Neuroskeletal蛋白质的动态变化在drg基础受损轴突的成熟和进步在1型糖尿病轴突变性

文摘

我们进步的轴突障碍调查机制和结构性赤字在1型BB / Wor-rats糖尿病持续时间从1星期到10月。运动和感觉传导速度减少糖尿病和4和6周后拒绝进一步在剩下的9个月。有髓鞘的腓肠神经纤维在纤维显示进步的赤字数字和大小。结构性赤字无髓鞘的轴突的大小明显在2月和赤字数目出席4月。之前这些变化是减少可用性的胰岛素、c -肽和igf - 1表达的神经纤维细丝和下降-III-tubulin。Upregulation磷酸化的激酶压力像Cdk5 p-GSK-3,p42/44导致增加神经纤维细丝的磷酸化。p-GSK-3活动的增加与增加的磷酸化NFH,而减少Cdk5与磷酸化NFM递减。数据显示,受损神经营养支持结果顺序受损neuroskeletal蛋白质的合成和postranslational修改,导致进步的赤字在轴突的函数,成熟和大小。

1。介绍

糖尿病性多神经病(DPN)是糖尿病患者常见的并发症。其发病机理尚未完全理解和方面的潜在机制是有争议的1,2]。尽管高血糖诱导代谢异常包括polyol-pathway多动症、氧化应激、蛋白激酶C改建及晚期糖化终产物为1型DPN [3,4],受损的胰岛素/ c -肽信号已成为一个额外的启动和重要的因素在其发病机制2,5]。

除了直接神经营养影响胰岛素和c -肽所掌握,他们提供其他神经营养因子及其受体基因调控功能(6,7)与下游影响细胞骨架和细胞粘附蛋白及其postranslational修改(8,9]。不同胰岛素signaling-related效果之间的差异可能会构成DPN insulin-deficient 1型和2型糖尿病血糖(1,10- - - - - -14]。

DPN的特征病理特点是轴突萎缩和神经纤维损失,二次回一个垂死的过程。早前功能缺陷被认为是引起的新陈代谢降低Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶和以挪士活动沉淀受损的胰岛素的行动和高血糖1- - - - - -4,13]。轴突的病理变化和节点在1型DPN更严重,而主要的节段性脱髓鞘2型DPN的特点是(2,8,11]。在这两种情况下,DPN疾病是一个动态的过程,改变基础病因pathobiological组件。

神经纤维细丝(NFs)和微管蛋白是轴突缸的主要成分及其表达水平和磷酸化状态确定轴突函数,增长和口径(13,15- - - - - -17]。在动物模型的研究已经证明了NFs的表达减少,细胞微管蛋白在背根神经节(drg),减少了轴突运输的NFs和NFs在周围神经的异常磷酸化18- - - - - -22]。自从NF mrna在开发过程中不增加和径向轴突生长,postranscriptional规定NF似乎更为重要。一些神经营养分子,如神经生长因子(神经生长因子),neurotrophin-3 (NT-3)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)、胰岛素和c -肽稳定NF成绩单(22,23]。NFs的异常磷酸化扰乱他们的对齐和交互与其他细胞骨架成分导致轴突功能受损,并最终萎缩和损失。几个激酶与NFs的异常磷酸化,如细胞周期蛋白依赖激酶5 (Cdk5)和MAP激酶Erk 1/2 (p44/42),压力激发了蛋白激酶/ c-jun NH2-terminal激酶(SAPK /物和磷酸化糖原合成酶激酶3(p-GSK-3)[21,24,25]。

其他重要的细胞骨架组件组装成微管微管蛋白,它们提供了一个基础,轴突运输和极性。虽然微管蛋白的作用没有得到充分地探索在DPN mRNA和蛋白表达下降记录(18,19,26]。Microtubule-associated蛋白质如MAP1B和120 kDτ调节微管的组装和稳定在成人drg [27]。一个额外的蛋白质结合的微管+ Atk-regulated GSK -结束,它调节微管结合蛋白(28]。抑制GSK -通过磷酸化破坏MAP1B磷酸化和减少微管稳定和轴突的结果(29日]。

先前的研究已经强调了轴突的细胞骨架蛋白的重要性函数,而他们的关系轴突生长、病理学和神经形态测量学此前还没有检查纵向在实验性糖尿病。大多数研究检验STZ-induced糖尿病大鼠(18- - - - - -22),一个模型结构变化的周围神经是轻微的,不显示进步的神经纤维赤字。

insulinopenic BB / Wor-rat,是人类的亲密模型1型糖尿病(30.)和显示早期结构变化紧随其后有髓和无髓鞘的纤维在人类状况(9,31日]。探索neuroskeletal蛋白质的顺序和机械作用过程中扰动DPN的发展,糖尿病BB / Wor-rats纵向研究从一个星期到10个月期间糖尿病。我们检查了电机、感觉和C-fiber函数,定量结构异常有髓和无髓鞘的纤维的腓肠神经,细胞骨架蛋白表达,磷酸化,磷酸化的激酶的表达在打钻。

2。材料和方法

2.1。动物

男性前驱糖尿病的BB / Wor-rats和年龄,sex-matched nondiabetes倾向BB-rats得到从生物医学研究模型(伍斯特,MA)。体重、尿液体积和糖尿(Keto-Diastix,拜耳,埃尔克哈特)每天监测确定发病的糖尿病和校准每日胰岛素剂量。在糖尿病的发病天的年龄,糖尿病老鼠收到滴定剂量(0.4 - -3.3 U / d)的鱼精蛋白锌胰岛素(蓝岭制药、格林斯博罗、数控)持续的血糖水平维持在大约25毫米和防止酮症酸中毒。正如前面演示了这种模式维护动物远高于(15.0毫米)血糖过低的水平(32]。动物照顾依照动物调查委员会的指导方针,韦恩州立大学与国立卫生研究院(没有出版。85 - 23,1995)。

2.2。热足底试验

延迟后爪撤军的热刺激(42°C;152 mW /厘米²热痛觉)被用作措施,反映出无髓鞘的纤维功能,并以1周,1 - 2、4 - 7和10个月期间糖尿病。测量进行了使用尤格生物研究机构(Comerio、意大利)。时间从热源激活动物self-withdrawal在几秒钟内测量6次交替后爪子。这些测量的均值计算和用作个人测量的延迟撤军(33]。

2.3。电生理记录

神经传导速度研究动物与异氟烷吸入麻醉(2 - 3%)与氧气混合由一个麻醉机系统。运动神经传导速度(MNCV)和感觉神经传导速度(感)测定左后肢在温度控制(36 - 37°C)条件下使用5200 Cadwell肌电描记器(Cadwell实验室、肯纳威克、WA)如前所述详细(8,12,26]。MNCV测量在1周,1周、2周、四周,七周和10个月糖尿病和时间感在6周,2周,4周,七周和10个月。

2.4。组织收集

后2、4、7和10个月糖尿病、糖尿病和年龄控制老鼠牺牲的腹腔内过量戊巴比妥钠(120毫克/公斤体重)。正确的unifascicular腓肠神经解剖从五糖尿病和五个控制老鼠在每个时间点和固定在1%甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4)2.5%戊二醛、脱水和嵌入在环氧树脂的形态学分析如前所述(6,35)。双边L4和L5 drg从每组2,四只动物收集7,10个月糖尿病的蛋白质提取。组织在液氮快速冻结和保持°C到使用。动物模型包括500毫升0.1 M磷酸盐缓冲(pH值7.4)4%多聚甲醛。L4和L5 DRG的后缀相同的固定剂,清洗在PBS,脱水,沉浸在二甲苯,嵌入在石蜡和用于采用免疫研究。

2.5。西方墨点法

drg细胞溶解在洗涤剂溶解缓冲区(50毫米Tris-HC1, pH值7.4,150毫米氯化钠,1毫米EDTA,特里同x - 100 1%, 1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1g / mL亮抑酶肽和1g / mL抑肽酶)。的溶解产物在12000转离心20分钟在4°C和蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸蛋白质测定试剂(皮尔斯,罗克福德,IL)与牛血清白蛋白作为标准。10到40克蛋白质由7.5 - -10% sds - page分离,并转移到PVDF膜(Bio-Rad大力神,CA)。膜被封锁与Tween-20-tris缓冲盐水(ttb)(10毫米Tris-HC1, pH值7.5,100毫米渐变20氯化钠和0.1%)含5%脱脂奶粉(Bio-Rad大力神,CA)前孵化与主要抗体。主要抗体:Rabbit-polyclonal-antineurofilament重(c端),Rabbit-polyclonal-antineurofilament介质(c端),兔子——polyclonal-antineurofilament光,mouse-monoclonal-anti -三世同种型的微管蛋白和mouse-monoclonal-antiactin都购自Chemicon国际(泰梅库拉,CA)。Mouse-anti -微管蛋白在癌基因研究(Cambridge, MA)。兔子antiphosphoτ抗体(PS 396和PS 404)礼物从k博士石黑浩,三菱Kagaku生命科学研究所、日本东京。Mouse-monoclonal-antineurofilament-phosphorylataed抗原决定基(SMI31)从Covance研究产品(CA)伯克利,rabbit-polyclonal-phosphorylated p44/42 MAP激酶(Thr202 / Tyr204), rabbit-polyclonal-total p44/42 MAP激酶,mouse-monoclonal-antiphosphorylated SAPK /物(Tyr180 / Tyr182)和兔单克隆antiphospho p38来自细胞信号技术(丹弗斯,MA)。Goat-polyclonal-anti-GSK-3和p-GSK-3/来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)和rabbit-polyclonal-anti-Cdk5是从Abcom Inc . (Cambridge, MA)。抗原检测进行了使用化学发光(Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,NJ)和辣根peroxidase-conjugated二级抗体。膜暴露在以下影片(柯达,罗彻斯特,纽约)。图像扫描和密度由Bio-Rad Fluoro-S multimager (Bio-Rad大力神,CA)。表达的蛋白质是由肌动蛋白密度和纠正表达控制动物任意设置为1.0。

2.6。形态测量学

Semithin (0.5米)的截面Epon-embedded腓肠神经与甲苯胺蓝染色光显微镜的形态学分析用计算机图像分析系统(图1,环球成像集团,西切斯特,PA)。这个系统程序评估的总补腓肠神经有髓纤维和提供以下参数:纤维(#),纤维密度(# /毫米²),是指纤维区(米²),指的是轴突面积(米²),是指髓区(米²)、轴突髓鞘比循环指数和纤维入住率丛生的总面积(%)(如前所述)(34]。

的形态学分析的无髓鞘的纤维,超薄横截面的腓肠神经得到LKB超微切片机(加拿大哈利法克斯Marviac有限公司)和染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。他们检查了蔡司EM 900电子显微镜(卡尔蔡司、从、德国)。系统地选择帧代表25 - 30%横截面积的腓肠神经。照片被放大10000倍,下载到图像分析系统。无髓鞘的纤维得到了以下的形态学参数:无髓鞘的纤维,纤维密度(# /毫米²),是指纤维大小(米²),每许旺细胞轴突数量单位和胶原蛋白的频率口袋,去神经的雪旺细胞档案、2型axon-Schwann细胞关系(轴系膜的破坏)和再生c fibers (33]。

2.7。疣状

Deparaffinized 6m部分drg的孵化与选定主要抗体(Cdk5 GSK-3和SMI-31,与上面相同的来源)30分钟在室温下,用三个PBS的变化,和孵化peroxidase-conjugated二级抗体(向量实验室,伯林盖姆,CA)在室温下30分钟。免疫反应性的产品可视化与涂颜色色原体。

2.8。统计分析

所有的值被表示为手段SD。意义方差分析的差异进行了分析。组差异被矫正人员评估测试。被定义为一个意义P值小于0。。评估之间的关系表达式的stress-kinases hyperphosphorylation个人神经纤维细丝线性、逻辑回归分析。所有分析人员没有意识到动物的身份。

3所示。结果

3.1。临床研究结果

血糖和糖化血红蛋白水平是持续和显著()在糖尿病大鼠升高。血浆胰岛素水平明显下降(在观察期间)。胰腺的反映细胞丧失、c -肽水平严重下降或没有可衡量的。血浆igf - 1水平明显降低糖尿病大鼠(已经在两个月的)和控制相比仍下降值(表1)。


		N	体重(g)	血糖水平(毫米)	胰岛素pmol / L	c -肽pmol / L	igf - 1纳克/毫升

两个月的	控制	8	428±19	5.0±0.4	455±52	710±52	1785±112
	BB /磨破	8	348±21 *	24.6±2.2 *	57±7 *	43±12 *	1328±87 *
四个月	控制	8	429±22	5.0±0.3	438±27	723±12 *	- - - - - -
	BB /磨破	8	375±15^__	23.9±1.3 *	51±6 *	< 25 *	- - - - - -
掺了	控制	9	505±37	5.3±0.3	526±108	727±24	1182±32
	BB /磨破	9	370±18 *	25.2±1.7 *	153±55 *	< 25 *	778±70 *
10个月	控制	8	555±29	5.0±0.3	506±81	687±18	1192±37
	BB /磨破	8	400±13 *	23.2±1.3 *	84±21 *	< 25 *	747±86 *

结果意味着±SD。^__ ;*与各自的control-rats。

3.2。延迟对热刺激

痛觉过敏,反映在减少延迟撤军,显著(月的糖尿病)改变。延迟了四个月的糖尿病,然后plateaud和增加(糖尿病)从7到10个月,在这段时间里,它不是不同((图)的控制动物1(一))。延迟的增加从7到10个月最有可能代表增加痛觉减退因进步C-fiber赤字(见下文)。

(一)

(b)

(c)

图1

^{* *} ^{* * *} (a)热足底的测试控制和延迟糖尿病BB / Wor-rats 1周,月,两个月,四个月、7和10个月的时间。(b)运动神经传导速度控制,糖尿病BB / Wor-rats 1周、1周、2周、四周,七周和10个月时间;(c)感觉神经传导速度控制,糖尿病BB / Wor-rats 6周,2周,4周,七周,10个月的时间。结果意味着SD ()*,和与各自控制的价值观。

3.3。运动神经传导速度(MNCV)

MNCV一周是正常的糖尿病,然而,它明显()减少一个月,之后逐渐下降到68% (在10个月糖尿病(图)正常的值1 (b))。

3.4。感觉神经传导速度(感)

糖尿病大鼠糖尿病6星期后才显示显著()感减少,赤字与糖尿病持续时间逐渐增加,达到78% (在10个月(图)正常的值1 (c))。

3.5。有髓纤维的腓肠神经形态测量学(表3)

只略有下降()在两个月的有髓鞘的轴突的循环是明显的糖尿病。四个月糖尿病小鼠表现出显著的赤字在轴突的大小((表)的有髓纤维2)。掺了糖尿病后,有一个健壮的差异(由于轴突()纤维的大小)和髓鞘()萎缩而控制老鼠,这是反映在进一步减少循环的指数()(表2)。最引人注目的变化虽然是一个15% (在有髓纤维数量)赤字。这个进步到30% (糖尿病(图)的10个月2(一个)),这反映在下降(入住率(表)2)。


	两个月的控制	两个月的BB /磨破	4个月的控制	4个月的BB /磨破	控制后	掺了BB /磨破	10个月的控制	10个月BB /磨破

纤维区(米²)	30.9±2.6	30.7±3.3	36.2±3.8	32.5±3.6	41.7±1.0	33.3±2.3^{* * * *}	38.9±2.0	31.4±1.5^{* * * *}
轴突区(米²)	11.7±1.0	11.5±1.9	15.0±1.6	11.9±1.4^{* * *}	18.5±0.5	13.6±1.4^{* * * *}	16.2±1.1	12.4±0.8^{* * * *}
髓区(米²)	19.2±2.0	19.2±1.8	22.1±2.4	20.4±1.3	24.8±2.1	19.7±1.6^{* * *}	22.7±1.7	19.0±1.5^{* *}
/ m比率	0.613±0.063	0.601±0.079	0.655±0.119	0.624±0.084	0.750±0.065	0.692±0.079	0.716±0.069	0.654±0.071
或(%)	49.8±7.6	46.6±4.2	49.7±3.5	52.4±3.6	61.3±3.7	58.3±1.8	57.9±4.7	50.0±5.8 *
信息内容	0.955±0.012	0.926±0.023 *	0.937±0.013	0.906±0.017	0.946±0.005	0.900±0.007^{* * * *}	0.924±0.011	0.895±0.026 *

结果意味着±SD。*,^{* *} ,^{* * *} 和^{* * * *} 与各自的控制老鼠。

(一)

(b)

图2

^{* *} ^{* * *} 纵向的形态学数据显示有髓和无髓鞘的纤维数量。注意增加赤字有髓和无髓鞘的纤维在糖尿病大鼠相比,年龄控制老鼠。但是绝对纤维数量在糖尿病大鼠并没有改变在观察期间,建议的一个组成部分受损纤维糖尿病动物的成熟。*,,与年龄值的控制。

3.6。无髓鞘的纤维形态测量学

两个月糖尿病动物显示轻微的()增长的赤字将达到72%的无髓鞘的纤维变得更加明显(在10个月糖尿病(表)正常的值3)。此外无髓鞘的纤维数量有巨大的赤字从四个月糖尿病起(),达到56% (糖尿病(图)的10个月2 (b))。这些赤字之前,伴随着明显的退行性变化,如增加2型许旺细胞的频率/轴突的关系(轴系膜的破坏)(),胶原蛋白的口袋(),去神经的雪旺细胞概要文件()。伴随持续退化,糖尿病大鼠显示c fibers再生率的增加(表3)。


	两个月的控制	两个月的BB /磨破	4个月的控制	4个月的BB /磨破	控制后	掺了BB /磨破	10个月的控制	10个月BB /磨破

轴突数量/ SC(# /单位)	5.01±0.81	4.47±0.54	5.26±0.64	4.22±0.29 *	5.29±0.26	4.17±0.11^{* * * *}	5.20±0.34	4.03±0.26^{* * * *}
意味着纤维区(米²)	0.636±0.076	0.534±0.049 *	0.742±0.090	0.613±0.042 *	0.706±0.072	0.531±0.044^{* * *}	0.676±0.056	0.487±0.076^{* * *}
去神经的SC (%)	0.08±0.11	0.86±0.40^{* * *}	0.24±0.18	0.97±0.26^{* * *}	1.00±0.32	2.61±0.57^{* * * *}	2.54±0.90	4.42±1.32 *
胶原蛋白的口袋(%)	0.76±0.35	1.95±0.78 *	0.62±0.42	1.59±0.57 *	1.65±0.32	3.15±0.89^{* *}	7.98±0.49	11.60±3.36 *
2型关系(%)	2.21±0.40	4.29±0.91^{* * *}	1.18±0.13	6.45±2.00^{* * * *}	3.30±0.54	14.45±3.02^{* * * *}	6.04±1.47	18.22±2.36^{* * * *}
再生纤维(%)	0.84±0.39	1.59±0.32^{* *}	0.56±0.43	2.07±0.36^{* * * *}	1.69±0.51	2.49±0.46 *	4.28±1.24	8.56±3.13 *

结果意味着±SD。*;^{* *} ;^{* * *} ;和^{* * * *}

3.7。NFH, NFM NFL和磷酸化NFH和窄带调频

NFH表达式显示两个主要乐队在分子量180 kd和200 kd。2、7和10个月糖尿病大鼠drg NF-H表达式的两个180 kd (,和、职责)和200 kd (,和、职责)明显,逐渐减少(图3(一个))。NF-M的下降表现在两个月的糖尿病保持相对恒定的10个月课程(,和resp)(图3 (b))。的下降表现NF-L还保持不变(,和在糖尿病drg) 2,分别为7和10个月(图3 (c))。与特定的抗体,重度31日磷酸化NFH和NFM被检测到。没有绝对的变化磷酸化NFH在观察期间,而一倍(糖尿病)的磷酸化NFM发生在两个月的,然后拒绝(图3 (d))。另一方面,磷酸化NFM的比例相对于窄带调频表达增加两个月(),7 ()和10个月(糖尿病大鼠(图)3 (e)我)。因此,磷酸化NFM的比例与糖尿病持续时间减少。磷酸化NFH的比率,按照总NFH的比例计算的表达式,在2显著增加,7和10个月糖尿病大鼠()和倾向于增加糖尿病(图的时间3 (e)ii)。磷酸化τ的表达(PS 396 PS 404)并没有改变在糖尿病大鼠的抗原表位(数据没有显示)。

(一)NFH

(b) NFM

(c)橄榄球

(d) SMI31

(e)磷酸化比总NFs

(f) BetaIII微管蛋白

(g)β微管蛋白

(h)肌动蛋白

图3

^{* *} ^{* * *} ^{* *} ^{* * *} 磷酸化水平和总神经丝在drg子单元。(一)总NFH;总NFM (b);总NFL (c);(d) SMI31(磷酸化NFM和NFH);和(e)相对磷酸化NFM (ei)和NFH (eii)在两个月后,10个月的糖尿病。结果意味着SD ()。*,和与各自的控制老鼠。背根神经节微管蛋白的表达。总beta-tubulin betaIII-tubulin (f) (g)和(h)肌动蛋白水平在两个月的drg, 7和10个月糖尿病大鼠。结果意味着SD ()*,和与各自的控制老鼠。

3.8。微管蛋白的表达在打钻

神经元的特定III-tubulin水平在糖尿病动物减少2、7和10个月(,,职责。)(图3 (f)),而总微管蛋白水平并没有改变在任何时间点(图3 (g))。

3.9。磷酸化的drg MAPKs

磷酸化第42页有显著增加(Erk 2)在drg 2、7和10个月糖尿病(,和、职责)和磷酸化p44 (Erk - 1) (,和分别(图)4(一)),而总页和p44水平并没有改变(图4 (b))。磷酸化p44的比例(,和、职责)和第42页(,和职责。)因此增加2,7和10个月糖尿病大鼠(数字4 (e)我和4 (e)ii)。46 kd和54 kd磷酸化SAPK /物水平在2和7月龄糖尿病大鼠drg持平,但在10个月糖尿病大鼠(都显著增加)(图4 (c))。磷酸化p38没有改变两个月糖尿病老鼠,但增加掺了糖尿病大鼠(在10个月(图)和恢复正常4 (d))。

(一)磷酸化p42/44

总p42/44 (b)

(c)磷酸化SAPK /物

(d)磷酸化p38

(e)的磷酸化p44,第42页

图4

^{* *} ^{* * *} ^{* * * *} 蛋白激酶激活的表情:(a)磷酸化p42/44;(b)总p42/44;(c) phosphorylatead SAPK /物;。(d) phosphorylated-p38;(e)的磷酸化/总p44和第42页两个月,7和10个月的时间。Phophorylation比率计算)除以磷酸化蛋白质含量与各自的总蛋白水平。结果意味着SD ()。*,,和与各自的控制老鼠。

3.10。p-GSK-3并在drg Cdk 5

Cdk5(会增加四倍以上)在糖尿病大鼠,然后两个月下降后()和拒绝进一步控制以下值(在10个月(图)5(一个))。总GSK-3并没有改变整个观察期(图5 (b)),而p-GSK-3逐渐增加患糖尿病时间(图5 (c))。这是适度增加()在两个月的糖尿病大鼠,但进一步增加7 ()和10个月()糖尿病(图的时间5(一个))。这导致越来越多的GSK-3被磷酸化(图5 (d))。p-GSK-3线性相关与增加磷酸化NFH ()(图5 (e))。极显著相关Cdk5)之间存在表达减少和降低比例的磷酸化NFM的糖尿病(图5 (f))。

(一)Cdk5

总GSK-3 (b)

(c) p-GSK-3

(d)磷酸化/ GSK3总

(e)

(f)

图5

^{* *} ^{* * *} 表达Cdk5 (a),总GSK-3(b),磷酸化GSK-3(c)和磷酸化/ GSK3总(d)在两个月的控制和糖尿病BB / Wor-rats, 7, 10个月的时间。结果意味着SD ()。*,,与各自的控制老鼠。线性回归分析GSK-3的表达和相对表达磷酸化NFH (e)和Cdk5的表达和相对磷酸化NFM (f)。注意增加GSK-3的表达式和磷酸化NFH期间糖尿病患者,而Cdk5表达降低与减少磷酸化NFM增加糖尿病患者持续时间。

3.11。免疫组织化学

疣状Cdk5显示频繁的阳性染色的小DGR神经元和糖尿病老鼠,他们在两个月的核与持续时间减少糖尿病(图6(一))。只有零星的GSK-3阳性的神经元出现在两个月的糖尿病。在10个月糖尿病患者有一个一般的积极性大大小小的DRG神经元(图6 (b))。

(一)

(b)

图6

5 (b) Cdk5 (a)和p-GSK-3(b)积极的糖尿病大鼠DRG神经元在两个月和10个月。注意频繁Cdk5可染性的小DRG神经元在两个月的(a),倾向于减少持续时间的糖尿病患者。p-GSK-3的数量积极的DRG神经元增加患糖尿病时间(b)和各种规模的神经节细胞的影响。在较低的图= 35米和显示所有帧的放大。

4所示。讨论

在这里,我们表明,早期胰岛素和c -肽的可用性和减少赤字的igf - 1以及高血糖与无髓鞘的功能和有髓神经纤维受损。这种变化是在drg igf - 1的扰动和胰岛素受体,转录因子如NF -κB和早期基因响应等因素c-fos保持神经纤维细丝蛋白表达和受损三世微管蛋白(7,26,35,36]。随之减少胰岛素和igf - 1信号活动增强p-GSK-3等所谓的压力激酶的表达、p42/44 Cdk5和SAPK /物与细胞骨架元素亲和力(37]。产生错乱排列和拆卸交互神经纤维细丝和微管蛋白导致逐步受损轴突生长,轴突萎缩,最终损失。这一系列事件似乎影响无髓鞘的纤维,比有髓纤维并联更严重受损的早期神经营养支持通过胰岛素和神经生长因子,背根神经节神经元(目标特别小19,33,38,39]。

无髓鞘的纤维的初始功能赤字很可能由于兴奋过度c fibers通过增加激活tetrodotoxin-resistant Na-channels [40,41]。在早期有髓纤维和可逆神经传导赤字与胰岛素缺乏,hyperglycemia-related抑制节点Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶活动(1,3,8]。

如图所示之前在这个模型中,受损的胰岛素和c -肽影响igf - 1的基因表达,神经生长因子和NT-3及其受体(23,36,42与后果neuroskeletal蛋白质的表达[]43,44]。NFs是独一无二的神经元和与微管和其他细胞骨架元素,形成轴突运输的基础。NFs包括三个中间丝蛋白,NFL (61 kD), NFM (90 kD)和NFH (110 kD)。他们有一个中央域共同参与卷曲螺旋的形成二聚体。两个二聚体交错对齐的方式,最终形成四聚物和10纳米纤维(15]。NF杂聚合物的形成需要NFL聚合与窄带调频或NFH [45]。NFL和NFM是协调表达表明转录信号相同,而NFH单独监管(46]。大会期间,在神经元胞体NFL充当核心和NFM NFH成为磷酸化的线圈,使神经元胞体对横桥的形成很重要,intrafilament间距,轴突生长和传导速度(47]。

这里我们展示协调表达显著抑制NFL和NFM在两个月的,保持不变,而NFH表达拒绝与糖尿病的持续时间。最初,78% NFM显示异常磷酸化,与糖尿病持续时间减少。另一方面磷酸化NFH增加糖尿病患者的比例持续时间在10个月时间达到1.7倍。这些发现表明,装配和功能受损的NFs发生在糖尿病神经病变早期由异常磷酸化NFM越来越磷酸化的NFH紧随其后。的异常磷酸化相关并可代stress-kinases二级受损的胰岛素和igf - 1的信号。这些变化就有可能扰乱与微管蛋白的相互作用。一些与压力相关的激酶已确认为负责异常神经丝磷酸化(21]。早期增加p35区域监管Cdk5可能构成特定的早期磷酸化神经丝侧臂片段(48),减少表达式表示的Cdk5糖尿病病程与并联NF-M磷酸化的减少。Cdk5免疫反应性的两个月的糖尿病大鼠背根神经节神经节细胞主要涉及小疼痛的暗示这个神经元数量是影响早期的形态学分析的c fibers,先前发现的早期赤字的小疼痛的神经细胞(33]。p35区域/ Cdk5复杂区域的过度活跃也一直与高血糖相关,涉及的地图和τhyperphosphorylation阿尔茨海默病(49]。有趣的是,phospho-tau没有明显改变糖尿病诊断相关的。另一方面,p-GSK-3表达增加与糖尿病与持续时间减少Akt-mediated磷酸化的GSK-3 Ser 9 (50,51)和与增加的磷酸化NF-H反映其亲和力NF-H [48]。因此,胰岛素和igf - 1信号受损导致GSK-3下降(Ser 9)表达式允许p-GSK-3的磷酸化,一个强有力的激酶磷酸化的压力,这也被卷入类似于糖尿病的变化(51]。微分的磷酸化神经纤维细丝Cdk5和p-GSK-3众所周知,发生(48,52]。额外的潜在磷酸化的激酶证明这里是p42/44来自贫困MAPK信号。磷酸化的表达p42/44整个观察期保持相对稳定,而54-kDA同种型物的增加糖尿病的只有10个月后,由人同意这项发现et al。21]。这也是符合NF-H磷酸化的增加在这个时间点,因为它提供了一个衬底激活物(53]。激活物与神经生长因子和胰岛素有关撤军(7,54]。首次证明这几个激酶被激活在糖尿病和展示亲和力的不同阶段特定的神经丝亚基的表达也随糖尿病病程导致一个动态的异常磷酸化变化期间,糖尿病患者的照片。

如下所示三世微管蛋白表达在严重糖尿病严重削弱DRG神经元。微管的组装和微管蛋白形成,极化的方式组织“-”、“+”端,在发生聚合的微管蛋白二聚体(29日]。目前发现的表达下降-III-tubulin因此建议摄动聚合的微管蛋白二聚体。减少GSK-3受损的胰岛素和IGF-1-signaling可能抑制MAP1B磷酸化,从而进一步抑制微管蛋白的稳定性和组装的轴突运输(27]。因此出现明显的多个方面表达和postranslational事件确定正常组装neuroskeletal选民已经严重改变在急性期DPN导致受损轴突的成熟和退化。NF组件的顺序磷酸化以及不稳定的微管由几个压力激酶可以追溯到受损神经营养信号活动包括胰岛素本身。

支持这个概念发现更换insulinomimetic c -肽,它可实现胰岛素信号,纠正神经营养因子的表达,它们的受体和neuroskeletal蛋白质以及它们postranslational磷酸化(23,26,33]。这些效应转化为改善功能和改善受损的成熟,轴突萎缩和损失(23,34]。这种构造或许可以解释这一事实高胰岛素血2型BBZDR / Wor-rat原因大大温和影响神经营养因子及其受体(9,36)明显温和的功能性和轴突结构性赤字(2,9]。的变化和动态扰动的完整性neuroskeletal蛋白质不可避免地引起轴突功能障碍和错乱排列neuroskeletal组件如前所展示ultra-structurally [55),最终导致神经纤维轴突萎缩和进步的死亡的如下所示。

除了进步的退行性变化,额外的1型糖尿病神经病变的组合,不是先前认为的潜在影响演示的扰动在周围神经成熟。如下所示,有髓和无髓鞘的纤维数量和大小没有绝对值的变化在糖尿病动物2到10个月,而这两个参数在同一时间显著增加控制老鼠。大鼠周围神经成熟只是完成在6个月56人类)和相应的年龄超出25岁(57]。这表明代谢扰动干扰正常的成熟过程可能会妨碍神经生长和导致糖尿病性神经病都在人类和小鼠模型中,已经提出了糖尿病脑病附带的1型糖尿病。

总之,目前的研究表明,胰岛素和c -肽不足1型DPN组的运动动态级联事件导致抑制其他神经营养因子在一起导致受损neuroskeletal成分的表情。同时激活顺序stress-kinases导致的异常磷酸化影响轴突的函数,和促进进步的轴突增长赤字,萎缩和损失,DPN的标志。

承认

本研究支持部分由托马斯基金会(空军联队)和美国(空军联队和香港)。作者感谢詹姆斯·哈特菲尔德的技术援助electronmicroscopic的形态学研究。作者都没有任何经济利益与本研究相关。

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