文摘

背景。血浆和尿D-lactate水平与糖尿病的存在。以前开发的技术显示一些局限性进一步评估D-lactate这个条件的生物标志物。方法。D -和L-lactate量化使用ultraperformance液相色谱串联质谱与标签内部标准。样本derivatized diacetyl-L-tartaric酸酐和C分离18列逆转阶段。D -和L-lactate的血浆和尿液进行分析控制,炎症性肠病(IBD)患者,患者2型糖尿病(T2DM)病人体内。结果。定量分析D -和L-lactate取得了成功。校准曲线是线性的( 生理和病理生理学范围)。尿液和血浆的复苏在96%和113%之间。国际米兰——intra-assay变化在2%和9%之间。检测D-lactate和L-lactate等离子体的极限是0.7 mol / L和0.2 分别mol / L。检测的局限性D-lactate和尿液中L-lactate 8.1 nmol /更易与肌酐和4.4 nmol /更易与肌酐,分别。血浆和尿D -和L-lactate增加IBD患者和2型糖尿病与控制。结论。提出的方法被证明是适合的量化D -和L-lactate并打开的可能性探索D-lactate作为生物标志物的使用。

1。介绍

有几个条件D-lactate会增加在人体血液和尿液1]。最近的研究表明增加D-lactate水平在糖尿病和感染、缺血,和创伤,暗示D-lactate作为生物标志物的使用。然而,进一步探索使用D-lactate作为生物标志物等,有必要分析D-lactate的一种改进方法。

乳酸有两个光学异构体,L-lactate和D-lactate(图1 (b))。L-lactate是最丰富的乳酸对映体。它主要形成在无氧糖酵解由丙酮酸转换成L-lactate乳酸脱氢酶(2]。D-lactate通常被视为nonphysiological对应L-lactate [1]。在生理条件下,D-lactate的浓度低100倍相比,L-lactate [3]。D-lactate在人类起源的新陈代谢被认为是来自两个主要来源,也就是说,由乙二醛酶降解甲基乙二醛到D-lactate通路由肠道细菌和生产。事实上,干扰在这些代谢途径与水平的提高D-lactate [3- - - - - -7]。尽管一些酶代谢的能力描述了D-lactate [8),其新陈代谢非常低效,D-lactate尿液中主要是(1]。

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图1
色谱的D -并代表L-lactic酸衍生品(一)。(一)内部标准(13C3-L-lactate色谱(435μmol / L, 72 pmol)。(b)代表的标准溶液色谱图D -和L-Lactate (351μ58.2 mol / L, pmol, 501年μ83.0 mol / L, pmol resp。)和分子结构的光学异构体L -和D-lactates。(c)代表色谱尿样(D -和L-Lactate;14.1μ74.6 mol / L, 2.3 pmol,μ12.4 mol / L, pmol,职责)。(d)代表血浆样品的色谱图(d -和L-Lactate;11.2μ1375.0 mol / L, 1.9 pmol,μ227.7 mol / L, pmol,职责)。(一)注入量:2μl

甲基乙二醛是一种高活性化合物形成过程中糖酵解和脂质过氧化作用。甲基乙二醛是增加糖尿病和晚期糖基化终末产物的主要前体形成(9]。甲基乙二醛是由乙二醛酶系统退化导致D-Lactate。D-lactate血浆和尿液中已被证明是提高糖尿病患者(3,7]。D-lactate可以用作甲基乙二醛和更容易测量的反射比活性甲基乙二醛。

在结肠,许多共生的细菌产生D-lactate由于厌氧糖酵解。在生理情况下,这个D-lactate进一步共生的细菌代谢的醋酸。因此,D-lactate产生的肠道不显著贡献水平的D-lactate体循环生理情况下(10]。然而,在病理条件下,系统性D-lactate水平可能上升由于肠道被细菌生产。溃疡性结肠炎患者肠道缺血,阑尾炎,水平的提高D-lactate确实被证明(4- - - - - -6]。最极端的例子,受损的肠道通透性和细菌过度生长短肠综合征,这是与D-lactate酸中毒(10]。

到目前为止,D -和L-Lactate已经被几个不同的分析技术包括液相色谱的手性固定相之间使用紫外线或荧光检测3,11- - - - - -15),酶化验(7,16- - - - - -21),气相色谱质谱(GC / MS)方法(22,23),液相色谱质谱(LC / MS)方法(24,25使用荧光检测,反相液相色谱(26]。然而,这些技术有一些缺点如低灵敏度11,24,27),大样本体积(19,21,22),复杂的色谱系统(3,12,13长时间运行],[3,11,26,27]。进一步探索D-lactate作为生物标志物的使用,有必要分析D-lactate的一种改进方法。

在本文中,我们描述了一个高度敏感的,具体的和快速ultraperformance液相色谱串联质谱(UPLC) (MS / MS)方法分析D -和L-Lactate血浆和尿液中不需要手性固定相。我们取得了显著改善在文献中描述的方法和获得一个强大的工具来分析D -和L-Lactate大型研究。通过这种方法,我们测量血浆和尿液浓度的D -和L-Lactate控制,炎症性肠病(IBD)患者,患者2型糖尿病(T2DM)病人体内。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

L(+)乳酸(98%)和二氯甲烷(≥99.9%)从Sigma-Aldrich获得。氨溶液(25%)和无水乙酸(100%)从默克公司获得。甲酸(每年),(+)- O, O′-diacetyl-L-tartaric酐(≥97%)(DATAN)和锂D-lactate(≥99%)得到的丙烯酰胺。水和乙腈(ULC-MS年级)从Biosolve获得。(13C3]钠L-lactate(20%,在水中w / w)是来自剑桥同位素实验室。

2.2。色谱条件

样本分析反相LC-tandem女士使用Acquity UPLC本·C18分析柱(100×2.1毫米,1.7μ米,水域)。检测进行了使用Xevo TQ串联质谱仪(水),这是在消极multiple-reaction-monitoring (MRM)模式。UPLC分析使用二进制流的梯度0.5毫升/分钟使用一个Acquity UPLC(水域)。溶剂是1.5毫米甲酸铵(pH = 3.6),乙腈溶剂B。线性梯度是在99.5%的溶剂,在3分钟内改为97%溶剂A .清洗后列有40%溶剂B在2分钟,1分钟列是平衡的初始成分。注入体积是2μL,列温度是31°C。样本保持在6°C。色谱是获取和处理Masslynx V4.1 SCN 644(水)。

2.3。质谱条件

MRM的转换,优化使用直接注入D-lactate (500μmol / L), (13C3]-L-Lactate (400μmol / L),和L-lactate (1000μmol / L)标准溶液到串联20 MS的流μL / min。最优条件所有的父母都被发现在毛细管电压1.5 kV,锥10 V的电压。源和反溶剂温度是150和450°C,分别。锥气体流和反溶剂气体流0和800 l /小时,分别。建立最敏感的女儿离子碰撞能量被设定为8电动车碰撞气体流量为0.15毫升/分钟。表1显示了MRM优化设置。

表1
MRM设置。
2.4。血浆和尿液样本

三组被选为D -和L-Lactate测量。个人和非糖尿病患者糖尿病控制性别和年龄子集招募的队列研究糖尿病和动脉粥样硬化在马斯特里赫特(CODAM)。这些科目的特点详细描述其他地方(28]。简而言之,对照组( )是 岁,46%的女性,和的糖化血红蛋白 %的空腹血浆葡萄糖 更易与L。组2,二型糖尿病患者( ),是 岁,39%的女性,和的糖化血红蛋白 %和空腹血糖 更易与L。组3包括IBD患者在缓解期:32血浆样品( 年,44%女性)和34尿液样本( 年,59%的女性)。这些样本都来自《马斯特里赫特大学医学中心的门诊。

女士的比较提出了UPLC串联法与酶的方法,分析了等离子体和尿D-lactate,有两种方法,在大鼠样本。详细介绍了这些动物在其他地方(29日]。

2.5。血浆样品制备

到25μ434.75 L的内部标准溶液(包含μmol / L (13C3]-L-lactate) 25μL(等离子体是补充道。与600年样本混合彻底,随后脱去蛋白质μL(甲醇的混合物:乙腈(1:1,按体积)和离心机在室温下在10分钟14000 rpm。上层清液是用移液器吸取到反应瓶和蒸发干燥下温柔的氮气流的温度50°C。50毫升的新鲜DATAN(50毫克/毫升二氯甲烷:乙酸(卷)4:1)增加了。瓶封顶,漩涡,加热30分钟的75°C。30分钟后,瓶被允许冷却到室温,混合物被蒸发干燥和温柔的氮。与150年derivatized残留物被重组μL乙腈:水(1:2,按体积)。

2.6。尿液样品制备

25毫升的内部标准溶液(包含434.75μmol / L (13C3]-L-lactate), 25岁μL尿,和300年μL甲醇用移液器吸取到反应瓶。样本混合彻底和蒸发干燥下温柔的氮气流的温度50°C。50毫升的新鲜DATAN(50毫克/毫升二氯甲烷:乙酸(卷)4:1)增加了。瓶封顶,漩涡,加热30分钟的75°C。30分钟后,瓶被允许冷却到室温,混合物被蒸发干燥和温柔的氮。与300年derivatized残留物被重组μL乙腈:水(1:2,按体积)。

2.7。方法验证

线性检测D -和L-Lactate测试在水中和矩阵通过添加D -和L-Lactate标准在准备水和血浆或尿液样品(表2)。校准曲线线性回归得到的一块被分析物的浓度 与分析物的峰面积比值/内部标准 。为分析物,13C3]-L-lactate作为内部标准。

表2
在不同的矩阵线性测试。

检测的下限是由计算浓度六信噪比(s / N: 6日注入量:2μL)。

对恢复实验,D -和L-Lactate的标准解决方案添加到尿液或等离子体,随后准备如样品制备部分所述。

intra-assay变异的方法确定在两个不同的血浆和尿液样本( )分析了一批在一天。interassay变异的方法确定在两个不同的血浆和尿液样本分为批次和分析了在10个不同的日子。

冻融稳定性测试在两个不同的血浆和尿液样本snap-freezing这些样品在液氮和解冻5后续周期。

调查血浆和尿液样本的稳定性,存储在autosampler 6°C,复制注射两种不同血浆和尿液样本期间每小时24小时完成。

2.8。测定空腹血糖、糖化血红蛋白和尿肌酐

后一夜快,血浆葡萄糖浓度与己糖激酶(更易/ L)测定glucose-6磷酸脱氢酶方法(ABX诊断、蒙彼利埃、法国)。糖化血红蛋白(%)是由离子交换高效液相色谱法(HPLC) (Bio-Rad Veenendaal,荷兰)。空腹血浆葡萄糖浓度和糖化血红蛋白测定在CODAM参与者。

尿D -和L-Lactate浓度被表示为μ摩尔/更易与肌酐。尿肌酐浓度进行了分析使用贝克曼LX20分析器(贝克曼库尔特)基于Jaffe反应方法(30.]。

2.9。D-Lactate酶测定

enzymatic-spectrophotometric方法比较的方法,基于氧化D-lactate NAD丙酮酸+使用的细菌D-lactate氢化酶,(21]。

2.10。统计分析

方法验证数据被表示为平均值和标准偏差(SD)。研究酶之间的协议和女士UPLC串联的方法,我们使用线性回归和Bland-Altman日志正常化后大鼠尿样的阴谋。限制的协议被定义为SD的2倍。病人研究数据被表示为均值和标准平均误差(SEM)。检测组差异,我们应用方差分析与事后Bonferroni调整(方差分析)。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。反相色谱法

D -和L-Lactate DATAN衍生品产生反相上的基线分离UPLC列保留时间为2.7分钟D-lactate L-Lactate和2.5分钟。代表性的色谱图如图1。

3.2。D -和L-Lactate的稳定

5冻融循环后没有观察D -和L-Lactate水平的变化,在两个不同的等离子体测试和尿液样本(数据没有显示)。

使大量的测量在一个可能的运行,我们测试了D -稳定的L-Lactate当样本存储在自我注射器在6°C。D -和L-Lactate至少24小时稳定,和没有退化复制注射后观察到两个不同的等离子体和尿液样本(数据没有显示)。

3.3。线性度,降低检测极限、复苏和精度

线性检测D -和L-Lactate测试矩阵和水。等离子体、斜率测试三种不同的等离子体样品和在水中测量在不同的日子, % (D-lactate意味着±CV %), % L-lactate(表2)。尿,斜率,在三个不同的尿液样本进行测试,在水中测量在不同的日子, % D-lactate和 % L-lactate(表2)。检测D-lactate和L-lactate等离子体的极限是0.65μ0.2 mol / L (108 fmol)和μ分别mol / L (33 fmol)。尿液检测的局限性D-lactate和L-lactate 8.1 nmol /更易与肌酐(40 fmol)和4.4 nmol /更易与肌酐(22 fmol);分别。

我们发现经济复苏,尿液和等离子体,在96%和113%之间(表3)。验证数据证明了国米和intra-assay变化在2%和9%之间(表4)。

表3
血浆和尿液的恢复数据。
表4
精度数据D -和L-Lactate血浆和尿液。
3.4。女士比较UPLC串联的方法与酶反应

我们比较了UPLC-tandem女士与酶的测定方法,通过分析等离子体和D-lactate水平与这两种方法在大鼠尿液。然而,由于等离子体D-lactate水平低,不可能与酶化验分析这些样本(数据没有显示)。尿,导致数据的线性回归方程 = 1.08 (+ 50.795,与优秀的相关性 两国技术(图)2(一个))。然而,平淡的奥特曼情节表明,尽管这两种技术在更高的范围是在良好的协议,在较低的范围内体谅地更高的测量值与酶技术相比UPLC串联女士(图方法2 (b))。

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图2
在鼠尿尿比较D-lactate衡量UPLC串联女士和酶的方法。(a)相关性D-lactate水平衡量UPLC串联女士和酶的方法。(b) Bland-Altman块对数转换D-lactate水平以UPLC串联女士和酶的方法。
3.5。比较之间的尿和血浆D - L-Lactate浓度控制,二型糖尿病患者,患有炎症性肠病

我们接下来研究了D -和L-Lactate非糖尿病患者的血浆和尿液浓度控制,炎症性肠病的患者,2型糖尿病患者(图3)。在健康对照组,D -和L-Lactate浓度分别为8.0±0.6 μmol / L的等离子体,分别 和 μ摩尔/更易与尿肌酐,分别(均值±SEM)。在IBD患者中,D -和L-Lactate水平高,与非糖尿病患者相比对照组血浆( 和 μmol / L, resp)和尿液(3.1±0.8,11.8±1.4μ摩尔/更易与肌酐、职责),这是尿L-lactate显著。

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图3
尿液和血浆D -和L-Lactate浓度的控制,炎症性肠病(IBD)患者,患者2型糖尿病(T2DM)病人体内的病人。数据提出了均值±SEM:(* )。

在2型糖尿病患者中,D -的浓度和L-Lactate明显高于在等离子体( 和 μmol / L, resp)和尿液( 和 μ摩尔/更易与肌酐、职责)。血浆和尿D-lactate水平,决定在2型糖尿病和控制,与糖化血红蛋白( , 和 , 、职责)和空腹血糖( , 和 、职责)。

4所示。讨论

我们在这里描述快速、敏感和非常具体的方法同时测定血浆和尿液的D -和L-Lactate UPLC MS / MS。的derivatisation D -和L-Lactate DATAN可以单独的两个对映体在reversed-phase-based分析列。这导致一个健壮的色谱系统无需column-switching或固相萃取(SPE) presample清理。我们发现尿和等离子体水平的D -和L-Lactate显著增加2型糖尿病与非糖尿病患者相比控制。另外,我们观察到更高的L -和D-Lactate水平IBD患者,但只对尿L-lactate显著。

有许多其他的方法来量化D - L-Lactate,与几个缺点,如长时间运行(3,11,26,27),大样本体积(19,21,22,24,27),一个column-switching preseparation技术(3,12,13],或低敏感性[11,24,27]。此外,酶方法的一个缺点是,它是不可能衡量D -和L-Lactate在单个运行。

手性固定相液相色谱已申请对映体的分离D -和L-Lactate11,14,25]。SPE或者义务为prereversed相液相色谱分离手性色谱性能好(3,12,13,31日]。此外,寿命越短,成本较高,很难选择一个合适的手性柱(32,33)对映体分离的一种备选方法可取的。最近,Cevasco et al。26)用反相液相色谱方法D -和L-lactic酸的分离。但是,每次运行的时间35分钟,义务SPE样品制备步骤使这种方法不太可行的大型队列研究。此外,使用derivatisation试剂没有商业化,在使用前必须合成。

酒石酸酐是成功地用作手性羟基酸derivatisation试剂和其他对映体化合物(34- - - - - -36]。在本文中,我们描述了derivatisation旋光异构体的D -和DATAN L-Lactate。这derivatisation步骤的结果在一个高度敏感的和特定的D -和L-Lactate导数基线分离在UPLC反相柱和检测串联女士这种技术的优势,比文献中所描述的方法,是不需要样本清理或preseparation样本矩阵,只有25岁μ我的样品是必要的。也这些DATAN衍生品的高效和特定的碎片碰撞中生成细胞是一种改进的nonderivatized分析D -和L-Lactate LC / MS (25]。每次运行时间6分钟我们建立了一个快速、可靠的方法适用于测定D -和L-Lactate大型队列研究。

我们测量的D -和L-Lactate浓度从健康对照组血浆和尿液中合理的协议与其他技术获得的数据3,18,19,25]。事实上,我们发现一个可以接受的相关新UPLC串联法与酶法测定尿样女士。然而,酶反应不充分敏感D-lactate的较低水平,作为反映在Bland-Altman阴谋。酶的方法措施D-lactate水平高于UPLC串联女士在较低的范围内。

D-lactate并不显著增加在IBD患者与非糖尿病患者相比控制在血浆和尿液。然而,另一项研究中,发现了显著增加D-lactate在活跃的IBD患者住院6]。这种差异可能是由于这一事实我们包括在缓解的病人。此外,由于样本量相对较小,检测统计差异很低的权力。

我们发现了一个显著增加尿液和血浆D -和L-Lactate在2型糖尿病与非糖尿病患者相比控制。这一事实D-lactate和L-lactate都是二型糖尿病患者的增加表明hyperglycaemic状态是D-lactate海拔在糖尿病的一个重要来源。L-lactate主要形成在糖酵解L-lactate丙酮酸,乳酸脱氢酶的转换。D-lactate的成品甲基乙二醛的新陈代谢,在高血糖症形成,由乙二醛酶通路(37]。符合这一点,我们证明D-lactate与糖化血红蛋白有显著的相关性,长期高血糖症的标志。然而,根据我们的研究,我们不能肯定结论D-lactate是否仅仅是反映了甲基乙二醛,肠道菌群,或两者兼而有之,几种可能的残余混杂因素如BMI和肠道通透性可以解释我们观察我们的病人组之间的差异。

甲基乙二醛生产少量的碳水化合物,脂肪和蛋白质的新陈代谢。已经证明,丙酮醛是最重要的前体在晚期糖基化终末产物的形成。甲基乙二醛和methylglyoxal-derived先进的糖化成品被认为是与糖尿病血管并发症的发展。因为D-lactate升高糖尿病和甲基乙二醛的可能作为指标,测量D-lactate需要评估与D-lactate群组研究可能成为预测糖尿病并发症。此外,还需要机械的研究来阐明一些代谢途径的相对贡献总尿和等离子D-lactate池,在健康和糖尿病人。

总之,这个特定的测量的D -和L-Lactate节目承诺调查糖尿病和代谢疾病。

缩写

CTMM: 分子医学中心的转化
炎症性肠病: 炎症性肠病
2型糖尿病: 2型糖尿病
GC / MS: 气相色谱质谱分析
LC / MS: 液相色谱质谱
UPLC: Ultraperformance液相色谱
女士/小姐: 串联质谱
DATAN: (+)- O, O ' -diacetyl-L-tartaric酸酐
MRM Multiple-reaction-monitoring
扫描电镜 平均数标准误差
方差分析 方差分析
SPE 固相萃取。

确认

本研究的框架内执行CTMM,平移分子医学中心(http://www.ctmm.nl/)、项目PREDICCt(格兰特01 c - 104),并在荷兰心脏基金会的支持下,荷兰糖尿病研究基金会和荷兰肾脏基金会。