中国。多克隆抗体11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1、GR、PEPCK G6Pase GSK3的gydF4y2BaαgydF4y2Ba和肌动蛋白,山羊anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭都购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。GAPDH是购自Epitomics(伯林盖姆、钙、美国)。发射极耦合逻辑免疫印迹基质购买从皮尔斯(美国罗克福德热费希尔科学)。化学试剂对蛋白质印迹了σ和聚乙二烯二氟化物膜来自Bio-Rad(美国大力神)。gydF4y2Ba

2.2。动物实验gydF4y2Ba

雄性Wistar鼠(200 - 220 g)从实验动物获得控股吉林大学的设施被随机分为两组:正常对照组和ethanol-treated组。经过一个星期的适应环境、乙醇组给予36%的乙醇(8 ggydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})通过胃内的管,对照组给予同等体积的水。这届政府进行了两次每天上午9点和下午4点三个月了。两组老鼠免费获得一个正常的食物和水。每周体重和食物摄入量都被记录下来。动物保健和协议处理的动物保健和使用委员会批准吉林大学。gydF4y2Ba

2.3。细胞培养gydF4y2Ba

小鼠肝癌细胞(Hepa 1 - 6)获得写明ATCC种植与10%胎牛血清的DMEM补充,谷酰胺(200毫米)1%,青霉素(40单位gydF4y2Ba·gydF4y2Ba毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和链霉素(40gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2Ba·gydF4y2Ba毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。Hepa 1 - 6细胞trypsin-EDTA解决方案,通过使用0.25%播种1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba·gydF4y2Ba菜gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}与10%的边后卫,3毫升DMEM和孵化37°C 48 h。菜的细胞被随机分为4组:(1)控制,(2)控制+ RU486,乙醇(3),(4)乙醇+ RU486。细胞在乙醇和乙醇+ RU486组治疗100毫米乙醇刷新每12 h 48 h。10µM RU486, GR的抑制剂,在24日添加到细胞h(乙醇孵化控制+ RU486和乙醇+ RU486组24 h。RU486溶解在乙醇股票10毫米的浓度,与培养基稀释1000倍,和相同浓度的溶剂被用于控制和乙醇组。gydF4y2Ba

2.4。腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)gydF4y2Ba

IPGTT进行3个月的年龄16 h后快速使用ip葡萄糖注射液(2 ggydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。血液被尾巴剪断(0),30岁,60岁,120分钟后葡萄糖注射液。测定血清样本中的葡萄糖浓度使用葡萄糖氧化酶工具包。gydF4y2Ba

2.5。胰岛素耐量试验(ITT)gydF4y2Ba

ITT公司执行后在3个月的年龄12 h快速使用ip胰岛素注射(0.75 UgydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。血液通过相同的方法对于IPGTT测量血糖浓度。gydF4y2Ba

2.6。血浆胰岛素gydF4y2Ba

老鼠禁食16 h和血液从腹主动脉与腹腔注射麻醉聚氨酯(1克/公斤体重)。每个样本中胰岛素浓度是衡量RIA,和血浆葡萄糖浓度测定用葡萄糖氧化酶工具包。gydF4y2Ba

2.7。西方墨点法gydF4y2Ba

肝组织和Hepa 1 - 6细胞均质在4°C 1毫升或500gydF4y2BaμgydF4y2BaL的冰冷的te缓冲(20 mM Tris-HCl, pH值7.4,包含250毫米蔗糖,EDTA 1毫米,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,0.01毫米亮抑酶肽,和5gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2Ba·gydF4y2Ba毫升抑肽酶)60分钟,溶解产物在10000转离心5分钟在4°C。整除的上层清液由布拉德福德被用于蛋白质分析方法(Bio-Rad)。样品(160gydF4y2BaμgydF4y2Bag蛋白)被煮沸5分钟变性和10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后electroblotted到聚乙二烯二氟化物膜(Bio-Rad)在4°C。阻塞后5% (w / v)脱脂牛奶在室温下2 h,膜与各自的兔多克隆特定孵化主要抗体在4°C与温和搅拌过夜。膜的清洗3次10分钟每15毫升TBST(10毫米Tris-HCl、150毫米氯化钠和0.1% (v / v) Tween-20),然后用二次孵化抗体(1:2000山羊anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭)在室温下2 h。蛋白质的乐队和ECL x射线胶片上的可视化。使用数量的蛋白质乐队进行扫描和量化一个图像分析软件(Bio-Rad)。gydF4y2Ba

2.8。统计分析gydF4y2Ba

所有数据被表示为均值±SEM。统计分析使用gydF4y2Ba以及意义使用SPSS软件Windows(版本13.0)。gydF4y2Ba被认为是重要的。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。乙醇对大鼠体重和代谢参数gydF4y2Ba

在研究期间平均体重和食物摄入量在表中做了总结gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。体重控制和乙醇组之间没有明显不同。平均12周的食物摄入乙醇组(gydF4y2BaggydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(gydF4y2Ba卡尔gydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}])略低与控制(gydF4y2BaggydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(gydF4y2Ba卡尔gydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}])。然而,乙醇摄入的量(8 ggydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})提供47.8大卡gydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},增加的总热量摄入乙醇组451.1卡路里gydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}与对照组相似。提出了乙醇引起的代谢变化表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。Ethanol-treated组有更高的空腹血糖、总胆固醇、甘油三酸酯,丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平与对照组相比gydF4y2Ba)。血浆胰岛素水平降低ethanol-treated组(gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IPGTT和ITT在乙醇和对照组更准确地确定葡萄糖耐量和胰岛素敏感性(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。IPGTT血糖曲线如图所示,乙醇组的大鼠血糖较高与对照组相比,和血糖曲线下的面积(更易gydF4y2Ba·gydF4y2BalgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2Bamin)明显大于ethanol-treated组与对照组(gydF4y2Ba)。在胰岛素耐量试验(ITT),葡萄糖浓度下降缓慢ethanol-treated集团和葡萄糖水平的120分钟(初始的百分比)乙醇组明显高于对照组(gydF4y2Ba)。这一结果表明,3个月的乙醇摄入(8 ggydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})胰岛素抵抗引起的。总的来说这些数据表明长期酒精摄入可导致胰岛素抵抗,葡萄糖耐受不良和脂质代谢的改变。gydF4y2Ba

3.2。11日乙醇的影响gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR蛋白在大鼠肝脏gydF4y2Ba

调查11的改变gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR在老鼠的肝脏乙醇暴露后,其蛋白质含量测定用西方免疫印迹(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。11的蛋白质水平gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1显著升高ethanol-treated老鼠的肝脏与控制(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba)。同时,GR的蛋白表达高于乙醇比对照组(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3。乙醇的影响主要Gluconeogenic酶和糖原合成酶激酶3大鼠肝脏gydF4y2Ba

PEPCK的表达和G6Pase病原反应酶在糖质新生,在ethanol-treated显著增加大鼠与控制(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba),至少部分解释ethanol-treated老鼠的高血糖。,GSK3水平gydF4y2BaαgydF4y2Ba高ethanol-treated老鼠比控制(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba)。GSK3糖原合酶灭活,病原反应酶在糖原合成,和超表达GSK3减少肝脏中糖原合成和损害葡萄糖利用率。gydF4y2Ba

3.4。11日乙醇的影响gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR Hepa 1 - 6细胞gydF4y2Ba

肝脏是负责葡萄糖代谢的主要器官之一;因此,我们进一步检查,如果观察成年大鼠发生在肝细胞(Hepa 1 - 6)。Hepa 1 - 6细胞接受100毫米乙醇刷新每12 h共48 h。乙醇治疗24小时后,10µM RU486是补充道。用MTT试验初步结果表明Hepa 1 - 6细胞生存能力不是由这个浓度改变RU486(数据没有显示)。11的蛋白质水平gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1显著升高Hepa 1 - 6细胞治疗与乙醇相比,控制细胞(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。GR抑制剂RU486的蛋白表达显著减少11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1控制和ethanol-treated细胞。GR蛋白质含量表现出相似的变化(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.5。乙醇的影响在Hepa Gluconeogenic酶1 - 6细胞gydF4y2Ba

大鼠肝脏中观察到gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,PEPCK ethanol-treated的蛋白质水平显著高于控制Hepa 1 - 6细胞(gydF4y2Ba)。在这些细胞中,RU486 PEPCK蛋白表达下降(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。的蛋白表达G6Pase呈现相似的变化(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.6。乙醇的影响在Hepa 1 - 6细胞糖原合酶激酶gydF4y2Ba

如图gydF4y2Ba5gydF4y2BaGSK3的gydF4y2BaαgydF4y2Ba蛋白质水平显著增加Hepa 1 - 6细胞治疗乙醇,和GSK3 RU486减少了gydF4y2BaαgydF4y2BaHepa 1 - 6细胞蛋白表达有或没有事先乙醇治疗。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

沉重的乙醇消费是一个潜在的2型糖尿病的危险因素。人类饮酒剂量的50 - 60 ggydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每天两次发展2型糖尿病(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。在目前的研究中,老鼠在8 g的乙醇gydF4y2Ba·gydF4y2Ba公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}·gydF4y2BadgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}3个月有葡萄糖耐受不良,降低胰岛素敏感性与脂质调节改变。老鼠也有降低空腹胰岛素水平,与过量乙醇导致胰腺癌的建议一致gydF4y2BaβgydF4y2Ba通过氧化细胞功能障碍和细胞凋亡和内质网应激gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。空腹血糖升高,胰岛素抵抗的关联表明,乙醇会导致葡萄糖调节的改变导致糖尿病前期和IGT。考虑到这些特点,本研究的重点是在乙醇对肝酶调节葡萄糖代谢的影响,因为这些都可以解释胰岛素抵抗和空腹血糖升高。首先,病原反应酶在肝醣类和糖原合成参与2型糖尿病的发展确定大鼠暴露于乙醇。结果表明,饮酒增加表达PEPCK G6Pase,糖质新生的关键酶。此外,乙醇肝GSK3增强蛋白质的表达gydF4y2BaαgydF4y2Ba,一个同种型糖原合成酶激酶3 (GSK3)。GSK3是一个既定的活跃的激酶磷酸化在静息细胞变得迅速灭活的Ser 21 (GSK3gydF4y2BaαgydF4y2Ba)和Ser 9 (GSK3b)对胰岛素(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。GSK3表达式和活动都是在肌肉和肝脏组织中升高糖尿病人类和啮齿动物(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。此外,GSK3抑制剂改善糖尿病的胰岛素敏感性在动物模型中,缓解高血糖通过减少肝醣类和刺激糖原合成(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。因此,目前的研究表明,PEPCK表达升高,G6Pase, GSK3gydF4y2BaαgydF4y2Ba可能与葡萄糖耐受不良引起的和2型糖尿病的病因长期大量饮酒。gydF4y2Ba

越来越多的证据表明,PEPCK和G6Pase由11gydF4y2BaβgydF4y2Ba通过放大-HSD1和GR组织内的糖皮质激素作用[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1 NADPH-dependent还原酶,将不活跃的可的松(老鼠11-dehydrocorticosterone)转化为积极的皮质醇(皮质甾酮)。增强的11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1活动导致生产过剩的组织糖皮质激素,绑定和激活当地GR与内脏肥胖和2型糖尿病gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。它已经表明,药理的封锁11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1表达式防止活性糖皮质激素的生成,减少肝GR表达,进而导致PEPCK和G6Pase mRNA表达的抑制和改善胰岛素抵抗糖尿病gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠和老鼠肥胖Zucker [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。此外,GR封锁与RU486减毒通过抑制2型糖尿病的表现型GR和11的表达gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1在肝脏gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。Corticosterone-induced GR的表情,11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1, PEPCK也被RU486 [gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。这些公布的数据表明GR和11之间的积极关系的存在gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1在调节肝脏gluconeogenic酶,暗示GR或11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1作为一个潜在的目标治疗2型糖尿病和肥胖。目前的研究表明,11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR蛋白质含量显著增加在老鼠和Hepa 1 - 6细胞暴露于乙醇,而11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR蛋白质含量抑郁Hepa RU486治疗后1 - 6细胞。RU486 PEPCK也减少了蛋白表达,G6Pase, GSK3gydF4y2BaαgydF4y2Ba,这是由11所示gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR。因此,数据表明,高11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR可能导致PEPCK表达的增加,G6Pase, GSK3gydF4y2BaαgydF4y2Baethanol-treated老鼠的肝脏。gydF4y2Ba

总之,ethanol-exposed大鼠葡萄糖耐量。酶的蛋白表达与肝醣类(PEPCK G6Pase)和糖原合成(GSK3gydF4y2BaαgydF4y2Ba)在大鼠暴露于酒精增加协会的upregulation 11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR。GR封锁RU486逆转这些异常。结果表明,升高11gydF4y2BaβgydF4y2Ba-HSD1和GR,提高糖质新生,减少糖原合成,可能导致葡萄糖耐受不良的发展大鼠长期大量饮酒。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

z孟和x包了同样工作和被认为是co-first作者。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作是支持的项目资金从吉林省级科技部门(20070728 - 2),国家重点实验室开放项目下的吉林大学超分子结构与材料的批准号SKLSSM200912,加拿大糖尿病协会。gydF4y2Ba