小道和DcR1表达式不同监管STZ -与胰岛细胞的老鼠CY-Applied点头

文摘

TNF-related凋亡诱导配体(TRAIL)是一种免疫系统的重要组成部分。虽然承认,它也有一个重要的角色在1型糖尿病(近年来发展,这显然假定作用尚未透露。链脲霉素(STZ)和环磷酰胺(CY)是近年来常用的代理机构或加速疾病实验模型,包括非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。尽管这种疾病模型非常适合于糖尿病的研究,不同的表达模式为各种T1D-related分子可能预期,取决于应用代理的作用机理。我们加速糖尿病女性点头老鼠使用STZ或CY,配体和受体的表达谱分析在疾病发展。小道配体表达遵循着一个完全不同的模式在STZ -与CY-accelerated疾病,前者显示显著增加,而出现在后者降低水平。诱饵受体1 (DcR1)表达也显著增加STZ-induced胰岛细胞的疾病。具体增加观察到配体和DcR1表达式可以防御策略的一部分β胰岛浸润白细胞,而immune-suppressive剂CY可能一定程度上抑制这种防御,进一步造成糖尿病的发展。

1。介绍

1型糖尿病(近年来选择性的结果自体免疫破坏胰腺β胰岛的浸润炎症细胞(1,2]。各种分子之间在发病的作用,最近定义肿瘤坏死因子(TNF)——相关凋亡诱导配体(TRAIL)拥有一个独特的位置。有证据表明破坏性和特别保护角色小道内转至与tnf家族其他成员不同,这主要是出名的破坏性影响胰腺β细胞(3- - - - - -7]。小路是一种2型膜蛋白能够与四个不同的膜受体和可溶性osteoprotegerin受体在人类身上。的跨膜受体,TRAIL-R1 (DR4)和TRAIL-R2 (DR5)作为死亡受体,而他们也可以激活核因子NF -κB通路(8- - - - - -10]。TRAIL-R3 (DcR1)和TRAIL-R4 (DcR2)被称为诱饵受体不引发细胞凋亡的能力,但可能激活NF -κB (11]。在老鼠身上,另一方面,只有三个TRAIL受体膜已定义,其中一个是死亡受体和显示了伟大的同源性与人类DR5 [10]。另外两个是诱饵受体胞内域。

小道的确切作用及其受体在近年来的发展还有待确定。阻塞的轨迹与可溶性TRAIL受体功能显示加速糖尿病在点头老鼠研究[3]。也提出了同样的研究,TRAIL-deficient C57BL / 6小鼠显示早期糖尿病发作后应用多种低剂量链脲霉素(STZ)与正常小鼠相比。这两个实验的结果模式以及其他一些建议保护作用对自身免疫性炎症小道。另一方面,存在跟踪报道的t细胞反应的一部分剧目在β细胞破坏4]。在提到研究中,激活T细胞行来自29个孩子最近诊断为近年来显示高表达在浸润T细胞。我们组也报道之间的相关性高表达水平和增加人类胰腺β细胞死亡(12,13]。因此,相反也有报告显示一个破坏性的角色在糖尿病发展轨迹。澄清这个看似有争议的角色记录是必要的全面了解疾病的机制。

Nonobese糖尿病(NOD)小鼠是非常合适的在活的有机体内模型研究人类内转。今天的一个重要部分提供了关于这种疾病通过调查使用老鼠点头。这是因为学习与人类胰腺组织高度限制是由于医学和伦理问题也因为点头老鼠代表最接近人类疾病近年来模式(14]。虽然点头小鼠自发性糖尿病发展,调查人员经常使用diabetes-accelerating代理通常更快的疾病和更高的患病率5,15]。链脲霉素(STZ)和环磷酰胺(CY)是两个著名的和广泛使用的代理等目的。STZ通过GLUT2纳入细胞受体葡萄糖分子由于其相似之处,这限制了它的作用主要是β细胞。它的毒性作用是通过一氧化氮等机制的形成,对烷基化和DNA碎片(16- - - - - -18]。CY,另一方面,是直接影响CD4(抑制)⁺CD25⁺T reg细胞,缓解糖尿病的发展(19]。

因此广泛接受,虽然感应/加速糖尿病提供了合适的疾病模型,不同diabetes-inducing代理通常有不同的致病机制。这种差异可能反映了微分的影响免疫系统的元素,如配体。在这项研究中,我们假设小道配体的表达水平及其跨膜受体可能明显受到STZ和CY。我们使用了diabetes-prone点头老鼠来测试我们的假设。Insulitis-resistant diabetes-free nonobese抗糖尿病(也)作为对照组小鼠,并经历了相同的实验程序点头老鼠。我们发现踪迹配体表达水平升高在胰岛细胞小鼠注射STZ后点头。相比之下,显著减少感应CY。之后DcR1表达增加与配体在STZ-accelerated糖尿病的小岛,虽然没有重大变化之后CY应用程序。这些结果表明微分效应的两种不同diabetes-inducing代理商在跟踪配体及其DcR1受体的表达谱,同时提供的影响在近年来发展他们的角色。

2。材料和方法

2.1。点头也不是老鼠

女点头/ LtJ(点头)也/ LtJ(也)老鼠从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港),达到我们实验室在5周的年龄。所有小鼠被安置在一个孤立的部分实验动物保健和生产单位Akdeniz大学的医学院,12 h光暗周期。老鼠被隔离在提到单位前三周任何实验过程中的应用。所有动物进行了工作机构的批准下Akdeniz大学动物保健和使用委员会依照赫尔辛基宣言指导方针。也用于设置适当的对照组老鼠点头老鼠举行的过程,把通过完全相同的协议。

2.2。归纳和评价糖尿病

链脲霉素(STZ) (Sigma-Aldrich)制备柠檬酸缓冲溶液立即ip之前政府提供适当的pH值(4.2 - -4.5)的激活。环磷酰胺(CY)(环磷酰胺)解决方案也准备立即在ip注入之前,在0.9%的盐水。单剂量STZ(150毫克/公斤)或CY(200毫克/公斤)是前驱糖尿病的管理(10周)女点头老鼠和也的同龄女性也不是老鼠。因此,所有的老鼠包含在本研究得到一个提到diabetes-accelerating代理或车辆。出现糖尿病小鼠测试通过测量nonfasting血糖一旦每隔一天使用收集到的尾静脉血液和便携式血糖仪(Accu-Check去;罗氏,新泽西州,新泽西,美国)。小鼠血糖水平为250 mg / dL或在两个连续的测量被认为是糖尿病。

2.3。解剖Pancreata

Pancreata仔细分离相关的器官和组织在老鼠ketamine-xylazine麻醉和放置在10%福尔马林。老鼠立即牺牲。注射后的样本集合时间如下:天2、4、7、11、14从STZ-applied点头也没有老鼠和天1,4、7、14、21 CY-applied点头也不是老鼠。胰腺三个老鼠孤立样本在每个老鼠点了点头。两个样品每点也没有老鼠CY应用程序进行评估。组织收集STZ-applied和老鼠不像控制样品评估,如下所述,这些老鼠非常严重受到STZ诱导的影响。胰腺组织也被孤立在第0天(剂注入之前)至少3其他点头也不是老鼠。

2.4。免疫组织化学

formalin-fixated胰腺组织石蜡包埋,连续部分(4 - 5μ米)获得不同层次的块。Haematoxylin-eosin染色用于一般结构观察。疣状进行formalin-fixed石蜡,石蜡嵌入部分。小道配体及其受体的表达水平检测与合适的兔子anti-mouse主要抗体(Prosci-Inc多克隆,稀释1:100年,加州,美国。短暂的过程如下:部分从每一块deparaffinized并在微波炉中加热10分钟的抗原检索。内源性过氧化物酶被用3%的过氧化氢甲醇为10分钟。每个孵化步骤之后,彻底清洗的幻灯片在蒸馏水和磷酸盐(PBS)(0.001%,σ)。与主要抗体孵化后60分钟,部分被允许与二级生物素化的抗体反应(实验室愿景/热费希尔科学)15分钟和链霉亲和素过氧化物酶(ts - 125人力资源;实验室的愿景),持续15分钟。最后,所有幻灯片服用少量试剂(实验室愿景/热费希尔科学)相等的时间间隔在所有样品颜色发展和迈耶的苏木精复染色。 In all series, relevant positive controls included sections from lymph nodes. Tissue samples that were stained with the secondary antibody alone were used as negative controls.

2.5。免疫组织化学评分

病理学家(g . o . Elpek)没有先验知识的组织起源解释幻灯片的分布(积极染色细胞的百分比)和免疫染色强度。在每种情况下,积极的和消极的细胞数在400 x放大和百分比计算阳性细胞数量相对于细胞的总数统计。染色强度分为(0)-,(1)弱,适中的(2),(3)强烈的积极性的核和/或胞浆。标记分布被列为(0)不到10%,10%和40%之间(1),(2)在40%和70%之间,和(3)70%以上的细胞染色阳性。最后染色分数确定的总强度和标记分配分数。小岛的数量评估范围从4到12(意思是:)的评估在内分泌细胞免疫染色。Insulitis-free领域被用于评估在小岛周围浸润淋巴细胞。

2.6。统计分析

与SPSS 13.0统计分析进行窗口(SPSS Inc .芝加哥,生病,美国)。正常测试被Shapiro-Wilk进行团体测试。统计评估继续Mann-WhitneyU测试可以比较两个独立的组,观察评估统计学意义的差异。统计学意义被认为在5%概率水平。

3所示。结果

3.1。糖尿病发展不同加速NOD小鼠单注射链脲霉素(STZ)或环磷酰胺(CY) 10周的年龄

各种不同的应用剂量STZ已报告在研究老鼠点头应用于不同年龄(20.,21]。我们应用200毫克/公斤STZ起动剂量小的动物数量()作为一个试点研究。提到剂量显示非常快和致命影响的老鼠,在3中的5个老鼠死在天6应用程序。然后应用减少剂量150毫克/公斤STZ,没有显示不受欢迎的直接毒性作用。总共15个女点头老鼠在10周的年龄被注射STZ 150毫克/公斤。一些疾病的老鼠显示症状从第四天开始,如血糖水平超过250 mg / dL,进步的减肥。平均血糖水平以点头老鼠在第四天结束点(图250 mg / dL1)。另一方面,CY应用的单剂量200毫克/公斤15女点头老鼠在10周的年龄。这些老鼠开发近年来以较慢的课程和较低的发病率相比STZ-induced动物(图1)。糖尿病血糖水平达到从11天。糖尿病患者的比例牺牲组在每个点(在150毫克/公斤)标记评价STZ-applied和200毫克/公斤CY-applied实验小组展示在表1。

3.2。小道配体表达水平遵循着一个完全不同的模式的胰岛细胞STZ-versus CY-Applied动物

之前的分析配体和受体在胰岛细胞,免疫组织化学染色进行淋巴结部分确认使用的特异性抗体,显示很强的染色模式。独自孵化淋巴结的二次抗体(负控制),相比之下,没有导致任何阳性染色。样例淋巴结染色TRAIL及其DcR1受体(图所示2)。染色强度差异β胰岛腺泡的细胞进一步证实了特异性(数字3和4)。

配体和受体的表达水平受试者的胰腺部分检测到免疫组织化学分析中描述的部分2。NOD小鼠接受STZ diabetes-accelerating代理,小道表达式显示统计学意义而暂时减少注射的第二和第四天之间,当至少三分之二的老鼠牺牲糖尿病免费()(图3 (b))。然而,TRAIL表达水平开始增加在接下来的几天。在第14天上升显著,在一个地方所有的动物是糖尿病,表情相比,发现天0 ()。从STZ-injected和小鼠获得的数据(图中未显示)不能作为控制从点头小鼠获得相关数据。这是因为从STZ诱导和老鼠非常严重影响(见下文)。

CY应用程序后,另一方面,TRAIL表达高至少前四天期间,基础水平相比之前发现注射(图3 (b))。所有动物都是糖尿病免费在这个阶段。我们观察到从第七天开始减少。在14 - 21天,TRAIL表达水平很低比测量值在0。在第14天减少是统计学意义()。三分之二的动物牺牲,这两点是糖尿病。TRAIL表达水平在CY-injected发现老鼠和老鼠一般低于点头收购在第0天整个实验过程(数据没有显示)。

3.3。DcR1水平增加STZ-Applied点头小鼠胰岛

DcR1水平增加注射STZ后(图4 (b))。有趣的是,DcR1表达式是控制在一个相对较低的水平,在头几天主要diabetes-free阶段所有的动物,有些类似于观察记录()。在达到最高水平天11和14,当所有的小鼠糖尿病。在第14天增加记录,所有的动物都分析了糖尿病时,在统计学上意义重大。CY后DcR1水平无显著变化是明显的应用程序。DR5虽然略有增加,DcR2受体水平明显加速糖尿病的整个开发代理商,增加并不显著(图5)。

3.4。通常小道诱饵和死亡受体表达增加腺泡的细胞STZ或CY应用程序后,而小径配体表达水平差异的影响

TRAIL受体表达增加的腺泡细胞STZ CY-treated点头的老鼠,在第0天获得的值相比,在应用程序的任何代理(图6)。小道配体表达,另一方面,增加了STZ行动而保持在最低级别的CY。DcR1或轨迹表达式后的腺泡细胞STZ应用程序没有显示暂时减少在第一天的应用程序中,与观察到的小岛。虽然小道配体表达已经在最低级别在第0天腺泡的细胞,这是保持在最低通过CY-induced疾病。样品染色可以查看数据3和4。

3.5。老鼠也没有更严重的影响从STZ相比点头老鼠

和老鼠都称为insulitis-resistant diabetes-free菌株和是由生产者杰克逊实验室作为研究的适当控制的角色non-MHC基因在糖尿病的发展。我们对STZ使用10和老鼠和CY诱导组控制。他们收到了完全相同的剂量小鼠点头。然而,相当意外,STZ更严重的影响diabetes-resistant还是老鼠相比diabetes-prone点头老鼠。这些老鼠显示糖尿病血糖水平(> 250 mg / dL)的第二天STZ应用程序。在第七天,80%的小鼠死亡(图7)。出于这个原因,老鼠也不能作为控制STZ应用点头老鼠。相反,在第0天表达水平的应用程序被用作控制的价值观。另一方面,CY没有显示任何有毒或糖尿病影响也不是老鼠。所有的动物都处于良好的状态在整个实验过程诱导后,和血糖水平仍低于118 mg / dL点(图7)。

4所示。讨论

各种细胞因子如FasL和tnf与β细胞内转至破坏。相比之下,有争议的角色归因于小道,这是免疫系统的重要组成部分。还需要进一步的研究来阐明在这种疾病的确切作用。点头老鼠经常用于调查近年来有关,和加速疾病模型提供一个更高的疾病患病率和更快的发展。STZ和CY最常用diabetes-inducing为此代理。我们假设STZ和CY不同会影响配体和受体表达水平由于其独特的作用机制和相关的研究结果将提供影响这些标记分子在近年来发展的作用。我们的研究结果显示,配体和DcR1表达水平增加了动作的STZ点头小鼠的胰腺β细胞。这是否表明可能的保护作用这两个标记的胰腺β细胞大量浸润淋巴细胞可能被进一步阐明支持调查。CY治疗,另一方面,减少了一个明确的小道。减少轨迹表达式的小岛在这种情况下可能导致CY的diabetes-accelerating行动。

我们是一个中间糖尿病发展速度可能患病率最高当决定剂量STZ和CY用于测试我们的假设。不同剂量STZ和CY已经使用了加速糖尿病NOD小鼠(5,15,19,21]。等因素的一般健康状况和时代主题的注入,住宿条件、路线的应用程序,甚至可能略有不同但未识别的遗传背景可能影响这些学科的生存和诱导的糖尿病发病率疾病,除了应用浓度。对STZ治疗,众所周知,一个高剂量诱导更快失去胰岛素分泌,因此更迅速出现糖尿病老鼠。我们运行了一个试点研究与高剂量的代理我们的调查的开始。单剂量200毫克/公斤STZ严重有毒点头老鼠(),导致大部分动物死在天6。然而,没有突出的或过早严重毒性观察到150毫克/公斤(图1)。虽然单一的效果和相对高剂量STZ配体和受体表达水平的检测在这项研究中,它可能是有意义的比较这一效应与疾病环境中建立和多个较低剂量的代理。另一方面,单剂量200毫克/公斤CY治疗应用于10周大女点头老鼠提供了一个合适的模型(图1)。一致,这个剂量也喜欢许多其他报告(3,5,19]。

与配体和DcR1表达式的增加在我们的研究中观察到的相对先进的疾病阶段(下面讨论),显著减少明显的表达水平尤其是小道两天2和4之间STZ注入,而DcR1水平也保持低(数字3和4)。糖尿病症状(血糖水平超过250毫克/公斤,体重慢慢下降)开始在第四天STZ-applied点头小鼠组。激活的T淋巴细胞渗透据报道已经阻碍了糖尿病NOD小鼠的早期发展中自发的疾病,通过免疫调节的作用机制。β细胞进入一个临时的增殖周期在这个阶段,可能是为了弥补损失。下面这个,覆盖面很破坏β胰岛的发生与t细胞活化,最有可能由于持续存在的β细胞抗原(22,23]。需要进一步调查发现如果提到增殖阶段的糖尿病症状与低水平的小道和DcR1表情注射STZ后在我们的研究中发现。

广泛接受,diabetes-inducing代理STZ和CY有不同的致病机制。STZ诱导后执行的免疫组织化学分析,显著增加的表达水平检测配体和DcR1胰腺胰岛受体表达的小鼠在第14天点头,当所有的受试者都糖尿病,而天0(注射STZ之前)(数据3和4)。这些标记物的表达水平可能增加胰岛细胞在糖尿病注射STZ后的快速发展伴随着巨大的淋巴细胞浸润。增加TRAIL表达细胞因子诱导β胰岛中显示了Mi et al。5]。由我们集团在最近的一项研究中,小道超表达作为策略来增加其表达水平在allotransplantedβ胰岛糖尿病老鼠,从而提供更高的保护浸润白细胞。我们表明,高轨迹表达式提供移植胰腺胰岛的运载体STZ-induced糖尿病大鼠胰岛炎的严重程度下降,虽然长期的同种异体移植物寿命和增加它的功能(24]。水平的提高我们观察到DcR1表达式也反映了一个防御策略。这是因为浸润白细胞也表达TRAIL配体本身,这被认为是一个使用的凋亡配体促进β细胞的凋亡细胞。许多团体包括我们之前所示,诱饵受体水平升高在细胞表面可能提供抵抗。这海拔DcR1水平发现在胰腺β细胞可能是一个初始然而最终努力抵抗凋亡不足浸润淋巴细胞所表达的轨迹的影响。

DcR2和DR5水平通常是表示在STZ-applied大量的小岛,以及CY-applied点头老鼠在糖尿病发展(图7)。尽管代理似乎导致这些标志物的表达水平的增加,表达水平没有显著的差异相比,天0值。特别是DR5水平显著增加可能是预期,作为STZ增加p53的水平,进而提升了死亡受体DR5表达(25,26]。

小道配体表达明显降低在CY-injected点头小鼠胰岛(图5)。CY是免疫抑制代理。据报道尤其是CD4是有效的⁺CD25⁺调节T细胞亚群)。Treg细胞抑制CD8⁺在正常条件下t细胞数量。然而,高水平的细胞凋亡在亚CY-applied老鼠隔绝,抑制CD8和他们的能力⁺t细胞丢失(27]。Brode等人就发现CY的亚群作为目标,明确后发现这些细胞与自然Treg Foxp3标志(19]。显著降低我们的研究水平的小道在这方面可能是有意义的,因为小道是免疫系统的重要组成部分,和缺乏导致更快的近年来的发展。支持,自发糖尿病NOD小鼠并没有导致Treg细胞减少(28]。同样的研究声称,自发糖尿病发展不能占据定性或定量调节T细胞的减少,而是改变频率和致病性T细胞的功能。因此,CY似乎抑制Treg细胞和减少TRAIL表达胰岛细胞,两者都可以加速糖尿病的发展。

配体和受体表达谱获得的腺泡细胞倾向于加强特异性的影响两个不同diabetes-accelerating代理在小岛和有些腺泡的细胞。接受,STZ被通过GLUT2β细胞受体,这被称为beta-cell-specific葡萄糖转运蛋白分子。我们上面所讨论的,在胰岛细胞,β细胞是最常见的细胞类型,我们观察到在DcR1和小道水平显著增加一个临时然而天2和4之间的明显降低STZ申请记录(数据3和4),另外两个受体的表达(DcR2和DR5)相比没有改变明显(图5)。自GLUT2受体表达特定于腺泡的β细胞,因此没有找到,STZ在腺泡细胞的影响(在小径逐渐增加配体和受体表达在整个疾病过程)可能出现的压力所经历的这些细胞在回答有毒的代理介绍给他们的环境,但不采取内部,并通过先进的疾病的影响。CY,另一方面,在实验中也可能有抑制效果,除了T调节细胞。这个微分效果CY似乎也证实腺泡的细胞上,小道表达式是整个CY-accelerated疾病保持在最低。小道是免疫系统的重要组成部分,被认为是表示为胰岛细胞的保护措施对浸润淋巴细胞。通常所有的TRAIL受体表达增加在CY应用后的腺泡细胞,增加DcR1和DcR2统计学意义(),没有一个小道受体β胰岛表达式显示任何重大变更。这似乎仍然支持一个微分效应CY小岛和腺泡的细胞。

小鼠不同菌株可以利用控制在研究老鼠点头,根据研究的性质和相关假设。和老鼠都被制片人杰克逊实验室insulitis-resistant和diabetes-free菌株。虽然据报道,仍然表现出外围早期积累和有缺陷的小鼠腹膜巨噬细胞反应的特点点头,他们对于研究的角色被定义为有用non-MHC基因在糖尿病的发展。虽然STZ应用程序提供的剂量150毫克/公斤点头小鼠糖尿病发展从第四天开始,不存在不受欢迎的过早毒性,相同的剂量,而意外造成的死亡80%和老鼠的第七天由于血糖水平快速增长导致严重疾病(图表现7)。这严重影响STZ应用施加于被称为糖尿病的小鼠耐毒性可能是由于更高的代理的这些老鼠,想必通过更高的博览会一个未知的机制。STZ是一种抗生素产生的链霉菌属achromogenes并对其细胞毒性效应主要是通过一氧化氮形成和烷基化的DNA (16]。它被称为葡萄糖模拟积累有选择地通过GLUT2胰腺β细胞受体(29日]。可能更高GLUT2受体成分和老鼠可能是潜在的机制,目前通过我们小组的调查。CY,另一方面,没有产生细胞毒性/糖尿病影响也不是老鼠。这支持糖尿病诱导的概念CY需要病理背景胰岛炎等,在点头的老鼠明显(15]。的老鼠也不能作为控制STZ组表达水平在第0天获得代理应用程序作为基本参考比较STZ -与CY-mediated变化。

我们的研究结果也表明,虽然近年来模型是适合广泛使用在相关的研究中,不同的致病机制应考虑不同的代理。免疫系统的其他重要组件比痕迹极有可能影响明显,以应对不同的代理。进一步研究与更广泛的实验和控制组织在这个问题上,也许在替代动物模型将有助于清除上面的影响进行讨论。

5。结论

使用老鼠点头,我们发现踪迹和DcR1表达水平差异的影响在STZ -胰岛细胞与CY-accelerated内转。高浓度的标记在STZ-accelerated发现疾病的小岛可能表明对浸润淋巴细胞防御机制。另一方面,相反减少轨迹表达式后观察CY应用程序可能是一个CY的致病机制的一部分,除了得到验证该代理的抑制效应T调节细胞。

利益冲突

作者声明没有二元性与本文相关的利益。

确认

这项工作是由土耳其的科学技术研究委员会(图),由项目没有。SBAG 107 s374, Akdeniz大学科研管理部门。大肠Dirice和美国Kahraman同样导致了本文。

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