文摘
小分子核糖核酸(microrna)是小非编码rna作为监管机构针对成熟的信使rna的基因表达。初步报告后在血清microrna的存在和等离子体的研究已经成功地演示了使用这些microrna疾病的生物标记物。目前,有很多隔离液体样品的总RNA的方法。在这里,我们描述一个简单,成本有效的方法提取的RNA从人类血清microrna以及后续的实时PCR分析水平。
1。介绍
小分子核糖核酸(microrna)是小非编码rna的基因表达,作为监管机构针对成熟信使rna (mrna)。最近,microrna的被发现在血清和血浆,它似乎是相对稳定(1]。这个初始报告以来,已经有一些研究microrna的表达在血清或血浆在各种癌症等疾病(2)、心血管疾病(3],杜氏肌萎缩症和肌肉疾病如[4]。microrna的隔离的方法,以及用于检查的技术表达,在这些研究中不同。在这里,我们提供一个协议隔离的RNA从血清和随后的microrna的表达水平确定使用TaqMan-based实时PCR检测。这个过程,从孤立的RNA实时PCR数据采集,需要8个小时左右。
2。材料
2.1。试剂
使用的材料如下:氯仿(Labserv猫# CL728)。乙醇(Labserv猫# BSPE6975);准备75%乙醇(v / v)在nuclease-free水稀释100%乙醇;我们建议做新鲜的乙醇溶液每次协议执行。糖原分子生物学(年级)(σ,猫# G1767) (20μ克/μL)。Nuclease-free水(试剂盒,猫# 129117)。异丙醇。Taqman快速普遍掌握混合(2 x)(生命技术猫# 4366073)。Taqman microRNA化验(生活技术,不同)。miRNA-specific RT引物和TaqMan probe-primer提供混合在一起作为一个microrna的个人分析。TaqMan microrna逆转录工具包(生命技术4366597)。工具包包括10 x RT缓冲区, 核苷酸,核糖核酸酶抑制剂( ),multiscribe RT酶 ;这种酶必须保持−20°C。TriReagent (Ambion AM9738)。
2.2。设备
光学胶膜PCR(应用生物系统公司,猫# 4311971)。离心机,冷藏(转子为1.5毫升管,例如,贺利氏壁画)。离心机、冷冻(96 -孔板和转子和15毫升管,例如,贺利氏Multifuge X1)。冰。Micropipettor和过滤技巧。微型板块(96 -半裙,Axygen猫# pcr - 96 m2 - hs - c)。微安快速光学反应96孔板(应用生物系统公司的猫# 4346906)。实时PCR系统(7900 HT快速实时PCR系统;应用生物系统公司的猫# 4351405)。管、微型离心机(1.5毫升和2毫升)。旋涡混合器。8毫升血浆分离器血栓活化剂vacuette猫格林尼(# 455078)。21-gauge按钮采血针套(BD猫# 367344)。
3所示。方法
3.1。样品收集
是很重要的,收集样本按照适当的伦理准则。(1)收集血液样本使用21-gauge按钮采血针集到8毫升血浆分离器血栓活化剂vacuettes。(2)转化管五次允许30分钟凝固。(3)离心管10分钟1000 - 1300 g斗摆动转子。(4)去除血清管和整除的到500年μL卷1.5毫升微型离心机管。
血清可以立即使用或可以冻结在−80°C,以供将来使用。
3.2。RNA隔离
(5)转移400μ血清L为2毫升微型离心机管。(6)加1毫升三试剂管。增加三试剂血清后,黄色的小球出现在解决方案。这些消散后涡流和孵化,不干扰下游加工。(7)加1μL (1μ每个管g / uL) nuclease-free糖原。涡,持续20秒。在室温下培养10分钟(8)增加200μL氯仿的每个管和动摇20秒。这样可以确保适当的混合的氯仿和三试剂后立即补充。在这个阶段不应该涡管。由于处理的时间参与每个阶段我们建议最多12管被处理一次。(9)在室温下孵化15分钟(10)离心机在12000克15分钟在4°C(11)转移800μL上层水相的一个新的2毫升微型离心机管。将会有大量的白色物质在水溶液和有机层的接口。800年切除μL水层,将会有剩余剩余水相。(12)添加1.2毫升每个管异丙醇μL卷。涡为5秒。在这个阶段管会很满了。(13)在室温下培养10分钟。(14)离心机在12000 g 8分钟4°C。同时颗粒应该是可见的,它仍然是重要的东方在离心管,这样的铰链盖脸的外缘离心机。(15)小心吸入将吸管的浮层提示沿墙对面的微型离心机管的铰链(因此颗粒)。由于大量的液体需要删除它可能会小心翼翼地提示出管的内容。(16)1毫升75%乙醇添加到每个管和转化管5次(17)离心机在7500 g在室温下5分钟。再次,在离心管在同一方向。(18)仔细去除上层清液(11)中描述的步骤。为了确保尽可能多的乙醇的删除顺序可能需要减少使用的吸管尖的大小。(19)使管子在室温下晾干5分钟。(20)加20μL (nuclease-free水每个管和resuspend颗粒彻底。总是在这个阶段后存储RNA在冰上。(21)测量的总RNA浓度使用NanoDrop nd - 1000。我们发现,260/280的比例通常是约1.3。这似乎并没有影响下游处理或数据生成。
RNA获得使用上述协议用于miRNA-specific逆转录。剩余的RNA可以存储在−80°C。
3.3。miRNA-Specific逆转录
为便于处理,我们建议进行逆转录8-well 0.2毫升带管或96 -薄壁PCR板。(22)10 ng的RNA反向转录每个microrna的底漆。计算所需的RNA体积提供10 ng最终浓度/底漆在出错的情况下添加一个额外的反应。加nuclease-free水体积1.67μL /管。(23)解冻10 x RT缓冲、核糖核酸酶抑制剂和100 nM核苷酸(TaqMan小分子核糖核酸逆转录工具包中提供)冰。multiscribe逆转录酶必须留在−20°C,直到需要。(24)准备掌握混合通过添加上述试剂按照计算表所示1。计算每个microrna和12血清样本所示。总反应体积是5μl . 0.5反应的一个错误是纳入计算。主人必须由粉状混合和应该保持在冰上。(25)增加2.33μL RT大师的混合和1μL miRNA-specific底漆的,然后添加1.67μL所有井的RNA。所有添加必须在冰上。(26)涡流和旋转的RNA和掌握混合完全混合。(27)逆转录使用BioRad DNA引擎进行下面的程序(1)16°C为30分钟(2)30分钟42°C(3)5分钟85°C(4)4°C。
3.4。实时PCR microrna
(28)解冻assay-on-demand (AOD)冰。准备主为每个目标microrna的混合检测按照计算表所示2。这些计算是基于12个样品和一个错误的反应包括在计算中。总反应体积是5μ信用证。(29)为每个目标microrna,添加4.2μL的特定主组合每个0.1毫升的剔透的PCR板,紧随其后的是0.8μL的cDNA准备使用miR-specific RT引物在步骤(27)。覆盖板的光学清晰的电影。重要的是要确保井周围的边缘板是完全密封的,因为他们更容易蒸发。(30)离心机的板3500 rpm 5分钟,以确保所有内容的底部和所有气泡已经被取消了。(31)把板在7900年HT快速实时PCR机并运行它在快速模式中使用下面的程序阶段1:95°C,持续20秒第二阶段:40的周期95°C为1秒,60°C,持续20秒。
板是在扩展阅读阶段2的步骤。获得的数据的一个例子是图所示1和2。
