文摘

人类胰岛移植的孤立暴露在多种应力包括氧化应激和缺氧导致重大损失的功能β细胞团块。在这项研究中,我们调查了在胰岛细胞凋亡通路基因的调制接触过氧化氢、过氧亚硝基,缺氧,细胞因子。我们观察到平行感应pro -基因和凋亡通路和识别几个小说包括BFAR CARD8 BNIP3, CIDE-A。BNIP3自噬的诱导物,我们检查了这个途径MIN6细胞,老鼠和人类胰岛β细胞线。文化MIN6细胞在低血清条件下增加一些蛋白质的水平自噬通路,包括ATG4 LAMP-2, UVRAG Beclin 1日。氨基酸不足导致人类胰岛诱导自噬。预处理的小岛从低氧诱导细胞凋亡诱导的自噬保护他们。然而,诱导自噬在缺氧加剧了凋亡细胞死亡。ER应激诱导的自噬和凋亡β细胞。MnSOD的过度表达,一种酶,这种酶进行清除自由基,导致保护MIN6细胞细胞因子诱导的细胞凋亡。神经酰胺,中介细胞因子诱导的损伤,降低了活跃的一种蛋白激酶的磷酸化形式和bcl - 2启动子活性的抗凋亡基因的表达下调。此外,cytokine-stimulated物途径表达下调的bcl - 2启动子活性逆转通过与SP600125预孵化,物抑制剂。我们的研究表明,β在胰岛细胞凋亡由多个强调孤立的移植是精心策划的结果在细胞凋亡通路基因表达。

1。介绍

细胞凋亡的主要途径是外在途径,由Fas和其他导致死亡受体激活caspase-8,线粒体途径和内在,受bcl - 2家族的蛋白质导致caspase-9[的激活1,2]。这两个通路激活caspase-3收敛。凋亡通路都参与β细胞死亡在1型和2型糖尿病3]。Fas (CD95 / APO-1)是36-kD死亡时启动细胞凋亡在许多细胞类型的受体蛋白质交联Fas配体(FasL / CD95L) (4]。人类糖尿病胰腺活检组织学的研究已经证明了Fas表达β细胞和FasL的表达在浸润细胞(5]。然而,内在线粒体通路,由蛋白质的bcl - 2家族,由proapoptotic(伯灵顿和Bak1)和凋亡(bcl - 2、Bcl-xL mcl1,等等)蛋白(6),已被证明扮演主要角色在孤立的小岛的损失7]。这两个组之间不平衡的蛋白质导致细胞色素c的释放,而激活caspase-9 [2]。BH3-only蛋白质,proapoptotic蛋白质的一个子集,作为传感器细胞应激(8,9]。这个家庭的成员包括坏的,报价,Bmf, Hrk,荡妇,Bik,病因,彪马。他们通过激活诱导细胞死亡proapoptotic蛋白质或中和凋亡蛋白。报价由caspase-8把线粒体和导致细胞色素c的释放,从而连接了两种细胞凋亡通路(10]。

自噬溶酶体降解通路,提供能量的条件下通过self-digestion饥饿。在氧化应激过程中,自噬是一种防御机制清除氧化受损蛋白质和细胞器11]。自噬的主要途径有三:(1)即使伴娘自噬(CMA),发现仅在哺乳动物细胞和胞液蛋白质降解选择性;(2)microautophagy,溶酶体直接吞噬胞质成分通过溶酶体膜内陷;和(3)macroautophagy(称为自噬),胞质内容包括细胞器和蛋白质隔离在双层膜结构被称为自噬体与溶酶体融合,导致退化。一系列成熟的步骤涉及ATG家族的蛋白质参与自噬小体的形成。在30 ATG基因在酵母,11 (ATG1、3 - 10、12、16)在哺乳动物细胞有直接同源。自噬囊泡含有多种蛋白质,包括类型(或类)III PI3激酶(vps34) Beclin 1 (ATG6) UVRAG, Ambra。自噬体的形成的重要一步是LC3的接合与phosphatidylethoanlamine (ATG8)形成LC3-PE (LC3-II)这对自噬是一个标准的标记。广泛的自噬可能导致2型细胞死亡,细胞程序性死亡的第二个模式(12]。岁的分泌颗粒在β细胞是由crinophagy退化(13]。生产和分泌胰岛素之间的不平衡,这是可能发生在2型糖尿病,诱发自噬降解胰岛素颗粒积累(14]。Ubiquitinated蛋白质总量的积累βZucker肥胖大鼠胰岛细胞已经被证明能够促进自噬(15]。自噬活动增加一直在观察Rab3A的小岛^−−/显示在胰岛素分泌缺陷的老鼠13]。

小岛是不同的细胞类型包括的集群,,和PP细胞,产生胰岛素β细胞的主要成分(70 - 80%)。胰岛内血管供应是至关重要的氧气,营养,和激素的分泌。这些船只是破坏胰岛细胞分离过程中。因此,胰岛移植后早期很容易受伤,由于延迟血管再生(16]。即使在血管再生,血管密度相比大大减少内源性小岛(17]。与血管生成相关的基因的表达减少糖尿病移植受者,进一步延缓血管再生过程(18]。细胞凋亡的分子机制β细胞移植胰岛的设置是不清楚。本研究的目的是分析人类胰岛细胞凋亡通路基因的表达受到压力与胰岛细胞分离和移植并确定stress-signaling通路的作用。

2。实验程序

2.1。人类文化小岛和MIN6细胞

人类胰岛分离从尸体的捐助者提供的集成胰岛分布程序(IIDP)。小岛纯度为70%至95%,70% - -95%的可行性。小岛在1066年CMRL培养基培养(Mediatech Inc .)、亨顿,弗吉尼亚州)与人血清白蛋白(补充0.5%;Octapharma,维也纳,奥地利)和烟酰胺(10毫米),称为迈阿密媒体。导致胰岛组织缺氧、文化菜被放置在一个模块化的孵化室(比卢普斯Rothenberg德尔,CA)和1%的天然气供应氧气,刷新公司5%₂,94% N₂20分钟。美国商会被放置在细胞培养孵化器。MIN6细胞,小鼠胰腺β细胞系(19),从宫崎骏博士(日本京都大学)培养RPMI中含有10%的边后卫(双子座Bioproducts,萨克拉门托,CA), 100年μg / mL链霉素(双子座Bioproducts), 100 U /毫升青霉素(双子座Bioproducts)和50μ米β巯基乙醇(BME;西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。自噬在MIN6细胞诱导培养他们在低血清(0.1%)血清中氨基酸剥夺人类胰岛。

2.2。细胞凋亡通路的基因表达分析

人类胰岛分离供体胰腺受到过氧化氢、过氧亚硝基,缺氧,或细胞因子(il - 1的结合β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ)。pathway-specific, pcr阵列(SABioscience,弗雷德里克,MD)进行确定一组基因的表达在细胞凋亡通路(列在表中1)。RNA样本DNase处理后转换为互补脱氧核糖核酸通过以下程序:1μ50 g的RNA是反向转录μL反应混合物的125 U Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶,20 U RNasin核糖核酸酶抑制剂,4毫米脱氧核苷三磷酸腺苷,MgCl 5毫米₂1 x PCR缓冲二世和0.5μg随机hexanucleotide引物(应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)。反应混合顺序是在65°C的环境中5分钟,60分钟42°C,逆转录反应被加热到95°C停止5分钟,冷却到4°C。实验的鸡尾酒是由增加102μL的稀释cDNA到1278μL的qPCR大师混合包含SYBR绿色(SA)生物科学,弗雷德里克,MD)和1173年μL H₂o . 25μL这个鸡尾酒添加到每个好96 -好包含84个基因的引物PCR阵列板凋亡通路,五个管家控制基因,和三个RNA和PCR质量控制。实时PCR进行7700年ABI棱镜序列检测器(应用生物系统公司,培育城市,CA)。10分钟的热循环条件1周期在95°C紧随其后40 15秒的周期在95°C和1分钟60°C。放大后,进行实时数据采集和分析通过数据分析门户网站(SA)生物科学)。数据分析是基于δCt方法和原始数据的归一化GAPDH按照制造商的手册。

2.3。RNA隔离和实时定量rt - pcr

总RNA分离胰岛治疗。DNAse治疗后,RNA完整性由毛细管电泳决定使用6000纳米LabChip RNA。选择基因的mRNA水平(BFAR, CARD8、CIDE-A BNIP3)中确定表达式分析前面描述的使用Taqman探针被实时定量rt - pcr检测。对需求分析(应用生物系统公司)是用于BNIP3。序列的引物和探针对其他目标如下:BFAR正向引物:GGAGGACATCGTCACCAAGC反向引物:AGTATTTGACCAGGAACTCTCTCCATaqMan调查:5′6 fam-tctggatcttaaggagcctacgtggaagca-tamra-3′CARD8正向引物:GACTTCCGGTCGCCATGAT反向引物:ACCATTGAAGATGGCCCAGATaqMan调查:5′6 fam-tgggcggtaaacgcggttagtgc-tamra-3′CIDE-A正向引物:TCTTTCAGACCTTGGGAGACAAC反向引物:TGGCTGCCCGGCATCTaqMan调查:5′6 fam-cgcatttcatgatcttggaaaaaggacaga-tamra-3′。

实时PCR反应是监测7700年ABI棱镜序列检测器(珀金埃尔默公司/应用生物系统公司)。放大后,进行实时数据采集和分析。

2.4。免疫印迹分析

MIN6细胞和人类胰岛暴露在压力条件用冰冷的PBS和哺乳动物细胞溶解蛋白质提取试剂(m /,皮尔斯,罗克福德,伊利诺斯州,美国)补充与磷酸酶抑制剂(20毫米的氟化钠,1毫米的冈田酸钠原钒酸盐和500海里)和蛋白酶抑制剂(σP8340)。溶菌产物在20800×g离心机,上层清液中的蛋白质浓度测定样品的染色方法(20.]。稀释样品含有等量的蛋白质混合2 X Laemmli样本缓冲区。蛋白质是解决SDS-polyacrylamide凝胶12%。后转移到PVDF膜(微孔,贝德福德,MA),这些墨迹被封锁与TBST(20毫米Tris-HCl (pH值7.9),8.5%氯化钠和0.1%渐变20)含5%脱脂奶粉在室温下(RT) 1 h和暴露于主要抗体(1:1000;细胞信号,丹弗斯,MA)在TBST含有5.0% BSA在一夜之间在4°C。屁股都洗TBST和anti-rabbit免疫球蛋白共轭,碱性磷酸酶(细胞信号)添加一个小时在rt,孵化后的碱性缓冲(10毫米Tris-HCl (pH值9.5),10毫米,MgCl氯化钠和1毫米₂),信号是CDP-Star试剂(新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA)和暴露于x射线胶片。乐队的强度是衡量使用Fluor-S多重图象和数量从Bio-Rad一个软件。

2.5。转染过程

bcl - 2启动子的活性(截断CRE网站−1640 - 1287)与萤火虫荧光素酶报告基因(由琳达拳击手,斯坦福大学医学院)被一个瞬态测量在培养MIN6细胞转染实验使用前面描述的过程[21]。质粒(2μ2000 g)和LipofectAMINE试剂(Invitrogen-Life技术,卡尔斯巴德,CA) (4μL)于100年分别稀释μL Opti-MEM我,在室温下混合,孵化了20分钟。一个既定的活跃renilla荧光素酶(pRL-TK-luc)包括对转染效率和非特异性荧光素酶活动的行为治疗方法。质粒的混合物添加MIN6细胞培养在12个好菜融合约70%。转染MIN6细胞培养在低血清(0.1%)中与适当的治疗。细胞治疗是与100年洗冷PBS和细胞溶解μL(记者裂解缓冲。溶菌产物是离心机(10600×g;20分钟)收集上层的。萤火虫荧光素酶的活动和renilla荧光素酶测定使用双荧光素酶检测设备(Promega,麦迪逊,WI)。这两个荧光素酶活动的比率作为衡量bcl - 2启动子的感应。

2.6。免疫细胞化学

MIN6细胞培养在Lab-Tek二室滑动系统;转染和治疗后,他们被固定在4%多聚甲醛30分钟rt与PBS洗涤后,固定细胞permeabilized PBS中含0.2% Triton x - 100和5% BSA为90分钟。抗体的存在的细胞被孵化主动caspase-9或主动caspase-3(1: 250)在3% BSA在4°C一夜之间,在PBS洗,并暴露于二次抗体与Cy3(杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林,宾夕法尼亚州,美国)在3% BSA 90分钟在PBS的rt,细胞被洗,密封的安装介质和检查数字反褶积显微镜使用蔡司显微镜装有库克SensiCam Axioplan 2^{量化宽松政策}高性能CCD相机。免疫细胞化学与小岛是由一个类似的过程,但悬挂的小岛。主要抗体稀释的1:2000胰岛素和1:500 LC3-II和磷酸化Akt。适当的二次抗体与Cy3或FITC 3% BSA。清洗步骤是由离心5分钟的500 RPM。最后一步后洗荧光标记在PBS小岛,他们悬浮在安装介质,放置在安全的密封杂交钱伯斯荧光显微镜。图片在多个z飞机通过数码显微镜反褶积和组装在一起。

统计分析是由单向方差分析(方差分析)与Dunnett多重比较检验。

3所示。结果

3.1。基因表达分析细胞凋亡通路在人类胰岛压力的

我们进行凋亡基因表达pathway-specific数组与RNA从人类胰岛分离暴露于氧化应激,缺氧和促炎细胞因子。基因在强调内在和外在途径诱导胰岛(表2)。例如,Fas、Fas配体和小道,外在途径的重要监管机构,是由氧化应激诱导(150 - 360%)和细胞因子。报价,联系通路诱导到150 - 270%。caspase-9 CARD8的表达,一种抑制剂,细胞凋亡的内在途径的标记,被氧化剂下调~ 50%,缺氧,细胞因子。Downregulation BRAF(60 - 73%)、一个关键信号激酶,表明这些小岛增长可能会减少响应factor-mediated细胞生存途径。凋亡的标志,Caspase-3激活蛋白水解乳沟。在这项研究中,我们还观察到表达caspase-3增加了所有的压力测试。CIDE-A导致DNA碎片被氧化应激诱导(140 - 280%)和缺氧。有趣的是,平行cytoprotective通路的激活对压力的反应很明显的几个基因的诱导凋亡通路包括Bcl2A1, c-IAP2 (BIRC3), A20, c-flip (CFLAR)。BNIP3,自噬的诱导物诱导160%和460%过氧亚硝基和缺氧。 Our findings from gene expression profiling points to the complex nature of cell death pathway in islets exposed to stresses associated with islet isolation and transplantation.

3.2。调制胰岛细胞凋亡通路的基因

CARD8,一些基因包括BFAR CIDE-A, BNIP3上市之前没有报道之前在胰岛细胞凋亡的背景下。因此,他们的感应是通过一个更加敏感的rt - pcr分析进一步证实了使用Taqman探针。BFAR(双官能凋亡调节器)是一种多区域蛋白,与成员的外在和内在的细胞凋亡通路,抑制细胞凋亡。成员CARD8 caspase-associated招聘领域(卡)的家庭,抑制caspase-9的激活。BFAR和CARD8水平下降了35 - 40%当暴露于氧化应激和50 - 70%,当在缺氧条件下孵化(图1)。细胞因子减少(30%)CARD8但不是BFAR的表达。CIDE-A的mRNA水平,还存在一种行为的下游基因调解DNA碎片,增加了95 - 180%小岛暴露于氧化应激时细胞因子没有任何影响基因的表达。BNIP3的表达起着重要的作用在线粒体自噬增加胰岛接触过氧亚硝基(92%)和低氧(240%)。

3.3。在MIN6细胞诱导自噬

自噬是一个self-digestive细胞产生能量的过程在饥饿和降解受损的蛋白质和细胞器。我们检查了MIN6细胞自噬通路通过免疫印迹分析在低血清培养条件。自噬体的形成是关键一步LC3的接合与磷脂酰乙醇胺(LC3-I-18 kD)形成LC3-PE (LC3-II-16 kD),自噬的一个重要标志。如图2(一个)的水平LC3-II海藻糖浓度增加而增加,尤其是在low-serum媒介。ATG4的水平,LAMP-2 UVRAG也以类似的方式增加。增加Beclin 1被认为只有在100毫米的海藻糖low-serum媒介。暴露的β细胞自噬抑制剂3-methyladenine马(3)减少LC3-II的形成在海藻糖的存在(图2 (b))而另一个抑制剂bafilomycin A1 (Bf)增加LC3-II的累积暴露后基底条件下以及海藻糖(图2 (b)在溶酶体降解后期步骤),因为它影响导致自噬小体的积累。此外,感应ER应激与thapsigargin衣霉素(Calbiochem拉霍亚,CA)导致形成LC3-II(图2 (c))表明这两个通路之间的串扰。

3.4。从低氧诱导自噬预处理保护人类胰岛细胞凋亡

氨基酸(AA)饥饿的人类胰岛孵化在汉克的平衡盐溶液诱导自噬β细胞所示(箭头)的点状的染色LC3-II insulin-positive细胞(图所示3(一个))。自噬可以保护在饥饿的情况下移植胰岛直到形成血管发生。然而,过度自噬通过相声是已知的导致细胞死亡和细胞凋亡。因此成为一个两难从治疗角度是否抑制或激活自噬在移植胰岛。测试策略调制自噬在缺氧,我们使用海藻糖,雷帕霉素和氨基酸饥饿在缺氧诱导物。当小岛被暴露于低氧在自噬诱导物的存在,有恶化细胞凋亡。激活caspase-3缺氧期间进一步增加海藻糖的存在(40 - 65%;),雷帕霉素(35%;)和盐溶液(115%;)(图3 (b))建议需要适度的自噬在缺氧。接下来我们尝试自噬预处理之前暴露于低氧作为备选战略。的筛选小分子(22)已经确定了自噬的诱导中,几种FDF-approved药物包括Niguldipine Penitrem A和三氟啦嗪。因此,我们筛选的化合物在不同浓度使用MIN6细胞在缺氧条件下培养。基于这些结果,我们测试了其中一些在人类胰岛在缺氧条件下预孵化紧随其后的是文化。重要的保护()诱导细胞凋亡被认为是所有的化合物(图进行测试3 (c))。Niguldipine显示,75%减少活跃裂解caspase-3 penitrem紧随其后的形式(55%)、三氟啦嗪(40%),和海藻糖(35%)。

3.5。凋亡的行为MnSOD和Exendin-4 MIN6细胞

MnSOD是一种抗氧化剂酶起着重要的作用在清除自由基生成的氧化应激。在cytokine-mediated确定氧化应激的作用β细胞凋亡,cDNA编码MnSOD-GFP嵌合蛋白过表达在MIN6细胞随后暴露在细胞因子(il - 1的混合物β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ)48 h。激活caspase-9,标记细胞凋亡的内在途径,激活半胱天冬酶3,一般细胞凋亡的标志,被immunofluorescent染色检查治疗的细胞。细胞因子诱导细胞凋亡的内在途径MIN6细胞染色如图所示的活动形式的caspase-9(图4(一))和caspase-3(图4 (b))与cy3(红色)。MnSOD-expressing绿色荧光细胞被发现。染色活跃caspase-9和3没有colocalize MnSOD-GFP-expressing细胞表明这些细胞免受细胞因子诱导的细胞凋亡。至少1000 GFP-expressing细胞检查每个实验。我们也测试了cytoprotective exendin-4, glucagon-like肽- (GLP-1)模拟,在MIN6细胞后诱导ER应激。暴露MIN6细胞thapsigargin衣霉素,ER应激诱导物,引起细胞凋亡所示由135 - 180% ()增加活跃caspase-3(图的水平4 (c))。预培养MIN6细胞exendin-4导致显著()保护与降低40% caspase-3的激活。

3.6。Cytokine-Generated磷脂质干扰Akt激活和分子

天然保湿因子所产生的细胞因子被降低一种蛋白激酶磷酸化(23]。Akt在磷酸化分子和激活中起着重要的作用,进而提高细胞生存(24]。因此,人类胰岛被暴露于10μM合成神经酰胺(C2)和活跃的一种蛋白激酶的磷酸化形式是immunofluorescently沾Cy3(红色)以及与FITC染色对胰岛素(绿色)。治疗C2降低导致一种蛋白激酶的活性形式(图的水平5(一个))。免疫印迹分析人类胰岛治疗C2和il - 1的结合β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ显示PCREB下降40 - 55%,活跃分子的磷酸化形式(图5 (b))。也有适度的减少()在分子水平cytokine-treated小岛。CRE-site包含bcl - 2启动子的活性也剂量依赖性地抑制了C2而不活跃的模拟(dh c - 2)并不影响记者活动(图5 (c))。我们以前bcl - 2启动子的差别报告了类似的对这些细胞因子(25]。因此合成神经酰胺模仿细胞因子的作用β细胞凋亡。

3.7。物通路的激活细胞因子发挥作用的差别在对这些bcl - 2启动子活动

细胞因子强烈刺激信号通路导致物激活。JNK-mediated激活的转录因子c-jun诱导相关基因来发挥了至关重要的作用β细胞(26]。细胞因子强烈的结合增加了活跃的磷酸化形式的物同功酶峰值激活()观察到30分钟(图6(一))。物总量保持不变的水平在6小时的潜伏期。激活物导致增加活跃c-jun的磷酸化形式。最大(370%)被激活1 h。c-jun的水平也增加了(110 - 235%)在6小时暴露在细胞因子是一个autoregulated基因。预培养物抑制剂导致显著()减少c-jun的磷酸化和c-jun的水平。SP600125也作用于上游激酶物,物本身的磷酸化是减少。bcl - 2启动子活性抑制时的组合物同功酶也表示(图6 (b))。细胞因子的差别进一步增强对这些基因bcl - 2启动子活动物同功酶而物抑制剂阻断细胞因子行动bcl - 2启动子(图6 (c))。

4所示。讨论

氧化应激中扮演重要角色β细胞死亡在糖尿病和移植胰岛。自噬是一种生理机制保护β细胞饥饿和缺氧的条件下。然而,过度自噬造成氧化应激可以导致β相声细胞死亡的凋亡途径。在这项研究中,我们报告的复杂调制在人类胰岛细胞凋亡通路基因暴露于氧化应激,缺氧,细胞因子表明之间的交互途径参与细胞死亡和细胞生存。我们证明自噬人类胰岛的预处理导致对抗低氧诱导细胞凋亡。诱导物的ER应激也发现激活自噬和凋亡β细胞。

Pathway-specific, pcr数组代表了一种新的方法来确定相关的基因家族的表达特定的通路。我们检查了人类胰岛细胞凋亡通路基因的表达受到多重压力与糖尿病有关,胰岛细胞分离和移植。我们观察到显著的基因的表达,参与反对细胞存活和细胞死亡的途径。同样重要的是,要提到四个基因,即BFAR CARD8, CIDE-A BNIP3,他们的角色β细胞凋亡并没有被报道。BFAR多区域蛋白,提高细胞生存与成员交流的外在和内在的细胞凋亡途径。Caspase-associated招聘域(卡)家族的蛋白质参与还存在的激活或抑制。CARD8抑制caspase-9的激活。BFAR和CARD8水平显著降低在小岛暴露于氧化应激和缺氧,建议减少凋亡小岛防御。CIDE-A的水平,还存在一种行为的下游基因调解DNA碎片,2 -增加到三倍小岛暴露于压力,建议后期的细胞凋亡。BNIP3的表达起着重要的作用在自噬通过扰乱Beclin - 1之间的交互和bcl - 2是由过氧亚硝基和缺氧。BNIP3促进线粒体自噬作为缺氧适应性反应(27]。

几项研究已经报道重要的细胞凋亡和自噬通路之间的相互作用12,28,29日]。细胞凋亡和自噬可以作为伙伴诱导细胞死亡。例如,死亡率蛋白激酶(DAPK)家庭成员,激活细胞因子,参与细胞死亡的凋亡和自噬(12]。接合的ATG5 ATG12自噬体的形成是一个重要的一步在基底自噬。然而,当有过度自噬,ATG5报道与组件交互的细胞凋亡途径。Calpain劈开ATG5生成截短形式的这种蛋白质把线粒体和诱导线粒体细胞色素c的释放激活内在途径。凋亡蛋白bcl - 2和Bcl-xL绑定和抑制Beclin 1-mediated自噬(30.]。这种交互结果的抑制自噬因为Beclin 1将无法绑定到第三类π3-kinase (VPS34)和UVRAG,启动自噬体形成的一个重要步骤。从本质上讲,bcl - 2自噬控制(图7)。我们之前已经证明了,bcl - 2水平受分子(25]。因此,条件下,差别分子对这些自噬可以特异表达的途径。此外,JNK1-mediated磷酸化的bcl - 2还导致的中断与Beclin 1,导致激活自噬的31日]。因此生理自我吞噬从而提高细胞生存时可以变得不受控制β细胞暴露于氧化应激和细胞因子。

自噬是有益的胰岛移植的设置,因为它清除细胞器受到氧化应激期间生成胰岛分离和饥饿(缺氧)期间提供能量。后立即移植,小岛暴露于缺氧由于延迟血管再生,导致营养物质的供给下降β在胰岛细胞核心。然而,我们没有观察到保护小岛当自噬被海藻糖诱导,雷帕霉素和盐溶液在缺氧(图3 (b))。接下来,我们尝试一个自噬预处理实验与其他新的抗病诱导剂的包容。确实有显著保护这些细胞暴露于低氧时激活caspase-3下降(图所示3 (c))。特别是,fda批准的药物包括niguldipine和penitrem显示显著的保护。小岛后立即隔离可能会显示自噬机制缺陷和可能会屈服于移植后低氧诱导细胞死亡。因此,需要恢复正常的自噬通路在培养的胰岛移植。胰岛移植领域目前的理解是,它是可取的文化小岛24 - 72 h自胰岛移植前可以恢复胰岛isolation-induced压力和免疫原性的降低。这种文化时期也可以用来评估和操纵自噬途径改善移植的结果。

胰β细胞特别容易受到氧化应激损伤由于底层抗氧化酶的表达(32,33]。氧化应激和细胞脆弱的标志(RBC)已被证明是高在1型糖尿病患者(非糖尿病患者的亲属34]。据报道,β细胞凋亡可以显著降低小鼠点头,一种自身免疫性糖尿病动物模型,经过政府的一个已知MnSOD模仿清除自由基(35]。促炎细胞因子诱导的表达通过NF -伊诺κB在伊诺和天然气网站启动子导致一氧化氮的生成(36]。当一氧化氮与过氧化物结合由巨噬细胞或细胞因子生成,剧毒生成过氧硝酸盐。几项研究已经表明,过氧硝酸盐是一种重要的细胞因子诱导的中介β细胞死亡在1型糖尿病37- - - - - -39]。此外,神经酰胺是细胞因子作用的介质之一。一种蛋白激酶的活性形式的减少天然保湿因子能干扰生长因子分子的行动。我们观察到过氧亚硝基和C2,合成神经酰胺,模拟细胞因子诱导的细胞凋亡途径(表1和图5)。

尽管分子抒发凋亡通路β细胞,其功能可以被其他转录因子在糖尿病受损。例如,物和其核目标,c-jun,已经被证明是介质β细胞死亡。JNK-activated c-jun诱导基因的表达跟压力(40]。细胞因子强烈刺激信号通路导致物激活(26]。Cell-permeable肽抑制剂细胞因子诱导物块β细胞死亡(41]。抑制物被认为是一个重要的策略来改善β细胞的生存。我们有报道称SP600125、物抑制剂,激活分子(42]。

ER压力是已知的与细胞凋亡和自噬的途径。例如,胰岛淀粉样多肽(IAPP)与和分泌胰岛素β细胞颗粒(43)引发β在培养的胰岛细胞凋亡和2型糖尿病44- - - - - -46]。ER应激通过IAPP聚集导致的主要机制β细胞凋亡(47,48]。沉默的IAPP siRNA提高培养人类的生存小岛(49]。ER应激也是一个强有力的自噬的诱导物50,51]。有人建议,自噬可能代表一种保护性细胞反应的条件下ER应激(52]。我们观察到LC3-II的形成,一个标记MIN6细胞后诱导自噬的ER应激与thapsigargin衣霉素(图2 (c))。ER应激诱导物也激活caspase-3由exendin-4显著降低,GLP-1模拟(图4 (c))。

这项研究中,我们表明,多重压力,产生在胰岛细胞分离和移植,诱导β编排细胞死亡的凋亡通路基因表达模式。虽然并行细胞生存途径也被激活,这是被压力诱导proapoptotic基因。自噬、生理cytoprotective通路与细胞凋亡时诱导胰岛移植在多余的设置。因此,需要多种方法来改善胰岛移植的结果。

确认

这项工作进行了使用丹佛VA医学中心的资源和设施。作者感谢集成胰岛分布程序和胰岛细胞资源中心提供人类的小岛。本研究支持绩效评估格兰特(neud - 004 - 07 - f)的退伍军人管理局,由美国糖尿病协会(1-06-JF-40) Pugazhenthi。