渗透性和葡萄糖调节不同培养小鼠足细胞醛糖还原酶活性

文摘

足突细胞损伤与许多肾脏疾病的进展,包括糖尿病肾病。在这项研究中,我们调查了是否醛糖还原酶(AR)、酶与糖尿病并发症在不同的组织,是由高调制在足细胞葡萄糖和渗透性。AR信使rna、蛋白质表达和活性测定小鼠足细胞培养在正常和高渗透性和葡萄糖6小时至5天。Hyperosmolarity强烈刺激AR表达和活动,后续增加AR表达,但减少的活动。高葡萄糖也AR蛋白水平升高;然而,这并不是伴随着各自的酶激活。此外,高葡萄糖似乎抵消AR的osmolarity-dependent激活。总之,在足细胞基于“增大化现实”技术是由葡萄糖和高渗透性增加调制方式不同。转译后的事件可能会影响基于“增大化现实”技术的活动独立于酶的蛋白质数量。激活的基于“增大化现实”技术的足细胞可能参与糖尿病podocytopathy。

1。介绍

醛糖还原酶(AKR1B1 EC.1.1.1.21,简称AR) aldoketo还原酶超家族的一员,催化醛的减少广谱,用NADPH作为辅助因子。特定的基于“增大化现实”技术的基板包括饱和和不饱和醛如孕激素,isocorticosteroids,来自biogenc醛胺、甲基乙二醛,和其他有害代谢物(1- - - - - -3]。酶与不同丰度分布在不同的组织4]。基于“增大化现实”技术的多样性衬底类型及其广泛的组织分布表明,AR的生理角色之一可能是内生的解毒和异型生物质醛。进一步假设这种酶的角色包括细胞免受氧化和渗透压力(5]。高活性的抗氧化防御包括减少脂质过氧化产生的醛(6,7),以及减少谷胱甘肽共轭不饱和醛(8]。AR的osmoprotective作用与减少葡萄糖的山梨糖醇的细胞内浓度抵消细胞外的渗透压。生理机制的重要性,尤其在肾髓细胞中,AR活性和蛋白质合成高引起的细胞外氯化钠浓度(9,10]。

葡萄糖,以其明显的公里50 - 200毫米的3),是基于“增大化现实”技术的一个贫穷的衬底。异常高细胞内糖需要触发醛糖还原酶通路。结果是,山梨醇和进一步果糖,葡萄糖转化为具有丰富NADPH消费。主要途径包括氧化应激诱导的细胞毒性效应减弱的谷胱甘肽,细胞内山梨糖醇积累,和水平的提高果糖及其代谢物。最后,越来越多的证据显示基于“增大化现实”技术可能是通过影响NF -参与炎症反应κB-dependent细胞因子和趋化因子的表达11,12]。

在肾脏中,最高的表达和AR髓中地区的活动。在肾皮质丰富的酶与髓质相比非常低,以及其他各种组织(4,13]。然而,详细研究了基于“增大化现实”技术的出现在系膜细胞(mc)和肾小球足细胞的(14- - - - - -16]。增加酶的表达已经证明在糖尿病患者的肾小球17),信使rna和AR活性都升高大鼠系膜细胞培养在高葡萄糖18]。

而接受,醛糖还原酶是参与糖尿病的发病机理glomerulopathy [19- - - - - -22在足细胞),其作用尚未研究。足细胞终末分化细胞,肾小球基底膜与脚然后流程通过狭缝横隔膜连接。他们发挥重要作用在维持肾小球过滤和生产间质和血管内皮细胞生长因子。由于其有限的增殖能力和补充失去的细胞,足细胞损伤被认为发挥核心作用的发展多数肾小球疾病(23]。鉴于最近发现似乎在糖尿病患者的upregulation AR通路可能导致有害的足细胞的变化。本研究旨在探讨高葡萄糖和渗透性的影响,影响肾小球细胞在糖尿病的两个主要因素,在足细胞AR的表达和活动。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和实验协议

有条件地永生的小鼠足细胞(n博士克隆SVI、慷慨的礼物,好,格赖夫斯瓦尔德大学、德国)是培养如前所述24]。分化细胞生长在一个标准的RPMI1640中含有5%的边后卫,100 U /毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升(Sigma-Aldrich)。零次足细胞转6、12、24、48小时内,或者5天实验媒体:NG-Nosm(正常葡萄糖,正常渗透性)含有葡萄糖5.5毫米和285 mOsm / L, NG-Hosm(正常的葡萄糖,高渗透性)含有葡萄糖5.5毫米和385 mOsm / L, HG Nosm 30毫米(正常血糖高,渗透性)含有葡萄糖和285 mOsm / L和HG-Hosm(高葡萄糖、高渗透性)包含30 mM的葡萄糖和385 mOsm / L。实验媒体是基于RPMI1640没有葡萄糖(Sigma-Aldrich)通过添加甘露醇和渗透性调整。所有的媒体都补充了5%的边后卫和抗生素,如上所示。渗透性是检查使用蒸汽压渗压计(Wescor生物医学系统VAPRO 5520年,法国)。

之前的研究已经证实,培养人类胚胎肾细胞(HEK)迅速利用葡萄糖,在24小时内可能导致葡萄糖饥饿,endoplasmatic网压力,underglycosylation众多蛋白质(25]。因此,使用一个Accu-Chek,罗氏应用科学)我们估计中葡萄糖含量的变化NG和HG媒体为0,从足细胞培养24和48小时(表1)。根据结果,48小时间隔为替代实验选择媒体。

2.2。隔离和醛糖还原酶活性测定

在表示时间,培养瓶放在冰,实验媒体被丢弃,400μ包含(mM) 50 L冰冷的裂解缓冲消息灵通的pH值(7.2),2德勤5 EDTA, 1片/ 10毫升蛋白酶抑制剂鸡尾酒(完整的迷你,罗氏应用科学)被添加到每个瓶。细胞被取消了,转到埃普多夫管,和离心机+ 4°C, 14000 rpm 30分钟(埃普多夫离心机5810 r)。得到的上层清液储存在−80°C,除了25的整除μL使用立即根据布拉德福德蛋白质测定方法(26]。牛血清白蛋白作为标准。

活动的基于“增大化现实”技术的决心spectrophotometrically (Ultrospec 3000)在37°C如前所述10]。在所有的测试组,观察稳定的吸光度下降反应开始后10分钟(数据没有显示)。因此,测量进行了6分钟的存在和缺乏D, L-glyceraldehyde纠正未指明的NADPH还原酶活动(27]。基于“增大化现实”技术的游戏活动规范化表达的蛋白质含量和μ/μ每分钟每g (nmol NADPH氧化μg蛋白),基于摩尔吸光系数为6220⁻¹·厘米⁻¹。

2.3。免疫印迹分析

使用标准执行免疫印迹技术。总之,trypsynized细胞在2000转离心10分钟+ 4°C;产生的颗粒细胞溶解在缓冲冰(pH值8.0)含1%诺乃清洁剂p 40, 20毫米三,140毫米氯化钠,2毫米EDTA、10%甘油,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(完整的迷你,罗氏应用科学)和离心20分钟在14000 rpm + 4°C。15微克的总蛋白受到sds - page电泳和转移。PVDF Immobilion膜蛋白(美国微孔,贝德福德,MA)与主要抗体探测AR(1: 400年,兔多克隆,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国),α光滑的肌肉肌动蛋白(1:2000年,鼠标单克隆,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)其次是碱性phosphatase-labeled二级抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白和山羊anti-mouse免疫球蛋白,圣克鲁斯生物技术公司)。想起了复合物5-bromo-chloro-3-indolyl磷酸(BCIP)和硝基蓝四唑(电视台;Sigma-Aldrich)和拍摄UVP BioImaging gds - 8000系统(UVP Inc .,高地,CA),使用4.0进行图像采集和分析软件。

2.4。RNA隔离和逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

总RNA提取每种文化样本使用三试剂(Sigma-Aldrich)根据制造商的指示。RNA纯度和浓度测定通过测量光密度在260 nm和280 nm。两个微克反向转录的RNA在37°C使用0.1 60分钟μM反义底漆,5 U /μL亲逆转录酶(WI Promega,麦迪逊,美国),0.5毫米deoxynucleotide三磷酸的混合物(核苷酸),和1 U /μL核糖核酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)。PCR一步是使用2.5 U Maxima热态启动执行Taq DNA聚合酶(Fermentas Int Inc .),与20μ产品和80 L RTμ包含0.1 L PCR混合μM底漆。引物序列和PCR扩增条件如表所示2。控件包含水的RNA是包含在所有的实验,给负面结果。PCR产品(18μL / lane)决定ethidium bromide-stained 1.4%琼脂糖凝胶,观看和拍摄紫外线透照器(UVP Inc .,高地,CA)。

2.5。微

乐队的光学密度的半定量的分析使用数量执行一个软件(Bio-Rad、大力神、钙、美国)和规范化β肌动蛋白(rt - pcr)或α-smoth肌肉肌动蛋白(免疫印迹)。

2.6。流式细胞术

与PBS孵化项目后,这些细胞被洗,使胰蛋白酶化,悬浮在PBS和离心两次7分钟在室温下。1毫升的颗粒被resuspended感冒permeabilizing缓冲区(美国Ebioscience),孵化30分钟在室温下,离心机和洗1毫升洗涤缓冲(WB)(美国Ebioscience)。最后,细胞/管彩色60分钟在室温下与1:100稀释兔抗体AR(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)。Antigen-bound抗体被40分钟孵化与可视化1:100稀释Alexa488-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白(分子探针,尤金,或者美国)。染细胞被洗了1毫升世行500年resuspendedμL PBS和分析流式细胞分析仪(第二章流式细胞分析仪,BD,美国)。基于单细胞荧光强度的测量,任意选择AR-positive细胞。对于每个选定的人口,意味着荧光指数(MFI)确定使用流式细胞仪天后软件(美国BD)。消极的控制显示permeabilized足细胞的荧光可忽略不计。

2.7。免疫细胞化学

采用免疫分析,足细胞种植在collagen-coated圆玻璃盖滑24-well文化板块包含实验媒体,表示之前。如前所述执行免疫细胞化学(28]。简单地说,这些细胞被固定(2%多聚甲醛),permeabilized Triton x - 100年(0.3%),和孵化屏蔽解决方案(2%胎牛血清,2%牛血清白蛋白,0.2%鱼明胶,在PBS) 60分钟。其次是孵化项目,60分钟主要兔抗体AR(1: 100年,圣克鲁斯生物技术有限公司)和二次45分钟anti-rabbit免疫球蛋白与Cy3共轭(1:200年,罗克兰免疫化学公司Gilbertsville, PA,美国)。非特异性染色则由取代初级抗体阻断独自解决方案。f -肌动蛋白染色使用1:200 Alexa 488 - phalloidin共轭(分子探针,尤金,或者美国)。凋亡细胞核DNA被发现凝结,用1μg / mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI、默克化工)。所有抗体和污点被稀释在屏蔽解决方案。封面都安装在显微镜幻灯片使用15% Mowiol解决方案(Calbiochem拉霍亚,CA)和染色细胞荧光显微镜下分析(奥林巴斯IX51),使用cellSens v.1.3成像软件(奥林巴斯)。

2.8。统计分析

所有的数据提出了从3到5独立意味着±SEM实验。统计分析使用SigmaStat(3.0版。对于Windows;美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。使用学生的数据进行分析以及比较。统计学意义是表示。

3所示。结果

3.1。时间在足细胞的基于“增大化现实”技术的活动

在NG-Nosm细胞中,基于“增大化现实”技术的活动在整个培养时间(图仍然保持不变1)。相比之下,hyperosmolar条件刺激的活动AR NG细胞达到峰值水平(与μ/μ在NG-Nosm g,)已经经过6个小时的潜伏期。此后,逐步减少观察,48小时后达到Nosm水平。另一方面,在6小时后HG介质只有轻微的增加的基于“增大化现实”技术的活动。5天后到达的水平只比NG-Nosm组高1.2倍。时间过程中酶活性的变化在HG足细胞从类似,normo -和hyperosmolar媒体这表明高葡萄糖中和刺激效应引起的高渗透性NG细胞。

3.2。增加渗透性对AR蛋白表达的影响和活动

半定量的免疫印迹分析的细胞在每个孵化时间进行检查是否观察到的变化在AR活性与酶蛋白表达的变化。短期的影响(6小时)和长期(5天)博览会实验条件被流式细胞术进一步检查。光密度定量获得37 kDa乐队透露,在hyperosmolar条件下,6小时后孵化AR (NG足细胞的表达明显升高%,对NG-Nosm)(图2(一个))。定量流动仪分析(图2 (c))取得了类似的结果,表明基于“增大化现实”技术增加了% ()。分别酶活性增加%,而NG-Nosm细胞(图2 (b))。然而,尽管AR蛋白表达在NG-Hosm细胞仍在整个期间活动增加的酶降至24小时后的基础水平。相反,无显著的变化表达或活动的基于“增大化现实”技术观察HG足细胞暴露于渗透性增加。

Immunofluorescent染色5天后孵化证实AR的表达NG-Hosm足细胞是调节细胞溶质,相比NG-Nosm HG-Hosm细胞(图3 (b))。NG-Nosm细胞表达明显细胞核周围的池的基于“增大化现实”技术的其他地区相对较弱的染色胞质区域(图3(一个))。在NG-Hosm足细胞,基于“增大化现实”技术的强烈彩色在细胞体内扩散模式。高渗透性的f -肌动蛋白细胞骨架NG没有明显影响细胞。然而,NG-Hosm足细胞表现出更多的应力纤维,这是特别明显的孵化(图5天后3 (d))。

3.3。葡萄糖浓度对AR蛋白表达的影响和活动

在足细胞培养HG-Nosm媒体,AR蛋白显著增加(通过%,与NG-Nosm)早在6小时后转向高葡萄糖(数字4(一)和4 (c))。这种酶仍高在整个潜伏期。然而,这并没有增加酶活性(图将发生重大变革4 (b))。相反,在足细胞培养在HG - Hosm媒体,高葡萄糖抑制AR的表达,这种效应可以观察到在整个孵化。5天后,AR蛋白下降了%,相比NG-Hosm细胞。在第一次12小时HG的孵化,AR活性也抑制(通过%,与NG-Hosm 6 h),而不再孵化似乎扭转这种效果。

3.4。在足细胞AR mRNA的表达

来验证是否酶蛋白表达的变化反映了mRNA水平基于“增大化现实”技术,我们有反向转录从所有实验组织总RNA。结果rt - pcr分析显示,已经在基底(正常葡萄糖和渗透性)条件下,基于“增大化现实”技术的mRNA的表达在足细胞相对较高,与丰度与glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH,数据未显示)β肌动蛋白(图5(c))。因为高环境葡萄糖浓度可能影响GAPDH[的表达29日),为我们进一步的分析我们使用β肌动蛋白作为看家基因。肌动蛋白比较光密度比率(AR)各自的免疫印迹的rt - pcr产品表明,AR信使rna和蛋白质的表达相应的调制。类似于NG-Nosm细胞酶活性,AR mRNA和蛋白表达保持在一个恒定水平5天的孵化。增强(NG-Hosm和HG-Nosm细胞)或抑制(HG-Hosm细胞)表达AR蛋白(图5(b))是伴随着各自的mRNA水平变化(图5(d))。这可能表明,在我们的实验条件中,转录和翻译过程是同步的,而基于“增大化现实”技术活动的调节可能归因于转译后的酶的修改。

4所示。讨论

在我们目前的研究表明,在培养的小鼠足细胞,表达和活性的醛糖还原酶(AR)是由高葡萄糖和hyperosmolarity调制方式不同。高渗透性单独诱导迅速但瞬时增加基于“增大化现实”技术的游戏活动(数据1,2 (b)),而只有轻微的激活酶的高葡萄糖被观察到。而NG-Hosm细胞从各自的孵化时间点,在第一次12小时孵化AR活性甚至压制的高葡萄糖(图4 (b)用并行蛋白表达下降(数字)4(一)和4 (c))。在多种细胞中,高血糖的条件已报告上调醛糖还原酶活性在活的有机体内和在体外(2,30.,31日]。除了许多与它相关的有害影响激活(5有益的角色归因于AR),包括保护细胞对单糖进行渗透(32和氧化33,34)压力。然而,类似于我们的研究结果发现,降低AR蛋白已经被报道在hyperosmolar HG小鼠足细胞培养介质两周(35)和动脉内皮(36]。反过来,高glucose-induced损失的基于“增大化现实”技术的活动被发现在上皮厚提升肢体亨利的循环37]。在我们的实验中,高葡萄糖不仅中和AR HG-Hosm细胞的激活也削弱了AR HG-Nosm足细胞的活动,尽管调节酶蛋白(数字1,4(一),4 (c))。这个矛盾的机制效应还不清楚。基于“增大化现实”技术的活动可能是抑制细胞内积累山梨糖醇。然而,尽管一些作者观察到这样的抑制(9),其他国家,这种酶并不表现出反馈抑制(38]。另一个可能性是glucose-induced细胞毒性(39足细胞中观察到的)在活的有机体内和在体外(40)占测量AR活性的下降。然而,在我们的实验中,核DAPI染色并没有透露任何迹象测试细胞组的细胞凋亡。也有可能在高葡萄糖环境酶被转译后的修改的影响。的一个主要分子机制与高血糖细胞损伤诱导的蛋白激酶C (PKC)亚型41]。多个PKC之间的相互关系和基于“增大化现实”技术的描述,包括磷酸化和易位的基于“增大化现实”技术的线粒体(42]。在高葡萄糖环境,PKC介导的激活NF -κ反过来,B,它可以调节AR基因的转录43]。PKC以来发现的足细胞(44,45),这种机制也可以负责AR表达增加HG-Nosm细胞。另一方面,基于“增大化现实”技术的酶活性是redox-sensitive由于半胱氨酸残基的存在(半胱氨酸- 298)附近的活性部位(46]。氧化和S-thiolation残留的调节酶的动力学和活动(5,47,48]。因此可能高glucose-induced氧化应激在足细胞49,50]可能扰乱细胞内氧化还原状态导致抑制AR。转译后的修改的基于“增大化现实”技术还可能涉及到一个相互作用activatory S-nitrosylation半胱氨酸- 298的一氧化氮(NO)和抑制性glutathiolation S-nitrosylated AR (51]。此外,博览会高葡萄糖抑制没有合成在活的有机体内和在体外(52,53]。因此,消耗的生物利用率不可能损失的基于“增大化现实”技术活动的另一个原因在足细胞孵化HG的媒介。据报道之前,足细胞表达神经元(54)以及诱导(55]形式的一氧化氮合成酶;因此这样的自分泌/旁分泌调节没有不能排除的基于“增大化现实”技术。

与高葡萄糖,hyperosmolarity似乎明显刺激AR活动在NG足细胞(数字1和2 (b))。这并不令人感到意外,因为渗透压力被认为是AR表达的主要监管机构,和醛糖还原酶被称为“过度紧张应激蛋白”(56]。在老鼠和人类AR序列启动子区域,渗透反应元素(矿石)序列被发现57,58)和醛糖还原酶的诱导响应增加渗透性在众多的肾和nonrenal细胞(10,15,59,60]。此外,类似于足细胞,肾小管上皮细胞和雪旺细胞诱导AR发生在响应渗透压力而不是高葡萄糖本身(61年,62年]。然而,在我们的实验中,效果似乎是相对短暂的。尽管AR蛋白与孵化时间增加Hosm条件(图2同时),酶活性下降。而AR表达之间的正相关和活动在一些细胞类型(62年,63年),差异被发现在其他(64年,65年)这表明激活酶的外生因素可以独立发挥作用的蛋白质水平。有两种形式的本地基于“增大化现实”技术,其中一个(不活跃),另一个减少氧化(主动)66年- - - - - -69年]。由于甘露醇是发挥抗氧化作用,延长潜伏期的足细胞mannitol-containing hyperosmolar介质可能有利于酶的简化形式。也是诱人的猜测hyperosmolarity-induced细胞内谷胱甘肽耗竭可能刺激足细胞跨膜运输胱氨酸。的l -胱氨酸为了补充细胞内谷胱甘肽水平已被证明在不同的细胞和器官,包括肾脏(70年,71年]。然而,胱氨酸、半胱氨酸- 298通过绑定,也可以直接灭活醛糖还原酶(72年]。跨膜运输胱氨酸发生通过谷氨酸转运蛋白(Na⁺端依赖运输)或谷氨酸/胱氨酸逆向转运(71年脑组织中尤其丰富。到目前为止,这些转运蛋白在足细胞被发现。然而,足细胞已被证明具有差异化的氨基酸运输系统(73年)包括水泡谷氨酸转运体(74年,75年),和最近的研究结果揭示越来越足细胞和神经细胞之间的相似之处。似乎因此合理,glutamate-dependent胱氨酸运输也可能出现在足细胞。然而,这个概念还没有被证明。

相对较高的基底AR mRNA表达(图5(c))可能表明,足细胞装备精良代谢不仅有毒的醛形成细胞内,而且不同plasma-derived内生和异型生物质醛在过滤过程中,可能穿过细胞膜。突出的表达AR蛋白之前已经观察到大鼠和牛足细胞76年,77年]。这样的组成型表达的酶可能允许足细胞迅速相应地调整其AR系统当前溶质成分和/或渗透性。然而,在高血糖,调制AR的表达和活动可能导致肾小球损伤的发病机制。糖尿病,增加血糖升高血浆同渗重摩。根据我们的HG-Hosm结果,podocytic AR活性可能是抑制,这可能损害antiosmotic国防和导致足细胞脱落。另一方面,增加了AR蛋白表达的足细胞似乎是膜性肾病患者的一个主要抗原(16]。因此,osmolality-dependent海拔AR蛋白在肾小球足细胞可能引发炎症反应。醛糖还原酶也已被证明能够调节肿瘤坏死因子等细胞因子的生产α(肿瘤坏死因子α)和血管内皮生长因子(VEGF)在肾和血管平滑肌细胞(5,21,48,78年]。在肾小球足细胞VEGF的著名来源(79年),肿瘤坏死因子α(80年),以及其他的细胞因子。他们的表达不仅导致足细胞完整性和生存也调节其他肾小球和管状细胞的功能。似乎在糖尿病条件下,调制的基于“增大化现实”技术的足细胞可能是必不可少的生产因素负责监管肾小球屏障结构和渗透性。此外,多发地应该考虑基于“增大化现实”技术的影响,如氧化损伤、山梨糖醇积累,或者生产过剩的果糖5,48]。

总之,这些结果表明,在培养足细胞醛糖还原酶是由两个高葡萄糖和高渗透性。此外,AR蛋白表达的细胞变化不一定对应的酶活性的变化。高葡萄糖仅AR蛋白水平升高,并没有伴随着各自的酶激活。高渗透性反过来刺激活动和AR的表达在足细胞已经在第一小时的博览会。然而,尽管AR蛋白仍在整个孵化的时间增加,酶的活性与此同时下降。这表明,在足细胞转译后的事件可能会影响基于“增大化现实”技术的活动独立于酶的蛋白质含量。调制的AR-dependent足细胞的代谢途径可能参与糖尿病podocytopathy pathomechanisms。

确认

这项工作是支持的格但斯克的医科大学法定授权St-54 a Rybczyńska和批准号N N401 63 12 40来自波兰的国家科学中心a段口诀。部分的结果就像海报在国会的德国肾脏病学会(DGfN), 2011年柏林。作者要感谢Aleksandra Zurowska教授,儿科和青少年肾脏学和高血压,格但斯克的医科大学,帮助准备这手稿。

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