文摘

糖尿病最终结果不足数量的功能性胰岛β细胞。增强扩散功能内生β细胞治疗糖尿病仍未开发。在这里,我们报告的切除即基因功能丧失的突变会导致遗传性多发性内分泌瘤1型(即),呈现抵抗体外tamoxifen-inducible和暂时控制高血糖即切除小鼠模型以及在一个特定组织即切除小鼠模型。即切除阻止小鼠体外高血糖主要通过增加β细胞功能的数量。BrdU合并由β细胞、胰岛大小和循环胰岛素水平显著提高即切除老鼠。膜葡萄糖转运蛋白2的定位主要是保存在即切除β细胞,但不是即表达β细胞。menin镇压我们的研究表明,蛋白质编码的即基因,可能是一种有价值的手段维持或增加功能内生β细胞的数目,以防止或改善糖尿病。

1。介绍

胰腺β细胞对葡萄糖感应很重要,胰岛素生产和分泌,因此,对维护至关重要的血糖水平在正常范围内<一个href="#B1">1,<一个href="#B2">2]。1型糖尿病(近年来)和2型糖尿病(T2D)最终结果从一个数量的不足在胰岛功能产生胰岛素的β细胞。近年来自戏剧性autoimmune-inducedβ细胞损伤(<一个href="#B1">1由于胰岛素抵抗),而T2D发展以及数量相对不足的β细胞(<一个href="#B3">3]。胰岛素生产最终在近年来维持正常的血糖水平不足或T2D,导致高血糖症和继发性并发症,包括心血管疾病、肾脏功能障碍,和失明<一个href="#B1">1,<一个href="#B3">3,<一个href="#B4">4]。而通过免疫调节疗法或改善胰岛素敏感性显示承诺对预防或逆转高血糖的影响(<一个href="#B5">5- - - - - -<一个href="#B8">8),如何促进增殖或内生β细胞的再生功能促进β细胞功能的数量需要进一步调查。只有少数的基因已经被证明能够影响高血糖糖尿病小鼠模型的发展。例如,过度的igf - 1在胰腺β细胞防止链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病(<一个href="#B9">9]。消融的 2 7 1 / 1 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,增加β细胞的数量,防止高血糖的发展db / db老鼠(<一个href="#B10">10]。删除Lkb1,一个肿瘤抑制激活活化蛋白激酶,促进β细胞增殖,防止高脂饮食小鼠葡萄糖耐受不良(<一个href="#B11">11]。然而,这些基因可以调节多种类型的细胞的增殖(<一个href="#B12">12,<一个href="#B13">13]。需要优先评估基因影响β细胞增殖/再生为了预防或治疗糖尿病。

Menin核蛋白质编码即基因突变在家族性多发性内分泌瘤1型(即)患者(<一个href="#B14">14]。Menin可以优先抑制细胞增殖在内分泌组织包括胰腺β细胞(<一个href="#B15">15,<一个href="#B16">16]。虽然β细胞增殖和血胰岛素水平增加后很长一段时间即切除在β细胞(<一个href="#B15">15,<一个href="#B17">17,<一个href="#B18">18),被称为是否即切除在很短的时间内可以防止高血糖糖尿病小鼠模型的发展和它的底层机制。

STZ是葡萄糖模拟,它选择性地结合葡萄糖转运蛋白2 (GLUT2),β细胞中的蛋白质局部膜,转入β细胞(<一个href="#B19">19,<一个href="#B20">20.]。STZ诱导β细胞损伤,模仿在近年来发现的β细胞功能的丧失和T2D<一个href="#B20">20.- - - - - -<一个href="#B23">23]。在目前的研究中,我们使用多个低剂量链脲霉素- (MLD-STZ)诱导糖尿病小鼠模型和确定的影响即切除STZ-induced高血糖(<一个href="#B19">19,<一个href="#B22">22]。我们发现即切除预防STZ-induced高血糖,至少部分是通过促进β细胞增殖和保护β细胞功能的数量和循环胰岛素水平。这些发现表明,menin调节β细胞增殖是至关重要的在活的有机体内而且有可能针对性的预防或治疗糖尿病。

2。材料和方法

2.1。老鼠

1 / ;Cre-ER老鼠所产生的交叉与液氧老鼠即( 1 / ,FVB / 129 sv)小鼠窝藏Ubc9 promoter-drivenCre-ERT2(129 sv / C57BL6J,埃里克·布朗博士的礼物)(<一个href="#B17">17,<一个href="#B24">24]。 1 / 老鼠,外显子3到8即两侧是两个loxP网站,请由弗朗西斯·柯林斯博士提供。 1 / ;RIP-Cre老鼠所产生的跨越液氧即老鼠老鼠表达Cre由老鼠insulin-2启动子(RIP-Cre,TgN (isn2 -cre)25内侧膝状核,杰克逊实验室)(<一个href="#B15">15]。只有雄性小鼠被用于以下实验。老鼠的基因分型是由PCR使用鼠标尾部DNA作为模板。为即:P1, 5′-CCCACATCCAGTCCCTCTTCAGCT-3′;P2, 5′-AAGGTACAGCAGAGGTCACAGAG-3′;P3, 5′-GACAGGATTGGGAATTCTCTTTT-3′。为Cre-ERT2:(F), 5′-ACACCAAAATTTGCCTGCATTACCGG-3′;反向(R), 5′-TTTCCATGAGTGAACGAACCTGGT-3′。为Rip-Cre:F, 5′-GCGGTCTGGCAGTAA AAACTATC-3′;R, 5′-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3′。所有老鼠实验通过大学实验动物资源和宾夕法尼亚大学动物保健委员会。动物保健依照执行机构的指导方针。

2.2。切除的液氧即轨迹用三苯氧胺(TAM)

1 / ;Cre-ER和他们同窝出生仔畜控制美联储TAM (MP生物医学)200毫克/公斤体重/天连续两天,休息一天,然后连续两天(<一个href="#B18">18]。

2.3。STZ-Induced高血糖

高血糖诱导了每天腹腔注射链脲霉素(i.p。)(σ)40毫克/公斤体重/天连续5天(<一个href="#B22">22]。溶解STZ STZ工作解决方案是刚做好的25毫米柠檬酸钠溶液(pH值4.0)后,立即注入每一个准备。血糖监测,直到最后一个剂量的注射STZ后4周。

2.4。生理测量

血糖水平从尾静脉血液化验血糖仪(OneTouch Lifescan)。用ELISA检测血清胰岛素水平胰岛素使用鼠标套件(晶体化学)。血清胰高血糖素水平测定RIA工具(Linco)。

2.5。疣状

BrdU 100毫克/公斤体重的ip注入老鼠他们牺牲前16到24小时。两到三个石蜡包埋胰腺部分(5μ米,至少100μ每个鼠标和基因型的m)沾affinity-purified menin蛋白抗体(1:500)(<一个href="#B25">25)、胰岛素(Abcam,1: 100),胰高糖素(Abcam, 1: 100), BrdU(准确的化学与科学,1:150),Pdx1(微孔,1:500)和GLUT2(微孔,1:200)。二次抗体用FITC (Abcam, 1: 200)和Alexa萤石546(表达载体,1:200)。图像捕捉到一个尼康Eclipse E800荧光显微镜和CCD数码相机。总胰岛素染色面积被MetaMorph量化软件(分子设备)。

2.6。统计分析

结果表示为 米 e 一个 n ± 年代 E 米 。一群比较,未配对的学生的 以及使用或秩和测试。 值小于。05were considered statistically significant.

3所示。结果

3.1。即消融使小鼠抵抗STZ-Induced高血糖

以确定的影响即切除对糖尿病的发展,我们评估是否即切除可以防止链脲霉素(STZ)使用条件诱导高血糖即基因敲除小鼠模型。生成 1 / ;Cre-ER老鼠,老鼠窝藏液氧即与老鼠窝藏一个交叉Ubc9 promoter-driven吗Cre-ERT2转基因(Cre-ER)[<一个href="#B17">17,<一个href="#B24">24]。由此产生的 1 / + ;Cre-ER老鼠和 1 / + 老鼠繁殖 1 / ;Cre-ER老鼠和他们的同胞( 1 / )被用于实验。检查的效率即切除的 1 / ;Cre-ER老鼠, 1 / 和 1 / ;Cre-ER老鼠TAM, menin蛋白水平在胰岛细胞免疫荧光染色法测定TAM喂养后4周。免疫染色显示的控制 1 / 老鼠,menin优先胰岛细胞的细胞核中表达与腺泡的细胞(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1(一))。Menin几乎没有可检测胰岛和腺泡的细胞 1 / ;Cre-ER老鼠,指示即基因有效地切除 1 / ;Cre-ER老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (b))。

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图1
消融的液氧即防止开发链脲霉素(STZ)诱导高血糖。(a)和(b)疣状menin(红色)和胰岛素(绿色),分别在胰岛细胞在老鼠TAM和STZ治疗。控制 1 / 和 1 / ;Cre-ER老鼠( = 8 老鼠)喂养三苯氧胺(TAM) 12周时在200毫克/公斤体重/天连续两天,休息一天,然后连续两天,如部分所述<一个href="https://static.hindawi.com/articles/jdr/volume-2010/876701/figures/876701/">2。4周后的最后剂量TAM喂食,老鼠牺牲和胰腺的部分 1 / (一)或 1 / ;Cre-ER老鼠(b) immunostaed menin蛋白和胰岛素。(c)实验设计的原理。控制 1 / ( = 1 8 老鼠)和 1 / ;Cre-ER老鼠( = 2 1 老鼠)TAM喂养12周时。4周后的最后剂量TAM喂食,STZ腹腔注射在40毫克/公斤体重/天连续5天。血糖监控直到注射STZ后4周。(d)和(e)疣状menin(红色)和胰岛素(绿色)在控制的小岛 1 / (d)和 1 / ;Cre-ER小鼠服用TAM (e),其次是注射STZ,图中描述<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig1/">1 (c)。收集pancreata STZ治疗后4周。(f)非空腹血糖水平,直到注射STZ后4周( = 1 8 21个老鼠)。规模的酒吧,25μm。* * *, < 。 0 0 1 。

然后我们管理多个低剂量STZ (MLD-STZ)控制即切除小鼠诱导β细胞损伤和糖尿病4周后即切除(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (c))[<一个href="#B19">19,<一个href="#B22">22]。免疫荧光染色显示,即是有效地切除的小岛吗 1 / ;Cre-ER老鼠比控制老鼠STZ治疗后4周(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (d)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (e))。在控制老鼠,nonfasting血糖水平开始上升早注射STZ后一周,最终达到400 mg / dL注射STZ后4周(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (f))。即切除老鼠,另一方面,整个期间没有出现高血糖的研究(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (f)),证明即消融防止STZ-induced高血糖。

3.2。即消融促进β细胞增殖和功能β细胞的数量增加

即确定底层机制即消融防止STZ-induced高血糖,我们决定在胰岛细胞组成,BrdU公司通过β细胞,胰岛大小,并在控制和循环胰岛素水平即切除小鼠注射STZ后4周。

免疫荧光染色显示数量和分泌胰岛素的β细胞百分比显著降低在小岛的控制老鼠(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(一个),<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (c)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (d)),如比即切除小鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (b)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (d))。这些发现表明,即切除保护β细胞免受STZ-inducedβ细胞损伤或功能β细胞的数量增加。BrdU公司通过β细胞,细胞增殖的标记,是更高的即切除的小鼠比控制老鼠(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (e)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (g)),这表明即切除增加β细胞的数量至少部分是通过促进β细胞增殖。符合增殖β细胞的数量增加即切除,胰岛素染色面积明显增大的即切除小鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (h))。随机的血胰岛素水平,控制和之间的相似即切除小鼠STZ治疗前,在注射STZ后两组(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(我))。然而,值得注意的是血胰岛素水平降低了~57%的控制即表达小鼠(之前,1.12 ng / mL和后4周,0.48 ng / mL,人物<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(我)),而只是减少了~34%即切除小鼠(之前,1.01 ng / mL和后4周,0.67 ng / mL,人物<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(我)),这表明STZ-inducedβ细胞损伤和赤字减少生产和/或分泌胰岛素即-exicsed老鼠。此外,血胰岛素水平显著提高即切除的小鼠比控制老鼠注射STZ后( < 。 0 5 ,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(我))。

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图2
消融的液氧即促进β细胞增殖,增加β细胞数量STZ-treated老鼠。研究设计是图中描述<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig1/">1 (c)。控制 1 / ( = 1 8 老鼠)和 1 / ;Cre-ER老鼠( = 2 1 老鼠)TAM岁喂养12周。4周后的最后剂量TAM喂食,STZ腹腔注射在40毫克/公斤体重/天连续5天。Pancreata和血清收集到的老鼠进行进一步分析,注射STZ后4周。(a - b)疣状胰岛素(绿色)和胰高糖素(红色)在控制的小岛 1 / (一)和 1 / ;Cre-ER老鼠(b)。核复染色使用DABI(蓝色)。(c)定量分泌细胞的数量在胰岛β细胞( = 8 老鼠)。(d)定量的百分比在胰岛β细胞( = 8 老鼠)。(e)和(f)疣状BrdU(红色)和胰岛素(绿色)在控制的小岛 1 / (e)和 1 / ;Cre-ER老鼠(f)。(g)的定量BrdU合并由β细胞( = 8 老鼠)。(h)定量胰岛素染色区( = 8 老鼠)。(我)非空腹血清胰岛素水平之前和注射STZ后4周( = 1 8 21个老鼠)。(j)血清胰岛素(ng / mL)比血糖水平(mg / dL),乘以10000。规模的酒吧,25μm。*, < 。 0 5 ;* * *, < 。 0 0 1 。

同样值得注意的是:控制老鼠,即使有严重的高血糖(~400 mg / dL,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (f)),没有分泌更多的胰岛素来降低高血糖水平(STZ后4周,0.48 ng / mL,人物<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(我)),表示一个非常明显的赤字在胰岛素的分泌和/或分泌控制老鼠STZ治疗后。相反,即使血液胰岛素水平即切除的小鼠比以前低4周后注射STZ (STZ之前,1.01 ng / mL;STZ后4周,0.67 ng / mL,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(我)),即切除老鼠normoglycemic (~150 mg / dL,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (f))。这些结果表明,胰岛素生产/分泌的即切除小鼠适当控制他们的血糖水平在正常范围内,近正常血糖水平没有触发更多胰岛素分泌/生产。值得注意的是,我们还发现血液胰岛素血糖水平的比率明显高于即切除的小鼠比控制即表达小鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2 (j)),这表明,STZ治疗后,胰岛功能和/或总血液葡萄糖刺激胰岛素分泌的小岛是更好的保存即切除的小鼠,β细胞即切除老鼠能分泌更多的胰岛素进入血液循环和血糖水平保持在一个相对正常的范围内。总的来说,这些发现强烈建议即消融防止STZ-induced高血糖至少部分通过促进β细胞增殖,导致大量的β细胞功能的维护和提高循环胰岛素浓度。

据报道,glucagon-producingα细胞的数量增加糖尿病状态,和击倒glucagon-receptor规范化高葡萄糖水平在糖尿病小鼠(<一个href="#B26">26,<一个href="#B27">27]。最近的研究也表明,即切除glucagon-producingα细胞在正常小鼠,能transdifferentiate产生胰岛素的β细胞和α细胞transdifferentiate成β细胞更快当β细胞受到严重的压力<一个href="#B28">28,<一个href="#B29">29日]。因此,确定即消融防止STZ-induced高血糖通过减少α细胞的数量,平均数量和比例的α细胞胰岛和循环胰高血糖素水平测定。我们发现每胰岛glucagon-secretingα细胞的数量控制和相似即切除小鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig3/" target="_blank">3(一个))。虽然控制胰岛α细胞的比例高于即切除小岛STZ治疗后(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig3/" target="_blank">3 (b)),这可能是由于低的β细胞数量,因此较低的胰岛细胞总数控制老鼠,循环之间的控制和胰高血糖素水平相似即切除小鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig3/" target="_blank">3 (c))。这一结果表明,α细胞分化转化成β细胞没有明显影响即切除注射STZ后4周。因此,即消融可能阻止STZ-induced高血糖主要通过对β细胞增殖的影响和增加功能β细胞的数量。

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图3
消融的液氧即不影响glucagon-secretingα细胞的数量和血清胰高血糖素水平STZ-treated老鼠。研究设计是图中描述<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig1/">1 (c)。控制 1 / ( = 1 8 老鼠)和 1 / ;Cre-ER老鼠( = 2 1 老鼠)TAM岁喂养12周。4周后的最后剂量TAM喂食,STZ腹腔注射在40毫克/公斤体重/天连续5天。Pancreata和血清收集到的老鼠进行进一步分析,注射STZ后4周。(一)定量的胰岛α细胞的数量( = 8 老鼠)。(b)定量胰岛α细胞的比例( = 8 老鼠)。(c)非空腹血清胰高血糖素水平之前和注射STZ后4周( = 1 8 21个老鼠)。*, < 。 0 5 。
3.3。即消融尤其是胰腺β细胞防止STZ-Induced高血糖的发展

以确定是否即切除,特别是在β细胞,有助于预防STZ-induced高血糖, 1 / ;RIP-Cre老鼠生成的地方即在β细胞优先切除大鼠胰岛素promoter-driven吗Cre重组酶(<一个href="#B15">15]。疣状显示,menin蛋白质水平显著降低只在β细胞而不是相邻的腺泡的细胞 1 / ;RIP-Cre老鼠在12周的年龄(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(b)),而控制 1 / 老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(a))。这些发现表明,即是专门在β细胞切除 1 / ;RIP-Cre老鼠。胰岛大小的增加 1 / ;RIP-Cre老鼠比控制 1 / 老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(一)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(b)),这与先前的观察是一致的研究(<一个href="#B15">15]。另一方面,胰岛β细胞和α细胞成分控制和之间的相似 1 / ;RIP-Cre老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(c)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(d))。


图4
组织特定的液氧消融即在β细胞增加抵抗STZ-induced高血糖。(模拟)控制 1 / 和 1 / ;RIP-Cre老鼠12周时( = 2 3老鼠)没有STZ治疗被牺牲,和pancreata部分immunostainined menin、胰岛素、胰高血糖素。(a - b)疣状menin(红色)和胰岛素(绿色)在控制的小岛 1 / (一)和 1 / ;RIP-Cre老鼠(b)。(c - d)疣状胰岛素(绿色)和胰高糖素在小岛(红色) 1 / (c)和 1 / ;RIP-Cre老鼠(d)。(e)实验设计的原理。控制 1 / 和 1 / ;RIP-Cre老鼠( = 1 5 老鼠)12周时注射STZ 40毫克/公斤体重/天连续5天。血糖监测,老鼠牺牲注射STZ后4周。(做减法)疣状menin(红色)和胰岛素在小岛(绿色) 1 / (f)和 1 / ;RIP-Cre小鼠注射STZ后(g),如图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig4/">4(e),收集pancreata STZ治疗后4周。(h)非空腹血糖水平之前和注射STZ后4周( = 1 2 15老鼠)。(我) 1 / ;RIP-Cre12周时小鼠注射STZ 40毫克/公斤体重/天连续5天。血糖水平 1 / ;RIP-Cre老鼠,直到注射STZ后8周( = 6 老鼠)。

1 / 和 1 / ;RIP-Cre老鼠在12周的年龄被注射MLD-STZ,和血糖水平监测注射STZ后4周(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(e))。即是有效地切除的小岛吗 1 / ;RIP-Cre老鼠与控制老鼠(数据相比<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(f)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(g))。类似TAM-treated观察 1 / ;Cre-ER老鼠,具体即切除的β细胞 1 / ;RIP-Cre老鼠也会呈现小鼠耐STZ-inducedβ细胞损伤和高血糖。非空腹血糖水平控制老鼠开始增加早注射STZ后一周,最终达到450 mg / dL注射STZ后4周(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(h))。相比之下, 1 / ;RIP-Cre老鼠没有出现高血糖在整个研究(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(h))。此外,血糖水平 1 / ;RIP-Cre老鼠仍然正常注射STZ后8周(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig4/" target="_blank">4(我))。符合正常的血糖水平4周注射STZ后,分泌细胞的比例明显高于在胰岛β细胞中 1 / ;RIP-Cre老鼠比控制老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5(一个)),这意味着有更少的β细胞损伤和/或更多的功能性β细胞保存在 1 / ;RIP-Cre老鼠。BrdUβ细胞也明显高于公司的即;RIP-Cre老鼠比控制老鼠(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (b)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (d)),进一步确认即切除增加β细胞的数量至少部分是通过促进β细胞增殖。符合观察胰腺β-细胞增殖增加即切除(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (b)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (d)),胰岛素染色面积明显增大的 1 / ;RIP-Cre老鼠比控制老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (e))。此外,随机血清胰岛素水平 1 / ;RIP-Cre老鼠明显高于控制老鼠注射STZ后(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (f))。此外,没有血液胰岛素水平的差异 1 / ;RIP-Cre老鼠之前和注射STZ后4周(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (f)),强烈建议减少β细胞损伤,因此循环胰岛素水平较高 1 / ;RIP-Cre老鼠。这些结果也支持这一点即特殊技能切除的胰腺β细胞防止STZ-induced高血糖。

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组织特定的液氧消融即促进β细胞增殖,增加β细胞数量STZ-treated老鼠。研究设计是图中描述<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig4/">4(e)控制 1 / 和 1 / ;RIP-Cre老鼠( = 1 5 老鼠)12周时注射STZ 40毫克/公斤体重/天连续5天。Pancreata和血清收集到的老鼠进行进一步分析,注射STZ后4周。(一)定量的分泌细胞的百分比在胰岛β细胞( = 4 7小鼠)。(b和c)疣状BrdU(红色)和胰岛素在小岛(绿色) 1 / (b)和 1 / ;RIP-Cre老鼠(c)。(d)的定量BrdU合并由β细胞( = 4 7小鼠)。(e)定量胰岛素染色区( = 4 7小鼠)。(f)非空腹血清胰岛素水平之前和注射STZ后4周( = 1 2 15老鼠)。规模的酒吧,25μm。*, < 。 0 5 ;* * *, < 。 0 0 1 。
3.4。即消融保存GLUT2膜定位在STZ-Treated小鼠的胰腺β细胞

Pdx-1发展是一个关键的转录因子和再生的β细胞在正常和糖尿病小鼠(<一个href="#B30">30.,<一个href="#B31">31日]。GLUT2β是一个重要的细胞膜蛋白负责运送葡萄糖在β细胞膜,并参与葡萄糖传感和分子生物学胰岛素分泌(<一个href="#B32">32]。STZ结合GLUT2测试版细胞膜和转入β细胞中,并通过几种机制包括诱导β细胞损伤破坏基因组DNA (<一个href="#B20">20.]。为了确定即对Pdx-1消融防止STZ-induced高血糖是通过其监管和/或GLUT2,我们试图检测表达或本地化Pdx-1 GLUT2 STZ-treated控制和β细胞即切除小鼠免疫染色。

我们发现Pdx-1阳性细胞的数量更高即切除小岛比控制小岛(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(一)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(b))。然而,鉴于Pdx-1蛋白质含量在单独的β细胞之间的控制和没有出现明显的不同即注射STZ后切除小岛,是否即切除直接让Pdx-1表达式仍然需要确定。免疫荧光染色显示GLUT2检测细胞膜和细胞质的控制和β细胞即切除小鼠没有STZ治疗(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(c)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(d))。值得注意的是,注射STZ后,GLUT2表达主要是保存在β的细胞膜即切除小鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(f)),而它几乎没有检测到测试版细胞膜在控制老鼠(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(e))。这些发现表明,即切除保护/保存GLUT2膜定位在β细胞膜,因此注射STZ后保护β细胞的功能。


图6
消融的液氧即保留膜定位的葡萄糖转运蛋白2 (GLUT2)在STZ-treated小鼠β细胞。(a - b)疣状Pdx-1(红色)和胰岛素(绿色)在控制的小岛 1 / (一)和 1 / ;Cre-ER老鼠(b) TAM治疗,其次是注射STZ,图中描述<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig1/">1 (c)。控制 1 / ( = 1 8 老鼠)和 1 / ;Cre-ER老鼠( = 2 1 老鼠)TAM岁喂养12周。4周后的最后剂量TAM喂食,STZ腹腔注射在40毫克/公斤体重/天连续5天。Pancreata收集从小鼠注射STZ后4周。核复染色使用DABI(蓝色)。(c - d)疣状GLUT2(红色)和胰岛素(绿色)在控制的小岛 1 / (c)和 1 / ;Cre-ER老鼠没有STZ治疗(d),所述数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig1/">1(一)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig1/">1 (b)。控制 1 / 和 1 / ;Cre-ER老鼠( = 8 老鼠)喂养三苯氧胺(TAM) 12周时在200毫克/公斤体重/天连续两天,紧随其后的是休息一天,然后连续两天。收集Pancreata TAM喂养后4周。(e-f)疣状GLUT2在小岛和胰岛素控制 1 / (e)和 1 / ;Cre-ER老鼠(f) TAM治疗和注射STZ紧随其后,图中描述<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/fig1/">1 (c)。控制 1 / ( = 1 8 老鼠)和 1 / ;Cre-ER老鼠( = 2 1 老鼠)TAM岁喂养12周。4周后的最后剂量TAM喂食,STZ腹腔注射在40毫克/公斤体重/天连续5天。Pancreata收集注射STZ后4周。规模的酒吧,25μm。

4所示。讨论和结论

以前的研究已经表明β细胞增殖和循环胰岛素水平增加小鼠后很长一段时间即切除(<一个href="#B15">15,<一个href="#B17">17]。然而,是否相对严重即切除可以防止STZ-induced高血糖和它的潜在机制仍不清楚。在目前的研究中,我们采用的方法暂时控制即在多个组织以及胰腺β-细胞特定的切除即切除,发现即切除预防高血糖发展STZ-treated老鼠。我们的研究结果进一步表明,即切除预防高血糖的发展主要是通过增加β细胞功能的数量。

也注意到,在对比观察血液胰岛素水平降低 1 / ;Cre-ER老鼠受到STZ治疗4周后即切除,STZ-treated血胰岛素水平没有下降 1 / ;RIP-Cre老鼠( 1 / ;Cre-ER老鼠,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig2/" target="_blank">2(我); 1 / ;RIP-Cre老鼠,图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig5/" target="_blank">5 (f))。的时间和持续时间的差异即切除两组老鼠可能部分解释这种差异。为 1 / ;Cre-ER老鼠,即基因通过TAM喂养12周的岁时切除这些老鼠然后被质疑MLD-STZ TAM的最后剂量喂养4周后(图<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig1/" target="_blank">1 (c))。只有4周后(TAM)最后的剂量即切除小鼠复制或再生功能他们注射STZ前β细胞。相比之下,在 1 / ;RIP-Cre老鼠,即基因切除在β细胞在胚胎发育过程中,由于大鼠胰岛素promoter-drivenCre重组酶表达和激活胰岛素在胚胎阶段。大约有12周 1 / ;把- - - - - -Cre小鼠产生更多的β细胞功能与STZ之前他们的挑战。的持续时间即切除是更长的时间 1 / ;RIP-Cre老鼠比TAM-treated 1 / ;Cre-ER老鼠,因此很可能 1 / ;RIP-Cre老鼠有更多的功能比TAM-treatedβ细胞 1 / ;Cre-ER小鼠注射STZ之前,因此更多的β细胞注射STZ后。因此,血胰岛素水平并没有显著降低 1 / ;RIP-Cre小鼠注射STZ后。此外,也有可能即切除在胚胎阶段可能导致一些补偿或适应的β细胞 1 / ;RIP-Cre老鼠,这也部分导致β细胞的相对阻力STZ-induced损伤和减少血液胰岛素水平。

最近的研究表明,即切除小鼠transdifferentiate glucagon-producingα细胞产生胰岛素的β细胞(<一个href="#B28">28]。此外,从α细胞β细胞分化转移发生更快当β细胞受到严重的压力<一个href="#B29">29日]。然而,我们的研究结果显示,平均每个胰岛α细胞数量和血胰高血糖素水平控制和之间的相似即切除老鼠,说明即切除并没有大幅触发α细胞分化转化β细胞注射STZ后4周。然而,我们也不能排除即切除胰腺或其他non-beta细胞α细胞可以重新编程为分泌细胞在后期STZ-induced糖尿病。

我们进一步分析使用免疫染色显示有更多Pdx-1阳性细胞即切除老鼠。Pdx-1是一个重要的转录因子在β细胞发展和增长<一个href="#B33">33,<一个href="#B34">34]。我们的研究结果表明,Pdx-1蛋白质水平个体β细胞没有出现大幅增长即切除小鼠与控制老鼠相比,这表明Pdx-1表达水平可能是注射STZ后功能细胞的标记,和降低Pdx-1阳性细胞数量控制老鼠可能是由于减少功能细胞的总数在那些老鼠。疣状在胰腺β-细胞还显示,胰腺部分GLUT2本地化膜注射STZ后很大程度上保留了即切除老鼠与控制老鼠(数据相比<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(e)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(f))。这个结果可以部分解释为什么即切除小鼠显示正常的血糖水平和更高的循环胰岛素水平,因为GLUT2参与葡萄糖传感和分子生物学胰岛素分泌(<一个href="#B32">32]。另一方面,因为即切除不会降低GLUT2在小鼠细胞的膜表达没有STZ治疗(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(c)和<一个href="//www.newsama.com/journals/jdr/2010/876701/fig6/" target="_blank">6(d)),不太可能相对阻力即切除小鼠STZ-induced胰腺β-细胞损坏是由于膜GLUT2表达细胞的变化。另外,我们不能排除即切除改善细胞的整体功能,渲染即离体的细胞抗STZ-inducedβ细胞损伤。

它也是值得注意的RIP-Cre转基因,我们用来特别消费税即在细胞 1 / ;RIP-Cre老鼠,据报道在non-beta细胞中表达,包括肺、脾、睾丸和大脑(<一个href="#B35">35),特别是在一群定义糟糕的下丘脑神经元(RipCre神经元)[<一个href="#B36">36]。淘汰赛的胰岛素受体底物2组下丘脑神经元人口原因中断能量体内平衡,增加食物摄入量,在稍后的阶段(导致肥胖<一个href="#B36">36]。因为它没有被报道,肿瘤在下丘脑即病人或发展即基因敲除小鼠,目前尚不清楚是否menin压制扩散RipCre神经元。此外,它也不清楚即切除的RipCre神经元影响进食或其他途径参与能量稳态或葡萄糖代谢。因此,我们不能排除这一可能性即切除non-beta细胞可能部分属性来改善葡萄糖稳态STZ-treated老鼠。

总之,我们发现即切除防止STZ-induced高血糖主要通过增加β细胞功能的数量。BrdU合并由β细胞、胰岛大小和循环胰岛素水平显著提高即切除老鼠。与我们的研究结果一致,menin通过催乳激素生理抑制信号通路在怀孕小鼠胰腺β细胞,防止妊娠期糖尿病(<一个href="#B37">37]。这些结果表明,menin可能有针对性的促进β细胞增殖和改善糖尿病。然而,由于细胞增生、胰岛瘤和高胰岛素血中发现了即基因敲除小鼠模型或即患者(<一个href="#B15">15,<一个href="#B38">38,<一个href="#B39">39),有一种担忧是有道理的,中断menin旨在促进β细胞增殖可能导致胰岛瘤,并永久删除或抑制menin本身可能不是一个可行的治疗方法来治疗糖尿病。相反,它可能通过可逆地抑制menin促进β细胞增殖或阻塞menin及其合作伙伴之间的交互。这些方法可能保留menin的肿瘤抑制功能,如DNA修复(<一个href="#B40">40),但瞬变抑制抑制β细胞增殖的能力,从而增加功能性内源β细胞的数量,改善糖尿病。在这方面,小分子化合物目标menin及其合作伙伴之间的交互,如果开发,可以用于预防或治疗糖尿病。

利益冲突

与本文相关的任何潜在的利益冲突是由作者声明。

确认

这项工作是支持部分由美国国立卫生研究院(R01-DK085121 X.H.)和美国糖尿病协会的资助(7-07-RA-60 X.H.)。作者感谢多丽丝Stoffers博士她建议和刺激讨论,布雷斯顿和彼得为他的优秀的技术援助。我们也感谢Shivani Sethi女士的阅读和编辑手稿。