文摘
1型糖尿病是由于胰腺β细胞的自身免疫性破坏,可能病毒发起。病毒感染诱发α干扰素(IFN -),导致upregulation双链(ds)依赖rna的抗病毒基因编码的酶-oligoadenylate合成酶()和PKR (2)。调查是否β细胞特异性抗病毒之间的差异可能是由于β和α细胞,我们用干扰素治疗β和αTC3细胞系和/或聚(我:C)(一种合成dsRNA)。结果表明,干扰素-刺激,增加作为测试版和活动水平明显高于α细胞,而增加PKR水平和活动比较在两种细胞类型。保利(我:C)刺激作为β但不是α细胞活动,以及co-transfection IFN -+聚(我:C)在β但不是α细胞诱导细胞凋亡。这些发现表明,升高胰腺β细胞的反应会使他们特别容易受到伤害和/或细胞凋亡在病毒感染。
1。介绍
1型糖尿病是一种常见的和多因子的疾病特点是谷胰岛素的胰腺β细胞的破坏。遗传和环境因素都扮演着重要的角色在1型糖尿病的病因。相当多的证据表明,肠病毒感染,尤其是B组柯萨基病毒,是一种重要的环境因子启动或促进β细胞损伤在1型糖尿病的发展。一系列潜在的芬兰的研究表明,有一种强烈的肠病毒感染之间的联系和β细胞自身免疫(1- - - - - -4]。频率的增加血清肠病毒抗原和抗体在临床前阶段观察肠病毒在儿童随后发达糖尿病(1,3,4]。同样,人们发现有一个时间联系抗病毒抗体和胰岛细胞自身抗体的出现前驱糖尿病的兄弟姐妹的1型糖尿病患者(2,4]。此外,这一发现的增加发生的细胞内enterovirus-RNA外周血淋巴细胞(PBL) 1型糖尿病的儿童体内(5)和新证据enteroviral感染从已故的1型糖尿病患者胰岛细胞6)强烈建议的可能性的参与持续感染肠病毒1型糖尿病的发展。
病毒感染诱导的I型干扰素(IFN -α/β),它通过干扰素受体介导JAK-STAT信号转导通路(7)诱导美洲国家组织和PKR基因编码抗病毒的关键酶-oligoadenylate合成酶()和proteinkinase 2 (PKR)。这两个和PKR表示为潜在的酶,酶的活动需要代数余子式,双链RNA(极),中间通常由病毒感染细胞的病毒复制。在dsRNA,激活当聚合ATP进有关oligoadenylates (),进而结合并激活潜在的内切核糖核酸酶,RNaseL。激活RNaseL降解细胞和病毒RNA,从而抑制蛋白质合成(8]。同样,PKR激活时,结伴autophosphorylates,导致磷酸化真核起始因子2 (eIF2)和抑制细胞蛋白质合成的9]。
人类组成一个家庭至少六酶亚型,由一群三个美洲国家组织编码基因,也就是说,OAS1-p42, p44, p46 p48, OAS2-p69 / p71, OAS3-p100 [10]。最近我们已经描述了一个新的剪接变体,添加一个新的酶对这个家庭同种型:OAS1-p52 [11]。我们已经表明,在抗病毒过程系统可能会导致1型糖尿病的发病机理12]。在几个独立的研究中,我们观察到显著增加活动在1型糖尿病患者与健康对照组(12,13]。最近,我们发现了一个非常重要的基底之间的联系活动和A / G拼接受体网站单核苷酸多态性(SNP)OAS1这种酶的基因,这表明基底活动强烈的基因控制(11]。我们还报道说,基因型的频率携带与高架活动相关的基因变异显著高于1型糖尿病患者比非糖尿病的对照组(14]。因此,我们原来的持续升高的结果活动在1型糖尿病患者相比,控制(12,13)至少在一定程度上是由基因决定的。换句话说,高活动可能是由于遗传和环境两方面的因素。然而,目前尚不清楚如何提升作为活动易诱发自身免疫1型糖尿病的发展。
大量的研究已经涉及干扰素-α(IFN -α)1型糖尿病发病机制的潜在中介。我们展示了作为高度诱导干扰素-活动α和聚(我:C) (polyinosinic: polycytidylic酸,合成dsRNA)在胰岛素生产RIN鼠β细胞系(15]。此外,我们表明,干扰素-α灵敏度并不仅仅是培养细胞系的特点,因为它也出现在PBL从diabetes-prone BB老鼠16]在新鲜分离大鼠胰岛和鼠β细胞(17]。在人类的小岛,其他调查人员表明,干扰素-α是新创enterovirus-infectedβ细胞产生的,但是不是enterovirus-infectedα细胞(18]。从这些数据,我们可以得出结论,β细胞不仅积极响应干扰素-α并产生重大活动,但也有能力合成干扰素-α(18]。因此惊讶,尽管这种高活性抗病毒防御系统,β细胞显示增加易受病毒感染(18,19]。几项研究已经表明干扰素-的存在α在人类的小岛,从胰腺β细胞局部,死去的人都与acutely-developing和长期存在的1型糖尿病(20.,21]。自干扰素-α半衰期很短,持续存在的胰岛细胞因子可能反映慢性或反复病毒感染和导致连续吗基因激活。最近的研究已经证明了肠道病毒的存在在人类β细胞的1型糖尿病患者(6,22,23),它提供了直接证据表明β细胞的特定病毒感染中扮演一个重要的角色在自身免疫性糖尿病的发展。dsrna产生在复制的DNA和RNA病毒(24]。病毒模拟聚(我:C)是一个可以刺激免疫反应的合成dsRNA病毒感染期间所观察到的类似。最近已经表明,免疫反应感应dsRNA或聚(我:C)是由toll样受体(通常),尤其是TLR3 [25]。它也表明,聚(我:C)可以诱导干扰素-α生产(26,27),干扰素-α诱发干扰素刺激基因(isg)包括作为和PKR28- - - - - -30.),因此调解先天免疫反应。
小鼠βTC3和αTC3细胞系transgenetically来源于胰岛瘤细胞瘤肿瘤细胞,产生胰岛素和胰高血糖素,分别针对正常生理信号。在目前的研究中,我们使用这两个细胞系作为模型是否功能性胰腺β和α细胞之间的差异在他们的天生的抗病毒免疫反应可以解释β细胞目标特异性自身免疫性破坏特征出现在1型糖尿病。更具体地说,我们测试的假设胰腺β和α细胞不同于彼此的和PKR响应和当用干扰素刺激——他们对细胞凋亡的敏感性α和/或聚(我:C)。
2。材料和方法
2.1。试剂
保利(我:C), (α32P) atp, (32从AmershamPharmacia P) atp。Creatinekinase和磷酸肌酸从Boehringer-Mannheim购买(德国曼海姆)。德勤,三,FCS、青霉素和链霉素来自表达载体。300多字母玻璃纸裴(polyetheleneimine)色谱板来自Machery-Nagel (Duren,德国)。鼠标干扰素-α从研发系统。BCA (bicinchoninic酸)和增强发射极耦合逻辑工具来自皮尔斯。
2.2。细胞培养和刺激细胞的干扰素-α
小鼠βTC3和αTC3细胞系被博士d Hanahan友情提供,加州大学,旧金山。βTC3细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和1000 mg / L d -葡萄糖,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100g / mL)补充10%胎牛血清的边后卫在37在5%的公司2的气氛。αTC3在DMEM培养基培养细胞含有4500 mg / L d -葡萄糖和15%的边后卫。在接近confluency、中包含指定数量的干扰素-α是补充道。后2、6、12和24小时的潜伏期的存在与否500 U /毫升IFN -α细胞使胰蛋白酶化和准备的分析作为活动。
2.3。鼠标IFN -建设α4,TLR3 cDNAs-Containing向量pcDNA3.1-mIFN -α4和pcDNA3.1-mTLR3
小鼠的整个长度干扰素-α4和TLR3互补放大了rt - pcr从βTC3细胞总RNA提取500 U /毫升IFN -对待α。PCR引物是- - - - - -CTCGAGACCAGCATCTACAAGACCCA -(向前,CTCGAG-XhoI)和- - - - - -GGATCCTCCACA-CTTTGTCTCAGGAC -(反向,GGATCC-BamHI)鼠标干扰素-α4(基因库加入X01973数量)- - - - - -CTCGAGCACCCATAATCTGGGCTGAA -(前轮驱动,CTCGAG-XhoI)和- - - - - -GGATCCCCCTTTACCGACTCC-AAATC -(牧师,GGATCC-BamHI)鼠标TLR3(加入基因库NM_126166数量)。放大的互补是插入到哺乳动物的向量,pcDNA3.1(英杰公司)使用限制性内切酶XhoI和Bam嗨网站。最后mIFN -α4和mTLR3结构经DNA测序。
2.4。转染小鼠胰腺βTC3和αTC3的细胞
瞬时转染的pcDNA3.1-mIFN -α4、pcDNA3.1-mTLR3向量以及保利(我:C)为小鼠胰腺βTC3和αTC3细胞进行使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。哺乳动物表达载体pcDNA3.1作为消极的控制。转染,8克每一个质粒和5克保利(我:C)被添加到包含大约60毫米培养皿细胞在DMEM补充10%或15%的边后卫。24小时孵化后,转染细胞使胰蛋白酶化的分析和准备酶活性和西方的屁股。转染效率监控包括beta-galactosidase-containing向量(pcDNA3.1-beta-gal, 0.6g)在αβTC3 TC3的转染细胞。转染效率是由分析活动的细胞溶解产物β-半乳糖()和正常化总蛋白()。β和αTC3细胞转染效率是相同的;α和β细胞之间没有明显差异。
2.5。免疫印迹分析
细胞蛋白质sds - page分离12%,转移到硝化纤维素膜(σ)。与5%的牛血清白蛋白阻塞后1小时,膜被孵化的兔多克隆抗体对重组人蛋白质分离用杆状病毒感染昆虫细胞表达系统。这与小鼠多克隆抗体交叉反应检测小鼠第42页同种型,对应于42 kDa的分子量。测定PKR、多克隆抗体对人类PKR使用。检测细胞凋亡与干扰素治疗后α保利(我:C),多克隆抗体对小鼠半胱天冬酶3(细胞信号)。墨迹是孵化horseradish-conjugated二级抗体增强化学发光检测(皮尔斯)紧随其后。这些墨迹被扫描和量化的使用数量一个一维图像分析软件(BioRad)。%增加蛋白表达是评估通过比较蛋白带的密度,规范化的管家GAPDH基因。
2.6。分析25和PKR酶活性
活动确定了在αβTC3 TC3培养细胞溶解产物如前所述[17]。使胰蛋白酶化细胞被洗了三次PBS和溶菌产物0.5% NP-40就做好了准备。蛋白质浓度的每个细胞溶解产物决心BCA测定和调整1.5 - -3.0毫克/毫升之前测量酶活性。的测定与0.15活动,溶解产物孵化μCiα32120年P-ATP 30分钟在100年的存在g / mL保利(我:C)。生成的-oligoadenylates (A)被提升TLC分离在裴板块三羟甲基氨基甲烷缓冲液(2毫米,pH值8.62)。每毫克的蛋白质酶活性表达单位。一个单位的酶活性被定义为每分钟nanomoles ATP转换。PKR活动的分析,溶解产物与0.15孵化μCiα32120年P-ATP 30分钟在0.1μg / mL保利(我:C)。定量的PKR autophosphorylating活动是由32P-ATP放射自显影法。
2.7。流式细胞仪分析细胞凋亡
流式细胞仪分析细胞凋亡,αβTC3 TC3细胞的密度/(24孔板)和0.8是暂时性的转染μg pcDNA3.1-mIFN -α4和0.8μ克保利(我:C)。空质粒pcDNA3.1作为消极的控制。24小时孵化后,细胞样本分析Annexin-V-PE和7-AAD染色设备(BD生物科学)根据制造商的指示。短暂、中被撤在PBS洗井和细胞,使胰蛋白酶化剥离下来。细胞颗粒在1 x resuspended绑定缓冲的浓度/毫升。5L annexin-V-PE, 7-AAD添加到100年L细胞悬液。在黑暗中孕育了混合物在室温下15分钟,洗一次,流式细胞仪缓冲了。样本然后分析FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)。二万细胞/样本收集。
2.8。统计分析
所有的结果提出了三个独立实验的平均数±标准差。组之间的差异进行统计学意义使用单向方差分析(方差分析)。百分比增加蛋白质浓度或酶活性与干扰素刺激——24小时后α计算相对于non-stimulated值,100%的人表示没有增加。的值被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。干扰素-α诱导高25蛋白质含量和酶活性比αβTC3 TC3细胞
确定干扰素-α刺激的表达,免疫印迹和酶化验进行溶菌产物β和αTC3细胞干扰素- 24小时后α治疗。如图1表达的蛋白质含量和酶的活动后增加干扰素-α刺激βTC3和αTC3细胞。然而,增加随着蛋白质水平(图1(一)(图)和酶的活动1 (b)在βα)显著高于TC3细胞。此外,增加的在应对干扰素-蛋白质/活动α刺激了更dose-dependant比αβTC3细胞TC3细胞。
(一)
(b)
3.2。25活动是高度诱导干扰素-α在αβ细胞TC3但不是TC3细胞
进一步调查的表达增加如下干扰素-α感应,时间进程进行研究。图2显示了溶菌产物酶活性的βTC3培养(图2(一个)(图)和αTC3细胞2 (b))存在与否的500 U /毫升干扰素-α表示时间。在βTC3细胞中,有一个强大的时间增加在应对干扰素-活动α刺激,在24小时内从693%到844%不等(SD不同在不同的细胞培养)6 - 13%之间。在阿尔法TC3细胞,然而,有一个非常弱的增加活动,在24小时内从178%到209%不等。β和αTC3细胞之间的区别意味着最大活动是统计上非常重要(769%比189%,;看到总结表1)。本构(non-stimulated)活动是在两个细胞类型(图类似2)。
(一)
(b)
3.3。PKR蛋白质含量和酶活性调节同样在αβTC3 TC3细胞
PKR也是一种干扰素-α刺激基因,因此进行了类似的实验来确定PKR表达干扰素-的反应α治疗。PKR蛋白的表达水平是决定分子2之和PKR和PKR p48免疫反应降解产物的分子,如前所述[31日,32)(图3)。因为PKR活动抑制高聚(我:C)浓度,低浓度的0.1g / ml的孵化项目用于测量PKR活动。图3显示了upregulation PKR蛋白质的αβTC3 TC3在存在500或2000 U /毫升IFN -α。PKR蛋白质水平调节了166%和192%,分别在βTC3细胞和细胞αTC3的171%和208%。因此,类似的PKR蛋白质诱导干扰素-α刺激细胞类型。此外,增加autophosphorylating PKR活动与500 U /毫升IFN -刺激后αβ细胞TC3之间无显著差别(151%±13日)和αTC3细胞(121%±19日)(图4和表1)。
3.4。保利(我:C)诱导表达25在αβTC3但不是TC3细胞
自聚(我:C)是一种强有力的干扰素-α诱导物(26,27),聚(我:C)是暂时性的转染成αβTC3 TC3细胞,没有与鼠标或干扰素-α4 cDNA-containing质粒,以确定对表达的影响作为蛋白质。小鼠干扰素-α4是一个即早期可以由幼稚细胞产生干扰素和病毒感染。为了引起更高的活性,我们使用了一个干扰素-α4-containing质粒overexpressing I型干扰素的细胞系来模拟细胞经历急性病毒性感染的情况。如图5独自,引入聚(我:C)产生显著增加随着蛋白质水平(图5(一个)(图)和酶的活动5 (b))βTC3的细胞,但不是在αTC3细胞。虽然转染小鼠干扰素-α4 cDNA导致显著增加如β和αTC3细胞表达,增加的幅度要高得多在βαTC3细胞(图5)。然而,co-transfection保利(我:C)和pcDNA3.1-mIFN -α4没有导致任何进一步的增加蛋白质(图5(一个))或酶活性(图5 (b)mIFN——相比)α4治疗独自在α或βTC3 TC3细胞。
(一)
(b)
3.5。诱导25通过聚βTC3细胞(我:C)不是由TLR3增强超表达
调查是否TLR3 upregulation发挥作用的由保利(我:C),类似的转染实验进行αβTC3 TC3细胞用鼠标TLR3cDNA-containing向量。结果呈现在图6确认保利(我:C)显著增加蛋白质含量和酶活性βTC3的细胞,但不是在αTC3细胞。在β细胞TC3 co-transfection保利(我:C)和pcDNA3.1-mTLR3似乎诱导的高表达如(图6(一)),但没有观察到的统计上的显著差异活动在保利(我:C)只处理和co-transfection组(图6 (b))。在阿尔法TC3细胞,co-transfection保利(我:C)和mTLR3 cDNA表达没有影响如(图6)。基底TLR3 mRNA的表达由实时rt - pcr是相似的两个细胞系(数据未显示)。
(一)
(b)
3.6。干扰素-α和聚(我:C)诱导细胞凋亡在αβ细胞TC3但不是TC3细胞
为了确定高表达凋亡、免疫印迹和流式细胞术被用来演示细胞凋亡在转染细胞的存在。裂解半胱天冬酶3是被特定anti-caspase 3抗体保利(我:C)转染后,mIFN -α4,或聚(我:C) + mIFN -α4成αβTC3 TC3细胞。如图7,co-transfection pcDNA3.1-mIFN -α4和聚(我:C)诱导细胞凋亡,但只在βTC3细胞。细胞凋亡诱导以流式细胞仪分析产生相似的结果(图8利用免疫印迹分析)。αTC3细胞耐药细胞凋亡;与保利(我:C)既不刺激,mIFN -α4也co-stimulation保利(我:C)和mIFN -α4检测细胞凋亡诱导与控制细胞(数字8 (b)和8 (c))。然而,βTC3细胞表现出显著的凋亡易感性(数据8(一个)和8 (c))。在这些细胞,刺激与聚(我:C)诱导细胞凋亡治疗多2.90%的细胞比未经处理的控制细胞(),mIFN -α4诱导细胞凋亡增加了5.87%(与控制,),co-transfection mIFN -α4和聚(我:C)诱导细胞凋亡18.76%(与控制,)。
| (一) |
| (b) |
(c)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们发现有一个老鼠胰腺β和αTC3细胞功能的区别在应对干扰素-感应α刺激。首先,海拔的蛋白质含量和酶活性明显高于在βαTC3细胞干扰素-α刺激(图1)。此外,只有βTC3细胞表现出强烈的剂量依赖时间的增加干扰素-后,酶活性α治疗(数据1 (b)和2)。其次,引入聚(我:C)(一种合成dsRNA)刺激表达和活动在αβ细胞TC3但不是TC3细胞(数字5和6)。最后,过度的干扰素-α,有或没有聚(我:C),但不是在αβTC3发生凋亡细胞TC3细胞(数字7和8)。不太可能观察到胰腺β和α细胞之间的差异是由于使用转化细胞系,因为之前我们发现增加干扰素-后活动α刺激主鼠β细胞而不是鼠non-beta(主要是α)胰岛细胞(17]。结果显示,胰腺β细胞本质上有了更多的反应元素的活化比α细胞系统。
然而,没有区别β和αTC3 PKR诱导细胞观察,另一极和干扰素-α端依赖抗病毒酶。表达蛋白质含量和酶活性的PKR在β和αTC3同样调节细胞。在这两种细胞类型,2及其p48降解产物检测按照早期的发现(31日,32]。表达PKR在老鼠,老鼠和人类胰岛dsRNA刺激后,柯萨基病毒感染(33,34]。虽然两,PKR依赖dsRNA作为辅因子激活,众所周知,他们在极显著差异激活所需浓度(9]。PKR在dsRNA激活所需浓度低于100倍激活,成为抑制dsRNA更高浓度(35]。因此,在低细胞dsRNA PKR-dependent抑制蛋白质合成的浓度可能会增加细胞凋亡的风险,但在较高的浓度AS-RNaseL系统[36,37)可以促进凋亡过程。重要的是,我们分析了PKR活动dsRNA浓度很低,而不是更高的抑制浓度,发现了类似的βTC3 PKR活动和αTC3细胞(图4和表1)。这一结果表明,如果有差异抗病毒activity-mediated胰腺β和α细胞之间的细胞凋亡,并不是由于PKR-induced凋亡的差异。
尽管表达和活性转染后被类似的干扰素-α向量co-transfection干扰素-相比α加保利(我:C),在α和βTC3细胞(图5),我们指出,在βTC3的细胞,细胞凋亡蛋白酶3分裂和凋亡干扰素-后非常显著升高α+保利(我:C) co-transfection相比干扰素-α独自一人(数据7和8)。目前,我们不知道这种差异对的原因的活动和apoptosis-induction co-transfectedβTC3细胞。的在β细胞酶活性达到最大生物水平与干扰素α孤独和被停止响应与保利(我:C)额外的刺激,而干扰素的凋亡反应α刺激β细胞进一步增强了聚(我:C)。这可能是由于保利(我:C)本身的毒性β(但不是α)细胞,尽管单独聚(我:C)只对β细胞凋亡(图一个有限的影响8 (c))。或者,这可能是由于其他一些不明pro-apoptotic效应引起的极结构,但独立的酶活性。有趣的是,在人类有报道称p48同种型的(编码OAS1独立于它的合成酶基因)pro-apoptotic活动活动(38),一个就像蛋白(编码密切相关OASL基因对病毒感染但没有合成酶活性(39,40]。然而,co-transfection above-noted差异的实验并不能否定干扰素-越高的建议α刺激β细胞的反应比α细胞(数字2和5)导致更大的细胞凋亡后观察干扰素-α相比,β细胞转染α细胞(图8)。情况很复杂,因为保利(我:C)是一个代数余子式作为强有力的激活和干扰素-α诱导物。如图5,作为活动α细胞不受保利(我:C),表明聚(我:C)不能诱导干扰素-α生产α细胞。这种假设与干扰素的观察——是相一致的α可以发现在enterovirus-infectedβ细胞而不是enterovirus-infectedα细胞(18]。在人类中,干扰素α诱发40多个已知IFN-stimulated基因(研究小组),其中dsRNA-dependent抗病毒酶作为和PKR和凋亡细胞死亡有关。因为没有PKR蛋白质水平和酶活性差异β和α细胞,我们建议β细胞的强大为响应单独聚(我:C)和干扰素-α独自一人(数据2和5)是一个至关重要的因素更大的细胞凋亡在βα胰腺细胞相比。
β细胞的内在因素是什么导致更高的激活吗系统以应对IFN -α和聚(我:C) ?一个可能的因素是胰腺β细胞的特征,也就是说,其高胰岛素合成。众所周知,在病毒感染过程中,胰岛素合成增加压力反应的一部分。此外,在开发期间的1型糖尿病,胰岛素合成增加,试图降低高血糖水平由减少β细胞群。我们有初步证据(在下面描述),增加胰岛素合成增加干扰素——的影响α或聚(我:C)对β细胞活动和细胞凋亡,可能是通过代dsRNA结构在胰岛素基因转录。正如前面所提到的,是表示为一个潜在的酶,需要dsRNA(例如,由复制病毒)成为激活。绑定的极生成一个构象的变化所必需的酶激活(41]。现在有数据支持的存在内生dsRNA [42]。此外,它已经表明,小单链RNA配体也可以激活(43]。单链mRNA也可以发挥作用激活,因为mRNA据报道是一个强大的内生活化剂的toll样受体3 (TLR3),可能通过二级dsRNA-like结构(44]。我们已经初步数据显示,βTC3细胞凋亡明显增加β细胞培养时高glucose-containing中(20更易/ L)与低葡萄糖中(5更易/ L),其次是治疗干扰素-α(1000 U /毫升)或聚(我:C) (50μg / mL) 24小时(Bonnevie-Nielsen et al .,未发表的数据),这表明较高的转录率由高葡萄糖刺激的胰岛素显著增强β细胞对凋亡的敏感性。αTC3细胞显示凋亡反应任何治疗或葡萄糖条件(注意,这些结果也暗示高葡萄糖本身不促进细胞凋亡)。其他初步研究表明β细胞处理聚(我:C) 24小时显示更高活动(约2.5倍)在高葡萄糖相比低葡萄糖培养基培养(Bonnevie-Nielsen et al .,未发表的数据)。总的来说,这些发现表明,更高的胰岛素对激活的转录率有强烈的影响由保利(我:C)和β细胞凋亡敏感性当保利(我:C)或干扰素治疗α。因此,我们假设在β细胞胰岛素基因转录增加病毒感染和/或在1型糖尿病的发展可能产生dsRNA-like结构增强活动和促进β细胞凋亡。符合这一假说,是良好的遗传多态性(可变数目串联重复序列,VNTR)启动子区域的人类胰岛素基因改变对1型糖尿病的易感性,这类我(short-repeat) VNTR等位基因与患1型糖尿病的风险增加密切相关(45,46),这类我等位基因也增加胰腺β细胞胰岛素基因转录率(47]。因此,较高的胰岛素转录与类人我纯合基因型可能基因使他们更容易患上糖尿病通过提供增加内源性dsRNA-like分子导致的来源在β细胞活化,尤其是在病毒感染(图9)。显然,需要更多的研究来测试的“高胰岛素转录率假说”β细胞对凋亡的敏感性。
在病毒感染中,干扰素-α诱导和dsrna生成。干扰素-α刺激通过激活先天免疫系统的抗病毒活性转录isg包括PKR和(21,27,29日,48]。dsRNA不仅是一个重要的辅助因子的激活抗病毒酶,但也会导致感应抗病毒酶直接或通过TLR3-mediated激活干扰素调节因子3 (IRF-3)和NF-kB信号通路(49]。尽管我们发现TLR3并未增加感应的聚(我:C)βTC3细胞(图6),其他报道,激活TLR3通过NF-kB dsRNA增加β细胞凋亡和STAT-150]。因此,极可能导致β细胞凋亡通过多种途径。增加的活动AS-RNaseL系统已经被证明可以诱导细胞凋亡在几个细胞类型和是一个重要的机制,使病毒复制和传播是受限制的36,37]。此外,如前所述,一个作为同种型能促进细胞凋亡独立合成酶激活RNaseL [38]。尽管流行病学和病理研究表明,肠道病毒与1型糖尿病的发展,这些病毒对胰腺β细胞的选择性取向的因素和确定β细胞对病毒感染的敏感性仍不清楚。据报道,政府的聚(我:C)加速糖尿病的发展DP-BB老鼠,还有一个dose-relationship保利(我:C)与血清干扰素-α水平和糖尿病的发病时间(51]。干扰素-α已经检测到残余胰岛细胞从已故的最近研究或长期的1型糖尿病患者(20.,21)和干扰素-α据报道,是一个潜在的1型糖尿病引起的中介保利C57BL / 6小鼠(我:C)表达B7.1 costimulatory蛋白质在小岛52]。有些矛盾的是,它也被报道,诱导干扰素在感染病毒的β细胞是至关重要的生存在病毒感染(18,53]。增加数量的enteroviral感染在前驱糖尿病的个体(已报告2,4,54),最近发现肠道病毒1型糖尿病患者的胰腺组织(6,22,23]。总的来说,这些发现表明,胰腺癌发病之前和期间可能出现病毒感染的临床糖尿病,这改变的抗病毒防御病毒感染胰腺β细胞可能会影响对I型糖尿病的易感性。
根据我们的数据和各种各样的临床和流行病学观察前面所提到的,因此,我们建议在致糖尿病的病毒,感染AS-RNaseL系统干扰素-β细胞就被激活了α在病毒复制,而生产dsRNA以及dsRNA-like分子在增加胰岛素导致进一步的美洲国家组织诱导基因转录(直接或通过TLR3-mediated信号通路)和激活通过dsRNA(图9)。明显的活动的增加AS-RNaseL系统将有害的β细胞,使它们更容易损伤/死亡在病毒感染。随后minor-but-critical由于高β细胞的凋亡活动将允许隔离β细胞抗原暴露于免疫系统,它(在个体遗传易感性,例如,HLA基因)可能引发自身免疫反应,最终破坏胰腺β细胞群。基因变异,提高本构活动也会促进这个过程,如OAS1剪切位点多态性,我们和其他人已经报道与1型糖尿病有关(14,55),胰岛素和胰岛素VNTR基因转录和1型糖尿病45- - - - - -47]。相比之下,相对较低的活动的AS-RNaseL系统在α细胞将不会导致任何重要的细胞凋亡在病毒感染。因此,我们推测,病毒感染引起over-reactivityβ细胞的先天免疫系统,促进β细胞凋亡和自身免疫。措施旨在调节β细胞抗病毒反应前驱糖尿病的阶段基因高风险儿童可以帮助保护β细胞群,从而防止或减少患1型糖尿病的风险。
5。结论
总之,本研究表明,干扰素-α刺激,增加蛋白质含量和酶活性明显高于在βαTC3细胞()。它还表明,聚(我:C)刺激酶活性的βTC3细胞而不是αTC3细胞,这co-transfection干扰素-α和聚(我:C)诱导细胞凋亡在αβTC3但不是TC3细胞。结果表明,增加胰腺β细胞的活动会使它们特别容易受到细胞凋亡在病毒感染和随后的自身免疫性破坏。
缩写
| 为: | -oligoadenylate合成酶 |
| 极: | 双链RNA |
| 干扰素: | 干扰素 |
| 研究小组: | 干扰素刺激基因 |
| PKR: | Proteinkinase 2 |
| 保利(我:C): | Polyinosinic: polycytidylic酸 |
| 出版广播公司: | 外周血淋巴细胞 |
| TLR3: | toll样受体3。 |
确认
这项工作是支持的奖项从丹麦VBN健康科学研究理事会,丹麦糖尿病协会,NovoNordisk基金会,丹麦、国际青少年糖尿病研究基金会,和高级Investigatorship工资奖励VBN和里夫从英国哥伦比亚大学儿童医院基金会,加拿大温哥华。我们要感谢p博士Møller Martensen、部门的分子和结构生物学、奥尔胡斯,丹麦奥尔胡斯大学为她贡献的试剂。