文摘

自的功能角色(s)血管紧张素ⅱ(Ang II) II型受体(₂R)在I型糖尿病是未知的,我们假设₂R是参与减少I型糖尿病的肾脏的影响。我们与低剂量链脲霉素诱导糖尿病(STZ)两种₂R淘汰赛(在₂),RKO野生型(WT)岁的雄性老鼠12周,4周跟着他们。三个子组非糖尿病患者,糖尿病和糖尿病(胰岛素植入Rx)来研究。收缩压(SBP)、生理参数、肾小球滤过率(GFR),肾形态、基因表达和细胞凋亡进行了评估。经过4周的糖尿病、WT控制相比,在₂老鼠RKO显然发达的早期糖尿病肾病(DN)的特点,如肾脏肥大、管状细胞凋亡,进步的细胞外基质(ECM)蛋白质积累以及增加肾小球滤过率(GFR)。在₂老鼠RKO高血压影响糖尿病。肾脏氧化应激(如血红素加氧酶1 (HO-1)基因表达和活性氧(ROS)生成)和肾素血管紧张素系统intrarenal组件,如血管紧张肽原(Agt)₁R,和血管紧张素转换酶(ACE)基因表达增强,而血管紧张素转换enzyme2 (ACE2)基因表达减少肾近端小管(rpt)₂RKO老鼠。肾功能的变化上面所提到的在糖尿病显著增强₂老鼠但RKO部分减毒在糖尿病WT来和₂RKO老鼠。总之,在₂R缺乏加速发展的DN,它似乎是介导的,至少在某种程度上,通过提高氧化应激和ACE / ACE2在rpt比率。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是一个在北美(终末期肾功能衰竭的主要原因1,2]。在多个风险因素导致糖尿病肾病,肾素-血管紧张素系统(RAS),协调荷尔蒙的级联,主要生理和病理的影响心血管和肾脏功能,是最重要的一个系统影响DN发展和进展(3- - - - - -5]。

虽然慢性RAS阻滞剂治疗是有效的控制高血压和制动DN发展,它不是一个治疗,表明肾保护的机制RAS阻滞剂在糖尿病远非完全理解,和额外的治疗途径作为潜在药物靶点的发现是非常重要的2,6]。

Intrarenal血管紧张素ⅱ(Angⅱ),RAS的主要效应是增加在DN,行为通过两个主要的血管紧张素受体,Angⅱ1型受体(₁右),₂R,可能参与糖尿病肾脏功能失调的反应(3- - - - - -5]。例如,Angⅱ在肾脏是由影响₁R和包括细胞去分化和增殖,肾脏肥大和凋亡,血管收缩,加剧肾功能和管状钠吸收。与完善的功能的影响₁R在DN的功能作用₂R I型糖尿病肾病的发展是不完全的理解。在₂R激活似乎抑制肾素生物合成和释放肾球旁细胞,导致血管舒张和尿钠排泄,从而降低血压(BP) (3- - - - - -5]。

在肾脏₂R的表达在胚胎和成熟阶段(即。,glomerular endothelial cells, podocytes, tubular epithelial cells, and inner medullary collecting ducts) is known and well defined [7]。在₂(即R-deficient老鼠。,在₂R淘汰赛,₂)显示一个RKO表型类似于人类先天性肾和泌尿系统异常(8,9和在成年后引发高血压8]。这些表型突出的重要性₂R在正常肾脏发展和英国石油公司监管,但了解₂R是监管仍然是难以捉摸的。

RAS的额外组件的家庭,血管紧张素转换enzyme2 (ACE2) [10,11),与血管紧张素转换酶(ACE)共享42%的同源性,但不同的生化活动。ACE2专门开辟《我和二盎盎1 - 9和1 - 7,分别。因为ACE2和ACE coexpressed在许多组织,和ACE2表达是有氧运动,renoprotective代理counterregulatory地王牌在实验动物和人类,改变它们的活动和ACE / ACE2比率可能参与高血压和肾脏疾病(12- - - - - -14]。无论是在₂R和ACE2糖尿病交互,包括DN,是未知的。然而,由于在₂R抑制ACE活性(15),我们推测₂R糖尿病可能导致ACE2活动加剧,然后ACE2 / ACE比率增加,这可能是重要的血管舒张和尿钠排泄的DN。

在当前的在活的有机体内研究中,我们审查的潜在功能角色(s)₂R I型糖尿病肾病发展的不足。我们假设在₂R缺乏将加速DN在I型糖尿病的发展通过活性氧(ROS)生成和upregulation经典intrarenal RAS基因表达的差别,对这些ACE2基因表达在肾近端小管(rpt)。

2。方法

2.1。动物

雄性野生型(WT C57 / BL6)和₂老鼠RKO (C57 / BL6背景,从佐藤Inagami博士,生物化学,范德比尔特大学医学院的纳什维尔,田纳西州,美国)(8)进行了研究在活的有机体内。

如前所述(16- - - - - -18),我们在男性在诱导糖尿病₂和WT RKO老鼠在12周时腹腔内的多个注射链脲霉素(STZ Sigma-Aldrich加拿大有限公司、奥克维尔,加拿大)在低剂量水平~ 45 - 50毫克每千克体重(BW)每日连续5天。三个子组(非糖尿病患者(控制)、糖尿病和糖尿病胰岛素治疗植入物(LinShin加拿大,Inc .,多伦多,加拿大))是牺牲了17周后四周岁的实验时间。

动物保健这些实验符合的标准设定的加拿大委员会动物保健,和所有程序批准的机构CRCHUM动物保健委员会。所有在₂和RKO WT (C57 / BL6)小鼠被安置在标准条件下的湿度和照明(12小时光照周期),免费获取标准鼠标食物和水随意。

2.2。生理研究

测量血糖水平与密友葡萄糖分析器(型号1500,跨学科、加拿大)后4小时快早上之前报道(16- - - - - -18]。平均收缩压(SBP)被tail-cuff监测方法与Visitech bp - 2000小鼠血压分析系统(美国NC Visitech系统Inc .,顶端)报道其他地方(16- - - - - -18]。短暂,所有动物都条件和适应了2周(20 - 30分钟的SBP测量每个会话,三次每周)在10周的年龄开始,然后SBP测量三次每周12周的每周平均年龄,直到16周的年龄。自动物适应BP测量,我们判断,SBP的压力记录下尾巴袖口相对最小化。虽然tail-cuff测量技术比遥测通常被认为是较不敏感,我们相信我们的SBP数据是有效的和令人信服的,基于大量的动物使用和纵向研究。

所有的动物安乐死在17周的时代有限公司₂和肾脏立即删除。体重(BW)和肾脏重量(千瓦)迅速记录下来。左肾是用于肾形态学和免疫组织化学(包含IHC)。保留了右肾肾近端小管(rpt)隔离的Percoll梯度法以及基因表达实验之前报道(16- - - - - -18]。

2.3。肾小球滤过率(GFR)测量

我们估计的肾小球滤过率(GFR) 16周大动物根据协议所描述的Qi et al。19由AMDCC)和推荐(http://www.diacomp.org/)。总之,每个老鼠收到一个静脉丸5%荧光素isothiocyanate-inulin (FITC-inulin),之后7血液样本(每个~ 20μL)收集从隐静脉3、7、10、15岁,35岁,55,75分钟post-FITC-inulin注入。等离子体荧光浓度在每一个时间点是衡量Fluoroscan提升外语(Labsystems,芬兰赫尔辛基)与485 nm励磁和阅读在538海里排放。根据方程计算肾小球滤过率(GFR):肾小球滤过率(GFR) =我/ (一个/α+B/β),我FITC-inulin丸交付的数量,一个和α是y快速的拦截和衰减常数(初始)衰减阶段,分别B和β是y拦截和衰减常数的慢衰减阶段,分别为(19]。

2.4。肾形态

石蜡包埋肾部分(每组4 - 5标本)沾过碘酸希夫(PAS)和马森的三色的染色和可视化通过光学显微镜对治疗组观察者不清楚。收集到的肾小球图像分析和量化了NIH形象J软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)之前报道20.- - - - - -22]。

2.5。细胞凋亡检测

细胞凋亡是由transferase-dUTP-nicked-end量化的标记(TUNEL)报道之前(16,23]。Semiquantitation肾脏细胞凋亡的执行如前所报道(20.- - - - - -22]。

2.6。ROS生成

新孤立rpt被lucigenin立即处理ROS测量方法如前所述[20.,21,24]。ROS生产标准化与蛋白质浓度和表示为相对光单位(rlu)μg蛋白。

2.7。Real-Time-Quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)

总RNA提取新鲜孤立rpt化验了基因表达的实时定量PCR (RT-qPCR)此前报道16,17,23]。快SYBR绿色Mastermix工具包和7500年的快速实时PCR系统(应用生物系统公司,生活技术,加州福斯特城,美国)是用于这一目的。

2.8。免疫组织化学

免疫组织化学(包含IHC)是由标准avidin-biotin-peroxidase复杂方法(ABC染色系统,圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯,加州,美国),所述其他地方(16,23]。多克隆anti-angiotensinogen (Agt)抗体的礼物博士约翰·道。陈(CRCHUM-Hotel-Dieu医院)。其他抗体,包括₁R、ACE和anti-heme oxygenase-1 (HO-1),从圣克鲁斯生物技术购买。单克隆抗体ACE2从研发采购系统,Inc .(伯灵顿,加拿大)。

2.9。统计分析

分析了实验团体之间的统计学意义1路的方差分析,其次是Bonferroni与Graphpad软件测试,Prism 5.0 (http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm)。一个概率水平的P≤0.05被认为是统计学意义与WT控制动物。

3所示。结果

3.1。生理研究

我们测量一些生物参数如BW (g)、千瓦(毫克),日常食品消费(g /天),和血液血糖浓度(3毫米)子组的动物(非糖尿病的控制和糖尿病,有或没有胰岛素治疗)WT和₂RKO老鼠。之间没有明显差异₂和WT老鼠有或没有糖尿病RKO BW(图1(一))(WT老鼠(g)、控制(),28.9±3.39;糖尿病(),25.52±1.38;糖尿病与胰岛素治疗(),26.07±1.91;在₂老鼠(g), RKO控制(),25.13±1.40;糖尿病(),23.96±1.25;糖尿病与胰岛素治疗(),24.05±2.82和日常食品消费(图1 (b))(WT老鼠(g /天)、控制(),2.96±0.41;糖尿病(),4.35±0.77;和糖尿病胰岛素治疗(),3.37±0.67;在₂老鼠(g), RKO控制(),2.82±0.50;糖尿病(),4.44±0.89;糖尿病与胰岛素治疗(),3.45±0.34)。正如所料,肾脏肥大(图1 (c))(定义为千瓦的比率和BW)出现在糖尿病动物的₂和WT RKO老鼠;胰岛素治疗规范化高血糖(图1 (d))(WT老鼠(mM)、控制(),7.87±1.59;糖尿病(),31.43±3.68;糖尿病与胰岛素治疗(),15.13±4.18;在₂老鼠RKO (mM)、控制(),10.16±0.99;糖尿病(),28.38±3.6;糖尿病与胰岛素治疗(),12.64±3.59)。

3.2。意思是收缩压(SBP)和肾小球滤过率(gfr)测量

SBP随时间增加₂老鼠RKO报道(8)(图2(一个)),高血压的发展出现糖尿病(图的独立2 (b))。例如,糖尿病,4周后没有进一步增加SBP的WT或₂老鼠RKO(图2 (b))(WT老鼠,控制(),112.5±5.78毫米汞柱;WT糖尿病(),111.40±4.51毫米汞柱;WT糖尿病胰岛素治疗(),114±4.27毫米汞柱;在₂老鼠,RKO控制(),130.04±7.00毫米汞柱;在₂糖尿病(RKO),132.20±5.62毫米汞柱;在₂糖尿病胰岛素治疗(RKO),128.97±1.28毫米汞柱)。

在₂老鼠RKO更高的肾小球滤过率(gfr) [(uL /分钟)/ BW (g)] FITC-inulin测量(图2 (c))(控制:42.74±4.3,();糖尿病56.10±4.9,();糖尿病与胰岛素治疗37.16±6.5,()在16周的年龄相比WT(控制:35.33±4.5,();糖尿病49.78±5.4,();和糖尿病胰岛素治疗38.93±5.56,())。因此,在发生肾反渗透法₂老鼠RKO,这可能导致高血压的发展。

3.3。肾形态和细胞凋亡

细胞外基质(ECM)蛋白质积累在肾小球和肾小管细胞凋亡是糖尿病肾病的关键特性。相比WT动物16周时,₂老鼠RKO显示增加ECM积聚在肾小球(数字3(一)-3(b), PAS染色)和tubulointerstitium(数字3(c)和3马森(d),三色的染色)upregulation肾胶原IV mRNA水平(图3(e)),以及管状细胞凋亡(图4TUNEL分析)。这些特性在糖尿病动物和部分进一步明显减毒来组WT和₂RKO老鼠。

3.4。ROS生成

血红素加氧酶1 (HO-1)是一种氧化stress-inducible酶,赋予细胞氧化应激体内,先前报道(25]。相比WT老鼠在16周时,HO-1表达式,如被包含IHC(图5(一个))和免疫印迹(图5 (b)),在RPT细胞的显著增加₂老鼠,RKO这在糖尿病增加更明显,避免了在来₂RKO老鼠。

我们证实了肾HO-1包含IHC导致新鲜孤立rpt 3子组的₂和WT老鼠通过测量ROS生成RKO根据lucigenin方法(20.,21,24]。WT动物相比,ROS生成在新鲜分离rpt显著增强₂老鼠RKO(图5 (c)),这个ROS海拔更引人注目的糖尿病和减毒来₂老鼠RKO(图5 (c))。此外,正如与控制WT老鼠相比,p47phox mRNA (NADPH氧化酶的组件)似乎在rpt的调节₂老鼠,RKO这upregulation似乎更深刻的糖尿病条件(图5 (d))。

3.5。激活Intrarenal拉

首先,我们评估了基底RAS-Agt的几个关键组件,₁R、ACE和ACE2-by RT-qPCR和免疫印迹新孤立rpt WT和₂RKO老鼠。WT动物相比,intrarenal RAS基因,也就是说,Agt,₁R,王牌,有所增加,但ACE2在rpt在下降₂老鼠RKO(图6)。

建立糖尿病肾病发展和intrarenal RAS激活之间的联系更完全,我们评估包含IHC intrarenal RAS基因的3组动物的肾脏₂和WT RKO老鼠。增强Agt WT老鼠相比,₁R,糖尿病肾脏的ACE更引人注目₂RKO。例如,海拔Agt蛋白表达主要是局部在近端小管(数字7(一)和7 (b))。在₁R检测在近端小管和小intrarenal船只(数字7 (c)和7 (d))与血管近端小管腔的一侧(数字8(一个)和8 (b))。增加Agt,₁R, ACE表达似乎是部分的肾脏来改善动物(图7和图8)。

相比之下,ACE2基因表达明显下调的rpt₂老鼠RKO(图6)。尽管其表达相似位置的王牌,ACE2 rpt的显著下降₂老鼠,RKO但在糖尿病肾脏的相对增加₂老鼠RKO(图8 (c)和8 (d)),与之前报道一致counterregulatory ACE和ACE2之间的相互作用,可能参与高血压的糖尿病(13,14,26]。

4所示。讨论

目前的研究检查的潜在机制的功能作用(s)₂R缺乏在I型糖尿病肾病的发展。在₂R缺乏加速发展的DN,它似乎是介导的,至少在某种程度上,通过升高氧化应激和ACE / ACE2在rpt比率。

与完善的功能的影响₁R在DN,目前很少有数据有关的角色₂在糖尿病和R DN发展。它被假定的作用₂R可能平衡的作用₁R在高血压和肾脏疾病。例如,激活的₂R导致血管舒张(27)(例如,可能通过激活bradykinin-cGMP-nitric氧化物(NO)通路(28)和抑制肾素的生物合成和释放肾球旁细胞(28];这些导致血管舒张和尿钠排泄,从而降低血压,调节尿钠排泄(例如,可能通过肾多巴胺能系统,肾钠排泄的重要系统的控制和血压)(29日),并导致抗增殖/ proapoptotic反应[30.]。因此,它似乎是合理的₂反对在R可能counterregulatory作用₁R-mediated血管收缩,但这种机械的结论主要基于研究的拮抗剂₂PD123319, R是用来阻止₂R函数(29日]。在这方面,在一个模型₂R是熔化的,如₂老鼠,RKO一直急切地用于确定是否激活₂R是重要的糖尿病肾病的进展。如果是这样,操纵₂R可以作为一种很有潜力的治疗策略在DN。

我们的研究观察证实,相比WT动物,₂增强RKO肾纤维化(31日]。经过4周的糖尿病₂发展RKO DN的明确证据,显示肾脏肥大,管状细胞凋亡,阻力指标ECM也许可以和进步积累肾小球和蛋白质以及增加肾小球滤过率(GFR),这表明缺乏₂R可能加速DN的进步发展。

有几个可能的机制的不足₂R加速发展的DN。首先,肾反渗透法(一个关键组件导致内皮功能障碍和系膜拉伸)增加肾小球滤过率(GFR)是早期DN的标志32]。与WT动物相比,有明显的反渗透法₂在糖尿病小鼠RKO;我们推测,这个明显的反渗透法有助于高血压的发展和DN中观察到₂小鼠RKO或没有糖尿病。然而,我们的数据与报告Sourris et al。33人声称降低肾小球滤过率(gfr)被认为在糖尿病₂RKO老鼠。这些不同的结果可以解释为技术差异研究是如何进行的:(1)肾小球滤过率(GFR)我们直接测量,使用的作者,另一组尿白蛋白排泄率(AER)和肌酐清除率评估肾小球滤过率(GFR);(2)4周的动物是糖尿病,而他们患有糖尿病为24周。因此,DN的阶段没有可比性。Jerums et al。32)最近回顾了爱尔兰的评估和肾小球滤过率(GFR)在糖尿病肾病,表明爱尔兰是动态的变化,而肾小球滤过率(GFR)的变化通常是进步;另外增加在爱尔兰一般,肾小球滤过率(GFR)下降[之前32]。

第二,罗斯特et al。34通过在]表明,Angⅱ₂年龄在足细胞移植愤怒R(受体)生产、致病因素在糖尿病肾损伤的关键。最近,Sourris et al。33)报道,过度的愤怒主要通过adenovector-based构建增强超氧化物系膜细胞培养一代有明显下降₂R表达;在₂小鼠表现出明显高于肾RKO过氧化物生产新鲜切碎的肾皮质相比与WT动物;然而,提高肾在过氧化物生产₂RKO仍受糖尿病影响。然后,他们假定愤怒病原相互作用,₂R不足,ROS生成可能会影响糖尿病肾损伤的发展。

以前,我们证明了intrarenal RAS激活和高葡萄糖通过活性氧生成可能一致的行动来增加近端肾小管细胞(rpt)细胞凋亡阻力指标纤维化也许可以和糖尿病、系统性高血压的独立(16,17]。在目前的研究中,我们观察到肾皮质中ROS生成rpt的显著增强₂评估的老鼠RKO HO-1表达式,我们我们观察的新孤立rpt进行验证₂RKO老鼠。这个海拔ROS在糖尿病肾脏的更加明显₂老鼠和RKO减毒来的动物。

NADPH氧化酶在DN的ROS生成中起着重要的作用。(NADPH氧化酶由几种膜结合型子单位gp91phox、氮氧化物和p22phox)和胞质单元(p47phox和p67phox)。据报道,介导的氧化应激在糖尿病肾病,至少部分通过p47phox激活(35,36]。通过qPCR分析,我们发现,与控制WT老鼠相比,p47phox mRNA似乎在rpt的调节₂老鼠,RKO这upregulation似乎更深刻的在糖尿病状态。综上所述,这些数据显示₂R缺乏rpt intrarenal ROS生成增加,导致加速进步的DN。

第三,尽管功能链接ACE2-Ang - (1 - 7) mas在心脏(轴,氧化应激是明显37),ACE2表达的作用,高葡萄糖/ Ang II-induced ROS生成在肾脏病理生理学还没有建立37- - - - - -39]。到目前为止,证据表明,重组人类ACE2防止Ang II-induced高血压、肾脏氧化应激,阻力指标纤维化(也许可以和40)衰减糖尿病肾损伤在秋田老鼠与降低血压和降低NADPH氧化酶活性(41]。因为在₂R抑制ACE活性(15部分),这可能构成₂R衰减的正日益认识到的问题₁R-mediated行动,另一方面,我们推测₂R可能增加然后减少ACE / ACE2 ACE2活动比率,以防止糖尿病肾损伤。我们的数据从这个研究进一步测试和支持这一假设在活的有机体内模型。

intrarenal RAS的关键组件,包括Agt,₁R,王牌是显著的调节,而ACE2表达下调,肾近端小管的₂老鼠相比,RKO WT动物。此外,海拔₁R,见小intrarenal船只,也有利于发展的DN。此外,经典的RAS基因表达(即增加。Agt,₁R, ACE)是糖尿病在进一步加强₂老鼠RKO,表情特别减毒的肾脏来的动物。综上所述,这些数据表明,intratubular Ang II在近端小管的增加₂有或没有RKO糖尿病;ACE / ACE2比率的增加可能会加速,至少在一定程度上,有利于发展的DN。

总之,我们的研究结果表明,缺陷的₂R,增强或加速糖尿病肾病的发展是介导的,至少在某种程度上,通过升高活性氧生成和激活intrarenal RAS rpt ACE2基因表达的差别,对这些基因的基因。

缩写

王牌:	血管紧张素转换酶
ACE2:	血管紧张素转换enzyme2
爱尔兰:	白蛋白排泄率
Agt:	血管紧张肽原
Angⅱ:	血管紧张素ⅱ
在1R和在2接待员:	Angⅱ受体类型1和2
在2:RKO	在2R基因敲除
英国石油公司:	血压
BW	体重
DN:	糖尿病肾病
ECM:	细胞外基质
FITC:	异硫氰酸荧光素
肾小球滤过率(GFR):	肾小球滤过率
HO-1:	血红素oxygenase-1
包含IHC:	免疫组织化学
千瓦:	肾脏重量
不是:	高碘酸希夫
愤怒:	受体的年龄
拉:	肾素-血管紧张素系统
ROS:	活性氧
rpt:	肾近端小管
RT-qPCR:	Real-time-quantitative聚合酶链反应
SBP:	收缩压
STZ:	链脲霉素
TUNEL:	Transferase-dUTP-nicked-end标签
WT:	野生型。

确认

作者承认这种礼物的₂R基因敲除小鼠(₂(RKO)从佐藤Inagami博士(范德比尔特大学医学院生物化学系,纳什维尔,田纳西州,美国)。谢谢约翰博士也由于道。陈(CRCHUM-Hotel-Dieu、蒙特利尔、QC、加拿大)和朱莉·r·Ingelfinger博士(美国马萨诸塞州总医院、波士顿、质量)对他们无条件的支持和讨论这个项目,由昏聩de la矫揉造作的en支持魁北克桑特(FRSQ chercheur-boursier Shao-Ling Zhang博士第二初级基金)。奥维德的社论援助达席尔瓦和研究支持办公室,CRCHUM承认。