文摘

胰β细胞港口α₂肾上腺素能和glucagon-like peptide-1 (GLP-1)其质膜上相应的配体受体肾上腺素/去甲肾上腺素和GLP-1管理分子胰岛素分泌。然而,目前尚不清楚这两个信号系统来获得足够的交互和及时控制胰岛素释放反应的葡萄糖。目前的工作表明,α₂肾上腺素能受体激动剂氯压定concentration-dependently抑制了分子生物学从INS-1胰岛素分泌细胞。相反,GLP-1 concentration-dependently强化胰岛素分泌响应葡萄糖。重要的是,目前的研究表明,阈下α₂肾上腺素的激活与可乐定抵消GLP-1 glucose-induced胰岛素分泌的强化。这个counteractory过程依赖于百日咳毒素- Gi (PTX)敏感蛋白,因为它不再发生后PTX-mediated Gi蛋白质的失活。GLP-1势差的反动分子通过阈下的胰岛素分泌α₂肾上腺素的激活可能会作为胰岛素释放的精确调控的分子机制。

1。介绍

分子生物学胰岛素分泌的控制中发挥着不可替代的作用葡萄糖稳态自胰岛素是唯一的激素能降低体内血糖(1- - - - - -3]。这胰腺内分泌激素β细胞分泌颗粒。这些颗粒进行胞外分泌释放到血液中胰岛素货物以应对血糖水平升高(1- - - - - -3]。在海拔的血浆葡萄糖水平,β通过葡萄糖转运蛋白细胞有效占用葡萄糖。此后,随后的葡萄糖代谢大大提高细胞内ATP水平。合成ATP / ADP比率上升关闭ATP-sensitive K⁺(K_{三磷酸腺苷})通道,导致质膜的去极化。细胞膜去极化依次打开电压门控钙^{2 +}(Ca_V)频道,调解Ca^{2 +}涌入。随之而来的cytosolic-free Ca的增加^{2 +}浓度([Ca^{2 +}]_我)触发器之间的直接交互exocytotic位于insulin-containing颗粒膜蛋白在质膜和本地化。最终,exocytotic蛋白质之间的相互作用启动insulin-containing颗粒与质膜的融合,也就是说,胰岛素胞外分泌[1- - - - - -3]。

上述共识范式,分子生物学胰岛素分泌,事实上,受复杂的神经机制(4,5]。众所周知,自主神经系统控制着胰岛细胞,副交感神经末梢释放一些物质,例如,乙酰胆碱和——血管活性肠多肽,加强分子胰岛素分泌(5,6]。相反,交感神经终端胞吐肾上腺素能和肽能的发射机抑制胰岛素分泌过程(4,5]。与主同情发射机去甲肾上腺素治疗完全关闭从小岛或胰岛素分泌β细胞聚集perifused高葡萄糖(7,8]。从力学上看去甲肾上腺素作用于α₂受体与百日咳毒素- Gi蛋白质(PTX)敏感β细胞,减少分子通过抑制胰岛素分泌细胞内营的形成,Ca_V通道、葡萄糖代谢和K的exocytotic机械以及高程_{三磷酸腺苷}频道活动(4,5]。

分子生物学胰岛素分泌不仅受到复杂的神经调节,而且不同类型的激素调节(9- - - - - -16]。的胰岛β细胞能够感觉自己发布的分子,如锌和ATP和激素释放周边细胞autocrinally和paracrinally调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌(13- - - - - -18]。许多系统性影响胰岛激素β协调细胞胰岛素分泌葡萄糖反应(9- - - - - -12,19]。一群胃肠激素长期以来吸引了大量的关注和归类为肠促胰岛素分子由于其刺激行动胰岛素分泌(9- - - - - -12]。最重要的一个肠促胰岛素的激素是glucagon-like peptide-1 (GLP-1),从肠道L-cells分泌到血液中饭后(9- - - - - -12]。在遇到β细胞,肠促胰岛素结合Gs protein-coupled这些细胞上的受体结合,从而激活腺苷酸环化酶,Ca_V通道、葡萄糖代谢和exocytotic机械以及抑制K_{三磷酸腺苷}渠道(9- - - - - -12,20.- - - - - -22]。作为这些事件的结果,分子生物学的强化胰岛素分泌发生(9- - - - - -12,20.- - - - - -22]。

尽管去或glp - 1在分子的调节胰岛素分泌信号系统已澄清,目前尚不清楚这两个信号系统交互以获得充足和及时在葡萄糖刺激胰岛素释放4,5,9- - - - - -12,20.- - - - - -22]。在目前的工作中,我们描述阈下α₂肾上腺素能激活抵消glucagon-like peptide-1增强作用的分子生物学胰岛素分泌PTX-sensitive Gi protein-dependent方式。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

INS-1细胞培养在RPMI 1640介质(表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充下列添加剂:10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,和100 U / 100μg / ml青霉素和链霉素,10毫米N - [2-hydroxyethyl piperazine-N^”2-ethanesulfonic酸(玫瑰),1毫米丙酮酸钠,50μ米β巯基乙醇(表达载体)。简单地说,细胞在70%左右confluency使胰蛋白酶化。结果细胞悬液被播种到24-well细胞培养板。这些细胞被维持在37°C调湿有限公司5%₂孵化器。他们成长约70%汇合,然后接受胰岛素分泌的分析。

2.2。静态的胰岛素分泌

大约70%汇合的INS-1 24-well盘子被用于胰岛素分泌细胞实验。这些细胞被保持在37°C调湿有限公司5%₂孵化一个实验的过程中,除了当他们浴解决方案需要更改。实验进行了Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲(KRBH)组成的玫瑰(140毫米)氯化钠,氯化钾的3.6,1.5 cacl₂0.5 mgso₄0.5不₂阿宝₄2 nahco₃,10个消息灵通的,0.1%牛血清白蛋白(BSA)、pH值7.4。首先,这些细胞被冲洗glucose-free KRBH然后保存在相同的缓冲2 h。此后,他们冲洗和preincubated glucose-free KRBH 30分钟。描述的量效关系α₂肾上腺素能受体激动剂可乐亭和肠促胰岛素GLP-1以及去甲和GLP-1信号系统之间的相互作用,这些细胞被冲洗和孵化3 - 11毫米葡萄糖KRBH含有不同浓度的氯压定和/或GLP-1 30分钟。可乐宁和/或GLP-1同时应用葡萄糖。确定可能的依赖关系α₂肾上腺素能受体调节GLP-1 PTX-sensitive Gi受体蛋白质,这些细胞被使用在1640年RPMI 100 ng / ml PTX媒介18 h。随后,毒素中被删除。这些细胞被冲洗和孵化glucose-free KRBH如上所述和接受孵化项目3 - 11毫米含有不同浓度的葡萄糖KRBH可乐宁和/或GLP-1 30分钟。最后,不同的治疗试剂被搁置的文化板块停止。上层清液吸气很仔细从每个样本准备胰岛素量化。样本离心机在1000 g×3分钟去除分离细胞和储存在−20°C到胰岛素免疫测定。

2.3。放射免疫检定法

标准胰岛素免疫测定是用来评估从INS-1静态胰岛素分泌细胞接受不同的治疗方法23,24]。简单地说,重复测量样本。校准曲线是由胰岛素标准在5、10、20、40、80和160个人/ L。放射性是算的γ计数器。

2.4。统计分析

所有数据都意味着±SEM。统计学意义是由单向方差分析评价,其次是至少显著差异(LSD)测试。显著性水平是决定在0.05和0.01的水平。

3所示。结果

3.1。可乐定Concentration-Dependently抑制分子胰岛素分泌

确定氯压定抑制分子胰岛素分泌的量效关系,我们检查了30分钟孵化的影响与可乐定浓度从0.003到10μ米在胰岛素释放INS-1细胞葡萄糖被质疑11毫米。如图1孵化,11毫米葡萄糖为30分钟导致显著的胰岛素分泌与3毫米与葡萄糖(,)。这证实了细胞在这组实验中使用可靠地回应了这样的刺激胰岛素分泌数量可观的。因此,我们采用这个足够和可靠的刺激来测试可乐定对分子生物学胰岛素分泌的影响。图1显示,在-10 - 0.003的浓度范围μ米,可乐定concentration-dependently抑制胰岛素释放葡萄糖INS-1细胞暴露于11毫米。的影响变得显著,当可乐定浓度达到0.01μM和更高(,在0.01μ米,为0.1,1和10μ米)。阈下和ED₅₀可乐定的浓度约为0.003和4μM,分别。

3.2。Glucagon-Like Peptide-1 Concentration-Dependently刺激分子胰岛素分泌

揭示GLP-1势差分子生物学的胰岛素分泌的量效关系,我们评估INS-1细胞的胰岛素分泌反应与11毫米葡萄糖刺激30分钟的GLP-1浓度范围1000到0.0001纳米。图2显示11毫米葡萄糖治疗30分钟产生显著增加胰岛素分泌葡萄糖治疗相比,3毫米,)。这将验证细胞的葡萄糖响应性在这组实验中。如图2,GLP-1浓度范围0.0001到1000海里显著强引起的胰岛素释放11毫米葡萄糖浓度的方式。显著增强作用发生当GLP-1浓度提高到0.1 nM和更高的(,)。浓度为0.01 nM的阈下浓度被认为是GLP-1分子生物学的强化胰岛素分泌。的艾德₅₀浓度的GLP-1其余胰岛素分泌葡萄糖反应计算是0.1海里。

3.3。阈下的可乐定抑制的刺激效果Glucagon-Like Peptide-1分子胰岛素分泌

胰β细胞都配备了α₂肾上腺素能受体和GLP-1受体所侵犯交感肾上腺素发射机/去甲肾上腺素和肠促胰岛素激素GLP-1,分别为(4,5,9- - - - - -12,20.- - - - - -22]。这两个系统极度调节分子胰岛素分泌(4,5,9- - - - - -12,20.- - - - - -22]。这不可避免地引发了一个问题,是否他们是互相绝缘或一个相声和其他在胰腺β细胞。为了解决这个问题,我们检查了阈下α₂肾上腺素能激活影响GLP-1分子胰岛素分泌的强化。

验证电池的容量应用在这组实验中对葡萄糖释放胰岛素反应同样执行。如图3为30分钟,治疗11毫米葡萄糖引起显著的胰岛素释放与葡萄糖(与3毫米,)。正如所料,细胞暴露于氯压定在阈下浓度3 nM并不能改变他们的胰岛素分泌反应11毫米葡萄糖(,与集团受到只有11毫米葡萄糖刺激(图)3)。相比之下,细胞治疗GLP-1 ED₅₀0.1 nM之后的11毫米浓度葡萄糖刺激胰岛素释放显著超过细胞受到只有11毫米葡萄糖刺激(,)。重要的是,细胞与ED孵化₅₀浓度GLP-1加上可乐定的阈下浓度胰岛素分泌显著低于细胞治疗ED₅₀浓度GLP-1 11毫米葡萄糖刺激后(,)(图3)。胰岛素分泌反应11毫米葡萄糖组治疗ED之间非常相似₅₀GLP-1 +可乐定的阈下的浓度,浓度阈下的可乐定的浓度,治疗组和治疗组(,)(图3)。数据表明,阈下的可乐定的浓度完全抵消的增强作用分子由ED胰岛素分泌₅₀GLP-1的浓度。

3.4。反动的Glucagon-Like Peptide-1增强作用的分子生物学胰岛素分泌可乐定依赖百日咳Toxin-Sensitive Gi蛋白质

多个细胞内信号事件,如减少营地生产、Ca_V渠道活动、葡萄糖代谢和exocytotic能力以及增加K_{三磷酸腺苷}电导激活时发生α₂肾上腺素能受体的β细胞抑制分子胰岛素分泌(4,5]。所有这些活动都依赖于PTX-sensitive Gi蛋白质立即中介α₂肾上腺素能激活(4,5]。这使我们想知道中和GLP-1增强作用的分子生物学胰岛素分泌可乐定依赖PTX-sensitive Gi蛋白质。绕过这个问题,我们评估如果PTX-mediated Gi蛋白质的失活可以防止反动GLP-1增强作用的分子通过阈下的胰岛素分泌α₂肾上腺素的激活。

这组实验中使用的细胞被证明是相当敏感的葡萄糖对其胰岛素分泌反应。图4显示控制和PTX-pretreated细胞释放大量的胰岛素,当葡萄糖浓度从3到11毫米(,)。细胞使用100 ng / ml PTX 18 h细胞分泌胰岛素明显多于没有葡萄糖刺激(PTX预处理之后的11毫米,)(图4)。可乐定阈下浓度3 nM和ED₅₀浓度4μ米没有影响胰岛素分泌反应到11毫米的葡萄糖PTX-pretreated细胞(,与PTX-pretreated集团受到只有11毫米葡萄糖刺激(图)4)。然而,GLP-1 ED₅₀从PTX-pretreated浓度0.1 nM显著增强胰岛素分泌细胞之后的11毫米葡萄糖刺激(,与PTX-pretreated集团受到只有11毫米葡萄糖刺激(图)4)。最重要的是,阈下的可乐定的浓度无法抵消分子胰岛素分泌的增强作用₅₀浓度的GLP-1 PTX-pretreated细胞(,与PTX-pretreated组治疗11毫米葡萄糖+ 0.1 nM GLP-1)(图4)。GLP-1势差的数据表明反动分子由可乐定依赖胰岛素分泌PTX-sensitive Gi蛋白质。

4所示。讨论

葡萄糖稳态极度依赖于复杂的分子调控胰岛素分泌自主冲动和体液输入胰腺β细胞(4,5,9- - - - - -16]。α₂肾上腺素能和GLP-1受体胰腺β细胞转导信号相应的配体肾上腺素和去甲肾上腺素和GLP-1控制glucose-induced胰岛素释放4,5,9- - - - - -12]。目前的工作确认α₂肾上腺素能受体激动剂可乐亭和肠促胰岛素GLP-1 concentration-dependently抑制glucose-induced胰岛素释放在浓度范围类似的工作在以前的研究8,25,26]。此外,它还估计阈下和ED₅₀论文两个受体激动剂的浓度。这些参数是考试的关键GLP-1反动的增强作用的分子通过阈下的胰岛素分泌α₂肾上腺素的激活。

最重要的是,本研究首次表明,体内INS-1细胞暴露在ED₅₀浓度GLP-1一起阈下的可乐定的浓度胰岛素释放显著低于细胞治疗ED₅₀独自GLP-1葡萄糖刺激后的浓度。此外,它还揭示,敌对的交互的α₂肾上腺素的信号系统与GLP-1信号系统关键取决于PTX-sensitive Gi蛋白质。这些发现提供证据证明α₂肾上腺素或GLP-1信号系统没有独立运作,而是前者有效对抗后者使胰腺β细胞适当地执行其独特功能分子胰岛素分泌。事实上,G protein-coupled受体信号通路之间的相互作用已经被深入研究特别是在其他细胞和神经元(27- - - - - -33]。这样的交互依赖多级机制(27- - - - - -33]。他们发生在受体水平由于受体heterodimerization,即G protein-dependent或独立(27- - - - - -30.]。heterodimerization能够改变配体的亲和力和/或信号转导的功效的化学受体(27- - - - - -30.,32,33]。G protein-coupled受体信号通路之间的相互作用也可以绕过受体水平,导致下游的受体受体之间的串扰信号级联(31日]。一般来说,这些良好的机制适用于GLP-1势差的反动分子通过阈下的胰岛素分泌α₂肾上腺素能激活胰腺β细胞。深入的机制α₂肾上腺素的信号系统对抗glp - 1在胰腺信号系统β细胞仍有待特征。

毫无疑问,健康的身体需要有效的胰岛素量去除多余的葡萄糖从血液到身体细胞的大部分时间。然而,健康的身体需要更少的胰岛素促进血糖水平在某些情况下,如压力,运动,血糖低,和其他环境的挑战。GLP-1势差的反动分子通过阈下的胰岛素分泌α₂肾上腺素激活绝对适合在这种情况下,交感神经活动升高(34]。它增加了一个新的水平的复杂性的经典范例的规定glucose-evoked胰岛素释放。在某些病理条件下,例如糖尿病、高血压、肥胖、和老化,交感神经活动和/或表达α₂肾上腺素能受体的β细胞显著增加(35- - - - - -39]。增加交感神经活动和/或表达α₂肾上腺素能受体的β细胞可能夸大了敌对的交互的α₂肾上腺素的信号系统与glp - 1在胰腺信号系统β细胞引发和加重糖尿病(35- - - - - -39]。

5。结论

α₂肾上腺素能受体和GLP-1分泌细胞受体INS-1细胞转导信号相应的配体可乐亭和治理GLP-1 glucose-induced胰岛素释放。重要的是,前者也与后者制动glucose-induced胰岛素释放,后者的强化。事实上,阈下α₂肾上腺素能激活足以抵消glp - 1在一个PTX-sensitive glucose-induced胰岛素分泌的强化Gi protein-dependent时尚。这种反作用是可以作为分子机制的微妙控制胰岛素释放健康的身体。最有可能的是,这种counteractory过程夸张的引发和加重糖尿病,因为肥胖、老龄化和糖尿病与交感活性升高高度相关(35- - - - - -39]。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(30971175)和天津市科委(09 jczdjc19900),从天津医科大学创业研究资助。Minglin锅和阳了同样的工作。