文摘

背景。Pentoxifylline (PTX) anti-TNF属性已知发挥王亚南在各种肝损伤模型的影响。本研究的目的是调查是否PTX有益的角色发展的蛋氨酸和choline-deficient (MCD)食源性NAFLD SD大鼠在活的有机体内和肿瘤坏死因子-α全身Hep3B细胞在体外。方法。SD大鼠被分类根据饮食(食物或MCD饮食)和治疗(生理盐水或注射PTX)在一段时间内的4周:集团我(chow +生理盐水,),第二组(chow + PTX),第三组(MCD +生理盐水),第四组(MCD + PTX)。Hep3B细胞治疗100 ng / ml TNF -α(24小时)没有或存在PTX(1毫米)。结果。PTX减毒MCD-diet-induced血清ALT水平和肝脏脂肪变性。实时聚合酶链反应和免疫印迹分析,PTX MCD-diet-induced降低tnf mRNA表达和proapoptotic展开蛋白质反应ER应激(GRP78、p-eIF2 ATF4, IRE1α切,p-JNK激活)在活的有机体内。PTX(1毫米)降低TNF -α全身的激活GRP78、p-eIF2 ATF4 IRE1α,切在体外。结论。PTX有有益的角色发展的MCD-diet-induced肝病通过部分抑制TNF -α和ER应激。

1。介绍

尽管提出了理论(1,2)非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发病机理受到了挑战,慢性炎症中起着举足轻重的作用在脂肪肝的发展。肿瘤坏死因子-α和il - 6与炎症相关细胞因子,发现高水平学科非酒精性脂肪肝炎(纳什)比那些没有简单纳什(3]。因此,针对TNF -治疗策略α一直在试图减少脂肪积累和提高AST(天冬氨酸转氨酶)和ALT(丙氨酸转氨酶)脂肪肝患者(4- - - - - -6]。在药物用于抑制或抑制肿瘤坏死因子-α表情,pentoxifylline (PTX),据报道,非选择性磷酸二酯酶抑制剂降低TNF -α基因转录以及影响细胞因子通路中的多个步骤,直接或间接抑制肿瘤坏死因子-α在临床领域,目前用于治疗心血管疾病(4,7- - - - - -9]。几个试点研究表明pentoxifylline NAFLD和纳什的有利影响4,5,10]。内质网和氧化应激的肝脂肪变性和炎症的发生和发展与代谢压力条件下(11]。最近,Zhang et al。9]证明了ER应激肝脂肪变性。

根据这些报道,我们推测,脂肪存储,由cytokine-mediated引发炎症,可以减少通过ER的减轻压力。因此,我们调查是否pentoxifylline蛋氨酸和choline-deficient有益作用(MCD)食源性脂肪肝大鼠动物模型,研究分子途径与ER应激有关。

2。方法

2.1。细胞培养

人类Hep3B杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(韩国大邱,Welgene DMEM)为4.5 g / L与10%葡萄糖和谷氨酰胺补充2毫米的边后卫,1.5 g / L碳酸氢钠,100国际单位/毫升青霉素和链霉素100 ug /毫升。媒介是每周两次改变,细胞维持在37°C孵化器。细胞时亚文化支流(每隔5 ~ 7天)使用胰蛋白酶(2.5 g / L)和EDTA (1 g / L)。

免疫印迹分析,细胞被镀在3×10⁵/在6-well盘子然后100 ng / mL TNF -对待α(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州)没有或有1毫米PTX(σ)。

2.2。动物和实验协议

雄性SD (SD)中老鼠(男,220 - 280克体重)从东方购买生物有限公司(韩国国军),随机分为4组(每组6个老鼠)如下。组我:周饮食+生理盐水注射(一次/天,i.p。);组2:食物饮食+ PTX注入(50毫克/公斤,每天一次,i.p;PTX);第三组:MCD饮食+生理盐水注射(一次/天,i.p。);第四组:MCD饮食加上PTX注入(50毫克/公斤,每天一次,i.p)为四个星期。Pentoxifylline (PTX)从Handock购买药品(首尔,韩国),MCD饮食是购自Dyets Inc .(宾夕法尼亚州伯利恒)。老鼠在维护相对湿度,,12小时光/暗周期。血液通过心脏穿刺,肝脏被移除和体重。肝脏被固定在10%福尔马林或吸附在液态氮冷冻,然后储存在进行组织学分析。所有实验过程在无菌条件下进行和批准的机构动物保健和使用委员会延世大学的医学院。

2.3。测定血清和肝生化水平

天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆固醇(T-CHO)和甘油三酯(TG)血清中量化使用商业套装(韩国首尔Asanpharm Inc .)。冷冻肝组织均质在0.9%氯化钠溶液,和匀浆稀释的解决方案1:2氯仿:甲醇。匀浆积极与旋涡混合器混合,在1000转离心20分钟。上阶段是吸气,然后氯仿相被用于各种代谢物的分析。

2.4。组织学分析

新鲜的组织被冷冻后每只动物牺牲,和prelabeled基地组织被模具充满冰冻组织包埋剂用于确保最佳切削温度(10月)。常规冷冻切片(7μm)沾油红O(σ,圣路易斯,密苏里州)。石蜡包埋部分与苏木精和伊红染色())和马森的三色的。评估肝脂肪变性的形态学分析上执行两个随机选择的字段(200×放大)的每个动物部分使用一个奥林巴斯IX71显微镜与奥林巴斯DP70相机(奥林巴斯光学公司,日本东京)。

2.5。实时聚合酶链反应

总RNA从肝脏孤立使用试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。肝mRNA水平的肿瘤坏死因子-α被量化使用ABI棱镜7500序列实时PCR检测系统(应用生物系统公司,福斯特,CA)肿瘤坏死因子- fluorogenic探针和引物α猫:向前,5′aat GGC CTC有条件现金援助CAG TT-3′;相反,5′cca CTT GGT GGT TTG CTA CGA-3′。PCR反应和分析获得使用序列检测器的软件(应用生物系统公司,福斯特,CA)。

2.6。免疫印迹

均质肝组织或Hep3B细胞溶解在裂解缓冲(内含生物技术,国军,韩国)包含50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,150毫米氯化钠,1毫米EDTA,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 1μM phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF) 5μg / mL抑肽酶和5μ克/毫升亮抑酶肽。蛋白质提取使用布拉德福德量化分析(Bio-Rad大力神,CA)。蛋白质提取加载到10% sds - page,紧随其后的是转移到硝酸纤维素(Bio-Rad)。与5%的脱脂牛奶1 xpbs阻塞后,每个特定的膜被孵化主要抗体,包括GRP78(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)、道达尔和phospho-eIF2α(MA)细胞信号技术,丹弗斯ATF4 (Santa Cruz), ATF6 (ABNOVA,台北市,台湾),IRE1 (Santa Cruz), phospho-JNK(细胞信号),切β肌动蛋白(Santa Cruz),一夜之间在4°C。膜的清洗TBS-T孵化和过氧化物酶共轭anti-rabbit免疫球蛋白或anti-mouse免疫球蛋白(Santa Cruz)在室温下一个小时。膜的清洗和孵化与检测解决方案(英国通用电气医疗集团,白金汉郡,NA)一分钟,然后暴露于电影。每个特定频带的信号强度在西方的屁股量化使用国立J密度图像分析软件(版本1.20)。

2.7。统计分析

执行统计分析使用棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。结果表示为平均数±标准差。统计显著性计算使用单向方差分析(方差分析),事后Bonferroni多重比较检验评估群体之间的差异。被定义为传统的统计意义值< 0.05。

3所示。结果

3.1。肿瘤坏死因子的影响,α和Pentoxifylline可行性Hep3B细胞

Hep3B细胞暴露于10、20、50、100和200 ng / mL TNF -α24小时显示显著减少可行性评估的MTT (1.00±0.02与0.83±0.04、0.86±0.03、0.85±0.02、0.86±0.04、0.87±0.01,P< 0.001)。与未经处理的控制相比,Hep3B细胞与1毫米PTX治疗24小时显示统计增加生存能力(1.00±0.02与1.07±0.01,P< 0.05)。与1毫米pentoxifylline预处理2 (),4 h ()显著降低TNF -α——诱导Hep3B细胞生存能力P< 0.001与10、20、50、100和200 ng / mL TNF -α)。基于这些结果,我们选择100 ng / mL TNF -的浓度α并为这个实验(图1毫米PTX1)。

3.2。代谢MCD饮食和Pentoxifylline对SD大鼠的影响

老鼠的重量损失是不同给定MCD +盐水(第三组)和MCD + PTX(第四组)4周:−53.6±9.2克(19.6%)和-63.4±10.2克(23.4%)从他们最初的身体重量。然而,并没有显著的差异。这种程度的减肥类似于之前报道数据,老鼠放在MCD饮食(1- - - - - -3]。相比之下,在对照组大鼠获得少量的体重(4.6%)在研究期间。肝脏重量不是四组之间的不同。肝脏重量的比例体重第三和第四组(表之间是相似的1)。

T-CHO TG的血药浓度,使用血清AST、ALT进行了分析。老鼠在第三和第四组显示统计降低血清TG和T-CHO水平相对于对照组的老鼠。MCD-fed老鼠ALT水平显著增加(III和IV)组与对照组相比,但是没有第三和第四组(图之间的区别2)。

3.3。肝MCD饮食和Pentoxifylline对SD大鼠的影响

宏观和肝脏病理组织学图像。肝脏部分沾着他走时,马森的三色的,油红O染色。在食物喂养的老鼠的饮食(组I和II),没有检测到脂肪改变外观和微观形象评估总值)和油红O染色。相比之下,MCD-diet-fed老鼠的肝脏显示黄色标记,典型的脂肪变性。符合统计增加血清ALT水平,大量的微小脂肪和最小perisinusoidal周围炎症区被出现在第三组。在大鼠管理pentoxifylline,黄色的强度以及脂肪积累减少。除了肝脏变色和脂肪积累,最小perivenular纤维化通常出现在纳什在MCD-fed老鼠被发现(图3(一个))。

在第三和第四组增加了大鼠肝脏甘油三酯含量相对于大鼠对照组(515.1±200.5,375.7±35.92与223.6±50.02毫克TG /毫克蛋白)和被发现在第三组显著增加()。然而,第三和第四组间没有统计学差异(图3 (b))。

3.4。MCD-Diet-Induced肝肿瘤坏死因子的影响α表达式

肝肿瘤坏死因子-αmrna的四组使用实时PCR测定。肝tnf基因表达显著增加MCD饮食组(组III和IV)相对于对照组(1.14±0.15与8.12±0.45,,两个)。PTX管理局(50毫克/公斤,每天一次,i.p) MCD饮食大鼠(第四组)显著降低TNF -α信使rna表达()相比MCD-diet-fed老鼠在三世(图组4)。

3.5。Pentoxifylline对肿瘤坏死因子的影响α全身的肝细胞和Hep3B细胞ER应激

免疫印迹分析进行直接或间接的差别来阐明假设对这些肿瘤坏死因子-α全身的ER应激pentoxifylline会减弱hepatosteatosis标记。

ER应激标记在肝脏蛋白质含量测定在活的有机体内。chow-diet-fed老鼠(我)组相比,MCD饮食喂养的大鼠(第三组)显示增加水平的GRP78, phosphor-eIF2α,ATF6 ATF4 IRE1 p-JNK,排骨,显著增加ATF4, ATF6和IRE1 (ATF6,ATF4和IRE1)。MCD-diet-fed老鼠在第三组相比,phosphor-eIF2 GRP78的表达α,ATF6 ATF4 IRE1 p-JNK,砍在PTX-administered减毒,MCD-fed鼠(第四组),明显在GRP78, p-eIF2α、ATF4 ATF6 (GRP78和p-eIF2α,ATF4和ATF6 resp)(图5(一个))。

Hep3B细胞暴露于100 ng / mL TNF -α24小时激活GRP78, phosphor-eIF2α、ATF4 IRE1,切在体外。被发现在phosphor-eIF2明显增加α,IRE1 ATF4 p-JNK和切(对于p-eIF2α、ATF4和IRE1 p-JNK和切)。预处理与1毫米PTX 18和24小时降低TNF -α全身的ER应激在Hep3B细胞,在p-eIF2显著α,IRE1 ATF4 p-JNK,砍(图5 (b))。

4所示。讨论

类似于不满意解释病理生理学的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)包括脂肪变性+坏死性炎症,争议仍然存在有关治疗的有效性策略针对氧化应激和TNF -α(4,5在非酒精性脂肪肝的治疗。虽然异构pentoxifylline结果已报告从非酒精性脂肪肝治疗的随机对照试验4pentoxifylline-treated患者),一致的证据关于改善肝脏转氨酶水平,其安全治疗酒精肝的治疗疾病,并显著改善死亡率建议pentoxifylline治疗非酒精性脂肪肝(候选人6]。很少有研究调查的影响上pentoxifylline inflammation-induced非酒精性脂肪肝动物模型。鉴于这些事实,我们的注意力集中在antihepatotoxic pentoxifylline效果(PTX),一个非选择性TNF -α抑制剂,在改善炎症和脂肪滴积累蛋氨酸和choline-deficient (MCD)食源性肝病。我们假设PTX可以抑制肿瘤坏死因子-α全身的内质网(ER)压力和活性氧(ROS)通路,使肝病的减轻在体外和在活的有机体内。有关动物模型用于研究肝病的发病机制或治疗功效描述人类状况,我们采用了MCD-diet-induced鼠性脂肪肝模型。MCD饮食消耗肝抗氧化剂,如谷胱甘肽和S-adenosylmethionine (S-AMe)和肿瘤坏死因子-诱发生产α和其他促炎细胞因子(7]。根据一项研究,经过26天的MCD喂食,血清ALT水平持续增加,肝病并最终开发(1]。在这项研究中,老鼠被喂食食物或MCD饮食为4周。

本研究有两个主要发现。首先,按照先前的报道,MCD饮食管理的4周诱导脂肪变性,炎症和肝细胞气球样变性,但不是pericellular纤维化。内质网(ER)压力被发现导致降解蛋白质错误折叠或展开的ER通过三个途径,包括双链RNA-activated蛋白质kinase-like ER-resident激酶(活跃),inositol-requiring蛋白1(愤怒),和激活转录factor-6 (ATF6)途径8]。类似于先前的报道在发展非酒精性脂肪肝(ER应激8,9),MCD饮食增加肝肿瘤坏死因子-α表达和激活ER应激因素如毕普/ GRP78, p-eIF2, ATF4, ATF6 IRE1,切。与100 ng / mL TNF -治疗αin体内还导致ER应激。肝细胞之间的统计学意义的差异从MCD饮食获得老鼠和Hep3B细胞ER的表达压力标记组TNF -α只和两组TNF -α和PTX可能归因于非均匀模式下游的ER应激标记,特别是ATF4,排骨,GADD34人类和动物学科(非酒精性脂肪肝和非10]。

在与人类的肝代谢的后果代谢综合征(12),MCD-fed动物展示减肥相关的脂肪组织的萎缩(2]。在这个实验中,食物的饮食导致的老鼠体重增加约132.9克,但MCD饮食导致减少体重约53.6克经过4周的饮食。这减肥MCD饮食组下降了50.8%和58.3%血清甘油三酯和总胆固醇水平相比chow饮食组,有统计学意义。控制,相比MCD-induced肝病也导致AST和ALT水平增加50.8%和233.0%,有统计学意义只存在于ALT水平。

第二,腹腔内治疗pentoxifylline MCD喂养的大鼠饮食中减少脂肪的积累。然而,PTX的影响和肝体重或血清血脂和转氨酶不深刻。PTX对代谢的影响最小,而矛盾的预期结果,可能归因于MCD饮食的压倒性的效果由于长期四周喂养模型采用了在这个研究。传统的持续时间(MCD饮食范围从2到3周1- - - - - -3]。然而,相比MCD-fed老鼠,老鼠美联储PTX显示显著降低肝细胞肿瘤坏死因子的表达α信使rna。在体外,与1毫米PTX预处理100 ng / mL TNF -的存在α减毒ER应激。我们已经表明,pentoxifylline对肝病细胞因子诱导的抗炎作用。因此,当我们和其他人发现,pentoxifylline可能通过减轻ER压力起到主要作用。

总结一下我们的数据,我们发现pentoxifylline (PTX)缓解压力在TNF - ERα全身的细胞毒性人类肝癌Hep3B细胞在体外和保护作用在肝病的发展蛋氨酸和choline-deficient (MCD)饮食动物模型在活的有机体内。还需要进一步的临床研究来评估使用PTX治疗非酒精性脂肪肝。

利益冲突

作者声明没有二元性与本文相关的利益。

作者的贡献

Chae m k和s . g .公园同样这项工作。

确认

这项研究得到了韩国国家研究基金会资助(nrf - 2010 - 0003277)由韩国政府(最高明的)和朝鲜糖尿病协会(2009)。