文摘

内质网(ER)是细胞信号转导的主要中介,并破坏其正常功能(一种机制称为ER应激)已经与一些疾病的发病机理有关。ER应激已经证明为糖尿病性视网膜病变(DR)的发病和进展归纳多种炎症信号通路。最近的研究已开始描述ER应激相关基因表达谱的基因博士;此外,基因对已确定博士发挥保护作用。 确定能够减少高葡萄糖条件下视网膜血管渗漏,从而保护视网膜细胞。它也发现了我们实验室ER-associated蛋白质降解因素表现出明显不同的表达模式持续高企的葡萄糖条件下大鼠视网膜。未来的研究基于这些集体基因的发现将有助于我们的整体的理解博士发病机理以及识别潜在的治疗靶点。

1。介绍

糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的并发症之一。糖尿病在全球各地的激增导致博士成为致盲的主要原因之一。早期临床表现包括细胞凋亡视网膜的周博士和眼部血管渗透性增加。因此,blood-retinal屏障的保护作用是分解,进一步导致微动脉瘤,渗出液,视网膜水肿,轻微出血。随着病情的发展,视网膜毛细血管结构变得如此不安,所有通常perfusable区域最终失去了(图1)。总的来说,这些最初的临床诊断为nonproliferative更改(NP)博士,和疾病被认为拥有先进(PDR)一旦血管再生增殖阶段受影响的地区开始。在这一点上,连续临床观察包括视网膜新生血管性扩散、玻璃体出血、视网膜脱离和失明。病人最终屈服于失明。有趣的是,视网膜水肿发展为包括黄斑,视网膜的中心区域,被认为是视力下降的主要根本原因。

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图1
眼底照片(a、c)和视网膜荧光血管造影(b, d)增生性糖尿病性视网膜病变患者。(a, b)和(c, d)是视网膜图像相同的部分。眼底照片显示广泛分散在视网膜斑点,代表微动脉瘤(白色星c)。此外,我们观察到黄斑中心凹反射消失了。黄白色渗出液明显在颞区域的黄斑(白色箭头),血管造影得到在动脉相(b)和已故的动静脉相(d),后注入染料肘前的静脉。观察视网膜新生血管形成血管毗邻地区nonperfusion d(白色箭头),多个小荧光点(d)白星微动脉瘤。血视网膜屏障破坏表现为新生血管性病变,发出荧光明亮而显得模糊的染料从血管腔泄漏(黑色箭头b)。

许多人口众多,多中心临床研究执行最重要的风险因素识别博士的发病和进展。看来糖尿病持续时间的特点,hyperglycaemic情节的严重性,高血压是直接关系到博士(1- - - - - -4]。许多pathoincidence博士理论的基础上提出了这些发现,但还没有导致一个有效的“金本位”预防或治疗策略。目前,首选临床治疗过程是小心维护的血糖和血压。事件的新血管形成和毛细管nonperfusion通常被部分视网膜光凝术和pan-retinal凝固,和黄斑水肿是由激光及玻璃体切除术治疗。在博士的最新阶段,视网膜复位手术。

尽管大量的调查工作,博士的pathoincidence并不完全理解。多元醇通路的研究成果有牵连的角色(醛糖reductase-mediated转化葡萄糖山梨糖醇)(5,6)、蛋白激酶C(已知的葡萄糖运输中介)7,8)、先进的糖化终端产品(年龄,形成从积累葡萄糖),和氧化应激(葡萄糖代谢的副产品)9,10]。此外,特异性免疫/炎症因素和angioincidence因素[11,12)的发生率和发展涉及博士(13- - - - - -18]。

博士的发病率也获得了临床遗传学家感兴趣的利益决定遗传博士明显可能导致的风险。事实上,许多DR-susceptibility基因发现了他们的努力(19- - - - - -21]。因此,博士被认为是遗传因素,进一步研究这种机制将促进我们总体的理解博士发病机制,帮助识别潜在目标genome-based疗法。

2。ER压力和博士

博士最近,潜在的分子机制的研究表明,内质网(ER)压力可能扮演了一个重要的角色在触发和维持疾病状态。新翻译的ER细胞器调和处理蛋白质,从综合运输和修改。ER压力是ER调整其功能的过程中,加速或减速内部机械有效应对动态条件下细胞的精确的需求。例如,细胞的蛋白质反应(UPR)行为来减少整体蛋白质合成速度,进而减少蛋白质组件进入急诊室。随后,ER的表达分子伴侣’是调节,蛋白质折叠功能是加速细胞恢复体内平衡。如果UPR变得太健壮或长时间(22- - - - - -25),三个ER应激因素诱导促进过程的平息。胰腺激酶——(PKR)像ER激酶(活跃),激活转录因子6 (ATF6)和肌醇需要酶1 (IRE1)法案通过绑定到关键ER蛋白质免疫球蛋白重链/ glucose-regulated蛋白质,分子量为78 kDa(毕普/ glucose-regulated蛋白78 (GRP78)) (26]。然而,毕普将使分离活跃,ATF6 IRE1积累的条件下展开或错误折叠的蛋白质在ER。这样的混乱后,发布活跃、ATF6 IRE1成为激活,启动(图相关的信号传输2)。


图2
ER应激,毕普分离的三跨膜介质,导致展开的蛋白质反应被激活。然后磷酸化eIF2释放的特权α,抑制新的蛋白质翻译和ATF4转录因子的诱导。ATF4反过来激活切基因表达,从而促进细胞凋亡,诱导生长逮捕和DNA damage-inducible基因34 (GADD34)。的GADD34磷酸酶脱去磷酸eIF2α,从而完成一个负面反馈循环。与此同时,释放IRE1发起XBP-1 mRNA的拼接。招聘的TNF receptor-associated factor3 (TRAF3)和细胞凋亡信号调节激酶1 (ASK1) IRE1导致激活c-Jun伴激酶(物),进而激活c-Jun和增殖蛋白激酶(MAPK)并最终促进切活动。释放ATF6由site-1蛋白酶裂解在高尔基体(S1P)和site 2蛋白酶(S2P)产生一个活跃转录因子片段称为ATF6-N,进而激活XBP1砍;此外,ER陪伴转录和蛋白二硫化物异构酶增加。

各种其他因素(超过200知道日期)参与ER应激的过程。这些因素被分成11个子类,根据他们的功能:展开蛋白质绑定,ER蛋白质折叠质量控制、调节胆固醇代谢,调节翻译,内质的reticulum-associated退化(ERAD),泛素化,转录因子、蛋白质折叠,蛋白二硫化物异构化、热休克蛋白(休克),和细胞凋亡27]。

Roybal等人在2004年发现,激活转录因子4 (ATF4),已被确定为一个重要因素的压力,能够直接增加表达血管内皮生长因子(VEGF)基因(28]。博士因为VEGF本身中发挥着重要作用,ER应激行为可能通过这个因素影响博士的发病机制事实上,Ikesugi等人表明,葡萄糖剥夺条件诱导ER应激在视网膜的周29日),支持认为ER应激参与发病率和忍足博士等人的发展也发现ER应激参与眼部血管异常在人类患者[博士30.,31日]。进一步试验研究糖尿病的动物模型和oxygen-induced视网膜病变(OIR),由Zhang et al .,证明了ER应激激活的影响视网膜和表明视网膜炎症的ER应激是一个潜在的中介(博士32]。作者也表明,ER应激预处理可以防止视网膜内皮炎症通过激活X-box-binding蛋白质(XBP) 1-mediated UPR和抑制NF -κB激活(33]。

ER应激是众所周知的引起感应对炎症的影响因素,和炎症博士被认为扮演至关重要的角色;因此,许多研究人员目前正在探索的影响ER博士强调通过炎症因素的行为(34]。我们实验室也注重博士的这一机制。

3所示。识别DR-Susceptibility和DR-Protective基因

遗传因素进行博士研究的大部分集中在患者(即先前存在的疾病。、糖尿病),复杂的发现真正DR-susceptibility基因。然而,已经清楚地观察到博士的发生和严重程度在糖尿病患者个体之间的不同。一些患者出现相对博士他们的糖尿病诊断后不久,当别人不博士发展了几十年。在同样的意义上,某些情况下博士是轻微的,而其他人则严重。攻击性和严重程度相关的博士一直在控制血糖水平或程度上失去控制,进一步表明遗传易感性的基础作用。因此,似乎有些糖尿病患者有一个固有的发展阻力博士并发症或能更好地限制其发病机理。

据估计,多达20%的病人患有糖尿病20年来保持自由的并发症(博士35]。因为没有药物可有效控制博士和减轻其进展,可以得出的结论是,一组特定的基因或基因的表达在这些DR-resistant有助于预防糖尿病患者/含有葡萄糖相关损伤视网膜血管。即使这些基因不保护病人免受博士在其整个生命周期中,他们可能会大大延迟发作或减少的严重程度博士因此,识别这些基因并获得详细了解其表达模式可能会导致博士会开发新的治疗靶点治疗。

在先前发表的研究基础上设计检测与疾病相关的基因状态(36,37),我们选择了一个队列的2型糖尿病患者( )与长期诊断(20年或更长)。这些患者被分为两组:博士不复杂的(正常)博士和复杂的基因表达分析是由微阵列(GeneChip人类基因组U133 + 2.0;Affymetrix,加州圣克拉拉,美国),在统计上有显著差异表达谱测定两组之间的比较分析。仔细分析了病人的人口导致排斥的22名患者正常组和37例PDR组。从剩下的患者,20人从每组中选出的,和静脉血样获得总RNA提取。每组6个病人的rna是优先选择进行基因芯片检测。我们发现,糖尿病患者无并发症出现173过表达基因(博士 ),相比PDR组(38]。这些微分表达式结果经定量PCR。

此后,这些173个基因的功能进行了分析,并发现46相关蛋白质降解和结构修改。此外,几个因素已知参与ER应激过程也被发现。因此,我们得出的结论是,这些基因被抑制在PDR患者可能代表基因对博士提供保护作用。

4所示。的作用 博士

的一个差异表达基因在我们的研究中non-DR糖尿病患者和糖尿病患者PRD-afflicted激起了我们的兴趣 。这个基因编码干扰素诱导的58 kDa抑制剂双链RNA-activated蛋白激酶(也称为DNAJC3)和是Hsp40家族的一员。第一个特点的活动作为抑制剂translation-mediator真核起始因子2的关键α(eIF2α)[39), 已经决心发挥重要作用在预防ER应激(40,41]。的机制 影响ER应激决心涉及抑制活跃激活(42,43),这表明 作为一个关键的中介cotranslocational ER蛋白质降解;此外,这一过程可能会导致ER在强调细胞内稳态。突变品系小鼠与 基因删除显示糖尿、高血糖和hypoinsulinemia [44),这表明 扮演重要角色在维持正常的血糖水平。 必须通过一个易位子进入内质网为了执行其蛋白质合成和折叠功能。有趣的是, 也可以防止多肽链进入ER易位子,从而减少ER和保护细胞的蛋白质加载应力状态(45,46]。多肽链被排除在急诊室时,由泛素系统退化。因此,据报道,ER应激实验可以诱导大鼠胰腺β细胞通过消除 因此,这些大鼠的胰岛细胞经历明显的细胞凋亡和患糖尿病47]。

我们是第一个调查的影响 博士在进行体外实验。人类视网膜毛细血管内皮细胞(HRCECs)是有文化的在体外和转染 overexpressing向量或 核糖核酸干扰(RNAi)抑制表达。正如所料, 表达显著增加细胞中转染腺相关病毒载体——(rAAV2) ( ),相比与pGIPZ -转染 RNAi ( )。 表达不不同控制转染细胞(rAAV2-GFP和pGIPZ-GFP)。ER应激在转染细胞诱导治疗衣霉素和表达的变化 测定,并与VEGF、核心/ emopamil-binding蛋白(C / EBP)同源蛋白(切),ATF4, GRP78。细胞凋亡水平也决定的 overexpressing细胞和抑制细胞。ER应激对基因表达在细胞overexpressing没有影响 ,没有ATF-4的表达水平的差异,GRP78,排骨和VEGF在轻控制细胞相比。然而,的抑制作用 在ER的表达与压力相关的因素在细胞转染pGIPZ——被压抑了 RNAi。细胞凋亡也发现显著增加细胞转染pGIPZ - RNAi而不是那些转染rAAV2 - (48]。

我们也调查的影响 过度的视网膜上有持续的高葡萄糖的老鼠。建立糖尿病模型大鼠腹腔内注射链脲霉素。过度的 是通过intravitreal注射纯化重组rAAV2 - 或转染培养大鼠视网膜毛细血管内皮细胞。视网膜血管通透性是由评估伊文思蓝视网膜渗漏。来表达下调 在培养大鼠视网膜毛细血管内皮细胞,pGIPZ RNAi是在这些细胞中引入的。实时逆转录(RT - PCR和免疫印迹分析评价信使rna和蛋白质的水平,分别剁碎,VEGF和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)。结果表明,糖尿病大鼠视网膜血管渗漏明显减少overexpressing ,而控制糖尿病大鼠。信使rna和蛋白质水平的排骨,TNF -α,VEGF是显著降低糖尿病大鼠的视网膜overexpressing 。在体外研究进一步表明,超表达 切的差别导致了对这些肿瘤坏死因子-α高葡萄糖条件下,VEGF基因表达,而RNAi镇压 增强的砍的表达、肿瘤坏死因子-α,VEGF (49]。

总的来说,这些研究表明 功能包括保护视网膜血管的完整性和抵制的开发和发展其关键作用稳定博士让我们假定内质网因素 有助于降低发病率的ER应激通过博士ER的维持稳定;这些研究正在进行中。尽管如此, 似乎是一个特别有前途的基因目标开发治疗预防博士。

我们组的研究和其他人正在继续调查的贡献全部的ER应激相关因素博士我们建立了一个高葡萄糖鼠模型,以观察这些ER的表达变化与压力相关的因素。同时,Ikesugi和同事和Roybal和他的同事们28,29日)报道,在早期阶段的高葡萄糖在老鼠VEGF的表达和切调节,但GRP78的表达和ATF4保持稳定。同样,动物实验结果一致与体外系统(50]。因此,研究确定哪些ER应激因素抵制博士和机制发挥了关键作用,他们感兴趣的临床行为。

最终需要全面了解ER应激相关因素的影响,为此,博士89年我们选择因素从整个面板的已知的ER应激相关因素代表每个11子类的函数在ER应激,(27),ER应激的相关研究的基础上,从文献[28,32,51- - - - - -69年]。定制的实时PCR芯片基于这些89个基因的老鼠序列设计(美国SABiosciences,马里兰州)和用于精确检测时间表达这些因素的变化在视网膜上的高葡萄糖老鼠。结果表明:13个基因,包括 基因,明显抑制在高葡萄糖鼠模型在1月。在三个月大高葡萄糖老鼠,12个基因表达下调(图3)。此外,我们发现ER应激的三个关键信号通路(活跃,IRE1和ATF6)没有激活的早期高葡萄糖在这些老鼠。这一现象与我们以前的研究结果是一致的(50]。根据我们的基因芯片的研究结果,在ERAD pathway-related因素是特别感兴趣的。的影响 和ERAD ER应激进行了讨论。首先,两个都有影响维持内质网的功能平衡和预防ER应激。 协调新展开的运输蛋白进入内质网(45),而ERAD降解展开内质网的蛋白质积累了。删除(处理)的蛋白从内质网防止ER应激是至关重要的,并且是更直接的控制机制比传输调制 。因此,我们认为过度ERAD-related因素在视网膜上可以提高ERAD信号通路更健壮的水平,防止高葡萄糖条件下ER应激和停止或减缓博士的进展。

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相关的功能差异表达ER应激相关因素在糖尿病视网膜(a)和(b)第三个月后开发的糖尿病(蛋白质的数量确定为每个函数表示)。表达水平测定RNA定量实时聚合酶链反应微阵列和正常的非糖尿病的老鼠相比;微分表达式指定如果基因检测在患病率较低的水平。

6。为未来的研究视角

就像研究上收集到的信息来识别疾病的易感性基因,disease-protective基因数据提供基础知识,我们对人类健康的理解是先进和有效的医疗策略开发。如果博士的病理机制是众所周知的“黑匣子”,然后定义博士的基因表达谱将代表一个窗口,通过它我们可以观察和评估它的内部情况。使用这个观点作为指导我们的研究,我们获得了重要的见解ER应激相关因素参与博士的发病和致病过程,发现了一种有前途的治疗博士的目标。

然而,像大多数疾病过程,博士涉及很多信号通路和生理的因素。相声和功能之间的交互肯定这些因素形成一个复杂和动态的网络结构。每个基因的特点是具有保护作用对有效博士代表单个节点在整个网络。因此,集体分析基因表达谱博士必须继续和增强研究理解临床(并发症)和nonphysiologic方面的影响(环境因素)。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号30872823和30872823)的中华人民共和国和同济医院新技术基础(批准号2010021)。