文摘

增加肌肉负荷导致70 kDa核糖体S6激酶的磷酸化(p70S6k),和这个事件有很强的相关性程度的肌肉适应抵抗运动后。胰岛素抵抗或是否与此疾病相关的并发症可能影响骨骼肌的运动刺激后激活p70S6k信号尚不清楚。这里,我们比较p70S6k的contraction-induced激活信号精益和跖肌肌肉的胰岛素抵抗肥胖Zucker老鼠后一次收缩荷载的增加。瘦的动物相比,p70S6k基底磷酸化(Thr389;%和Thr421 / Ser424;%),一种蛋白激酶(Thr308;%),mTOR (Ser2448;%)在肥胖动物高。收缩增加p70S6k的磷酸化(Thr389),一种蛋白激酶(Ser473)和mTOR (Ser2448)然而在两种模式之间激活不同的大小和动力学模型。这些结果表明,contraction-induced激活p70S6k信号改变肌肉的胰岛素抵抗肥胖Zucker老鼠。

1。介绍

胰岛素抵抗是一种重要的健康问题,在世界范围内迅速增加。如果允许之前未经胰岛素抵抗往往导致发病率和死亡率增加。无氧运动最近被公认的潜在好处是治疗这种情况(1- - - - - -4),发现了进步的阻力训练改善血糖控制,增加骨骼肌大小和强度,同时减少内脏和总脂肪(5- - - - - -7]。胰岛素抵抗是否会影响肌肉如何回应阻力训练是未知的,但差异的存在,如果存在,这可能有助于解释为什么运动性骨骼肌肌肉正常和糖尿病之间的适应性可能不同(8- - - - - -10]。

最近的体外和体内研究表明,增加肌肉负荷与利率的增加积累和肌肉蛋白的合成11- - - - - -14]。这在蛋白质合成增加,至少在某种程度上,被认为是由p70核糖体蛋白S6激酶的磷酸化(p70S6k) [11,15,16)和哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)函数作为生长因子和nutrient-sensing信号分子在哺乳动物细胞(17]。如何调制mTOR活动并不完全清楚;但是先前的研究已经报道,抵抗运动增加mTOR通过上游通路活动涉及磷酸肌醇3-kinase (PI3K)和蛋白激酶B (PKB) / Akt (15,18,19]。其他工作已经表明,PI3K / Akt信号通路的活性可以消极监管磷酸酶和tensin同系物删除(PTEN)[10号染色体上20.]。如何规范这些通路的活性增加肌肉收缩后如果胰岛素抵抗影响这些过程不清楚。

本研究的目的是确定运动p70S6k信号改变的骨骼肌胰岛素抵抗肥胖Zucker老鼠。我们假设contraction-induced p70S6k信号将正常和胰岛素抵抗之间的不同肌肉。为了验证这个假设,p70S6k及其通路的激活相关蛋白质mTOR, Akt, PTEN在跖肌肌肉的正常和评估胰岛素抵抗大鼠后立即或在复苏阶段高频电刺激的急性发作。我们的研究表明,胰岛素抵抗或与这种疾病相关的并发症可能影响肌肉调节contractile-induced信号。

2。材料和方法

2.1。动物保健

所有程序中进行指导的实验室动物保健和使用委员会批准美国生理协会和机构的动物使用审查委员会。年轻(10周,n= 12)男性精益正常Zucker (LNZ)和年轻的(10周,n= 12)男性肥胖x综合症Zucker (OSXZ)老鼠从查尔斯河实验室获得。老鼠被安置两个AAALAC批准动物园的笼子里。住房条件包括12 H: 12 H和温度维持在暗光周期±c .动物提供了食物和水随意和被允许恢复装船前至少两周的实验。在此期间动物的观察很仔细,每周称重,确保没有表现出未能茁壮成长的迹象,如急剧减肥,对环境不感兴趣,或意想不到的步态变化。

2.2。材料

Anti-p70S6k(# 9202),一种蛋白激酶(# 9272),mTOR(# 2972),糖原合成酶激酶3(GSK-3)(# 9332),PTEN (# 9552), Thr389(# 9206)和421 Ser / Thr 424(# 9204)磷酸化p70S6K Thr308(# 9275)和Ser473(# 9271)磷酸化Akt, Ser2448磷酸化mTOR (# 2971), Ser 9磷酸化GSK-3(# 9336),380年Ser / Thr 382/383磷酸化PTEN(# 9554),小鼠免疫球蛋白,兔免疫球蛋白抗体购自细胞信号技术(贝弗利,MA)。增强化学发光(ECL)免疫印迹检测试剂是Amersham生物科学(皮斯卡塔韦,NJ)。恢复免疫印迹剥离缓冲区得到皮尔斯(罗克福德,IL)和3 t3细胞溶解产物来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。其他化学物质都是购自σ(密苏里州圣路易斯或费舍尔科学(汉诺威,IL)。

2.3。骨骼肌收缩的刺激

高频电刺激(高频)模型之前描述(21)和选择的基础上,其功效在刺激体内蛋白质翻译和肌肉肥大(11]。本研究中使用的高频模型产生10套6宫缩的总体协议时间22分钟。这个协议导致同心(缩短)跖肌和比目鱼肌的收缩和偏心(延长)收缩的反伊斯兰教英国防御联盟和助教。动物被致命剂量的戊巴比妥钠在基线,高频后后1到3个小时。切除后,肌肉涂抹干燥,减少可见脂肪和肌腱预测,重,立即在液态氮冷冻,存储C。

2.4。制备蛋白质分离和免疫印迹

跖肌肌肉粉在液氮使用杵和臼,直到细粉。与冰冷的PBS洗涤后,颗粒细胞溶解在冰在15分钟T-PER裂解缓冲由T-PER试剂(2 mL / g组织重量)(皮尔斯,罗克福德,IL), 1毫米乙二胺四乙酸(EDTA);pH值8.0),1毫米乙二醇四乙酸(EGTA;pH值7.5),1毫米氯化镁,甲苯sulfonylfluoride (PMSF), 1L蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,1毫米钒酸钠抑制磷酸酶活性,然后离心10分钟2000 g颗粒颗粒物质。这个过程重复两次,使用布拉德福德supernants结合蛋白质浓度测定方法(皮尔斯,罗克福德,IL)。样本稀释浓度的3克/L在SDS加载缓冲区,煮5分钟,60使用10% sds - page凝胶g蛋白质的分离。在硝化纤维膜蛋白的转移,转移验证,确定车道之间的平等的加载和膜决心先前概述(22]。抗体蛋白质immunodetection进行概述的制造商在免疫反应性的乐队可视化与发射极耦合逻辑(Amersham生物科学)。曝光时间被调整至集成光学密度保持在线性和非饱和范围。带信号强度归一化肌动蛋白微使用平板扫描仪(爱普生完美3200图)和成像软件(AlphaEaseFC)。分子量标记(细胞信号)被用作分子质量标准和NIH 3 t3细胞溶解产物作为积极的控制。之间,允许直接比较不同的信号分子的浓度水平,免疫印迹被reprobed和恢复免疫印迹剥离缓冲详细的制造商(皮尔斯,罗克福德,IL)。

2.5。统计分析

结果提出了的意思扫描电镜。数据分析通过使用3.0σ统计统计程序。胰岛素抵抗在蛋白质磷酸化的影响进行了分析使用双向方差分析其次是Student-Newman-Keuls因果测试在适当的时候。差异被认为是重要的

3所示。结果

老鼠的平均体重肥胖Zucker高出82.0%(597±21.7通用汽车和328±12.2通用)比精益同行()。跖肌肌肉肥胖Zucker老鼠表示为一个百分比的体重低于35.9%(0.41±0.01和1.14±0.04毫克/通用)的精益Zucker鼠(P< . 05)。

3.1。Akt-p70S6k通路蛋白表达和基底磷酸化水平改变骨骼肌的肥胖Zucker老鼠

免疫印迹分析表明p70S6k和GSK-3的表达水平~ 10% ~ 12%更高的肥胖Zucker跖肌肌肉相比,从精益Zucker获得(P< . 05)(图1)。没有显著差异的一种蛋白激酶,mTOR或PTEN蛋白(图的内容1)。p70S6k、mTOR Akt, GSK-3,PTEN被认为是受磷酸化;感兴趣的是确定基底这些蛋白质磷酸化状态的改变与胰岛素抵抗。使用phospho-specific抗体表明,免疫印迹,基础水平的磷酸化p70S6k (Thr389)和p70S6k (Thr421 / Ser424)高出37.2%和101.4%,分别在肥胖Zucker跖肌(P< . 05)(图2)。同样,基础水平的磷酸化mTOR (Ser 2448),一种蛋白激酶(Ser 308), GSK-3380 (Ser 9), PTEN (Ser / Thr 382/383)为63.0%,25.1%,17.5%和31.4%,分别与胰岛素抵抗P< . 05)(数据3- - - - - -6)。一种蛋白激酶(Ser473)与胰岛素抵抗(图磷酸化并不是不同的4)。

3.2。Akt-p70S6k信号以响应调节骨骼肌的收缩刺激改变肥胖Zucker老鼠

磷酸化的p70S6k mTOR Akt, PTEN和GSK-3在行使跖肌肌肉决心(0,1,3小时后的高频并与控制(如果)肌肉。Contraction-induced这些分子的磷酸化精益和肥胖Zucker老鼠之间的比较。在每个分子的情况下检查,精益和肥胖Zucker鼠模型之间存在显著差异(数字2- - - - - -6)。在精益Zucker p70S6k (Thr389)磷酸化增加了112.8%,130.0%,和96.2%的磷酸化p70S6k(刺421 / Ser424)增加了429.8%,354.5%,和319.2%(0,1,3小时后分别练习(P< . 05)。在肥胖Zucker高频增加p70S6k (Thr389)磷酸化79.9%,43.6%和104.5%的磷酸化p70S6k(424年刺421 / Ser) 158.9%, 127.8%,和238.6%,0,1,,3小时后运动,分别是(P< . 05)(图2)。在精益Zucker动物,mTOR的磷酸化水平(Ser2448)增加了121.7%,115.5%,和113.8%,从基线(0,1和3小时运动后,分别为(P< . 05)(图32448年)而mTOR (Ser)磷酸化在肥胖动物增加了51.8%,47.4%,24.5%在同一时间段(P< . 05)(图3)。

精益动物增加了一种蛋白激酶的磷酸化(Thr308) 59.9%和40.8%后1小时后运动的同时Akt (Ser473)增长了109.9%,23.7%,和105.9%,0,1,,3小时后运动,分别是(P< . 05)(图4)。相反,在肥胖的动物,一种蛋白激酶(Thr308) phoshorylation下降了21.5%,18.8%,和15.3%,0,1,,3小时后运动虽然一种蛋白激酶的磷酸化(Ser473)增加了81.8%和140.9%,0,和运动后3小时(P< . 05)(图4)。

确认这些差异在一种蛋白激酶磷酸化,高频GSK-3增加(Ser 9)磷酸化精益动物的36.9%,30.4%,和23.4%,0,1,3小时后运动(P< . 05)(图5)。GSK-3(Ser 9)磷酸化与肥胖跖肌萎缩并没有改变。在精益的动物,PTEN (Ser380 / Thr382/383)磷酸化增加23.1%在3小时后运动而相反,在肥胖Zucker动物,PTEN磷酸化下降了18.3%,23.0%,和13.1%,0,1和3小时后运动,分别是(P< . 05)(图6)。

4所示。讨论

肥胖Zucker (足总/足总)大鼠骨骼肌胰岛素抵抗是一种成熟的动物模型,其特点是高胰岛素血症,葡萄糖耐受不良,血脂异常,和中央肥胖。最近的数据表明,正常和胰岛素抵抗肌肉可能适应不同运动方式(1,8,10,23- - - - - -25]。负责这些差异的分子机制(s)没有被广泛的研究。我们检查,如果contractile-induced肌肉信号改变肥胖Zucker老鼠。综上所述,我们的数据表明,胰岛素抵抗可能与骨骼肌的差异如何调控有关Akt-p70S6k信号后急性的高强度肌肉收缩。

4.1。胰岛素抵抗肌肉与Akt通路和基底磷酸化蛋白质含量的变化

类似于使用肥胖老鼠(以前的工作26和老鼠27),我们表明,胰岛素抵抗肌肉与p70S6k信号通路是如何监管的差异。具体来说,我们发现p70S6k的基底磷酸化水平,mTOR, Akt, GSK-3更高的肥胖大鼠的胰岛素抵抗跖肌肌肉相比,发现精益同行(数据吗2- - - - - -5)。之前的数据表明,高胰岛素血症和/或高血糖可能增加Akt蛋白和Akt通路激活(28- - - - - -31日]。例如,最近的研究报告说,肥胖Zucker肾脏展览增加了一种蛋白激酶磷酸化的激酶活性和表达一种蛋白激酶和mTOR观察精益Zucker动物(32]。增加循环氨基酸水平也可以激活mTOR [29日,33]。高胰岛素或氨基酸是否负责改变我们观察在目前的研究中是未知的。进一步实验可能采用其他方法分析或方法是必要的,以便更好地理解如何改变基底p70S6k磷酸化,mTOR, Akt, GSK-3可能导致胰岛素抵抗的病理生理学。

4.2。胰岛素抵抗与变更有关Akt Contraction-Induced激活的信号

以前的工作表明,抵抗运动能够增加p70S6k[的磷酸化(激活)11]。激活p70S6k反过来,被认为使磷酸化核糖体蛋白S6启用的老年病前信使rna编码转化机械和核糖体蛋白(34]。这里我们报告的大小和时间的contraction-induced p70S6k的磷酸化(刺389)和p70S6k(424年刺421 / Ser)似乎明显不同肥胖Zucker跖肌相比,观察正常跖肌(图2)。据我们所知,这一发现还没有报道过。这些改变的内在的分子机制还不清楚;然而有趣的是,之前的报告表明,刺激的磷酸化p70S6k可能改变在糖尿病大鼠(35- - - - - -37]。根据这些研究,我们的数据表明,胰岛素抵抗可能影响多个刺激可能调节p70S6k的磷酸化。未来的研究旨在检查如果胰岛素抵抗影响p70S6k的规定使用不同模式的收缩,不同强度的运动,或与不同的肌纤维类型肌肉无疑会有助于促进我们理解p70S6k激活胰岛素抵抗的影响。

类似于之前的研究,增加收缩活动似乎是一个强烈的刺激增加mTOR的磷酸化水平在非糖尿病患者的肌肉21,38),然而contraction-induced磷酸化的大小和时间进程mTOR的跖肌肌肉明显不同的肥胖(胰岛素抵抗)动物(图3)。后者发现与我们的数据是一致的证明糖尿病肌肉展品激活p70S6k能力下降后的高频。像p70S6k mTOR被认为是参与调节几个组件的转化机械,除了被认为是上游激活p70S6k [39]。因子(s)调节mTOR并不完全理解。mTOR已被证明使磷酸化p70S6k体外,认为发生这种情况通过机制有别于PI3K-dependent通路(40- - - - - -42]。事实上,最近的研究表明活化mTOR / p70S6k即使没有Akt激活(42- - - - - -44]。虽然不是调查,有人建议,磷脂酶D(骑士)可能发挥关键作用在调节mTOR磷酸化的反应增加肌肉负荷(40,41,45,46]。是否差异PLD-dependent信号后收缩加载精益和肥胖之间存在Zucker动物目前未知。尽管如此,我们的研究结果一致认为胰岛素抵抗相关的改变可能是由于p70S6k监管,至少在某种程度上,在胰岛素抵抗的能力缺陷肌肉收缩刺激后激活mTOR。

的精确影响胰岛素抵抗在肌肉收缩Akt监管尚不清楚。一种蛋白激酶是细胞生长和新陈代谢的关键信号中介在骨骼肌15),也就是说,转移到肌肉膜时被磷酸化激活Thr308和Ser 473残留47]。磷酸化在这些网站对于一种蛋白激酶的激活是至关重要的。刺的磷酸化- 308显然是由一个3-phosphoinositide-dependent催化蛋白激酶(基因),活动只有在phosphatidylinositol-3的存在,4,5-triphosphate phosphatidylinositol-3, 4-biphosphate [48]。类似于他人(49- - - - - -51),我们发现的高频显著增加一种蛋白激酶的磷酸化(刺308)和一种蛋白激酶(Ser 473)精益Zucker跖肌肌肉的老鼠(图4)。相反,在胰岛素抵抗跖肌,高频似乎只会增加一种蛋白激酶的磷酸化Ser 473(图4)。一种蛋白激酶的激活被认为是一个多步骤的过程,可能是一个涉及多个蛋白质(52]。为了确定一个可能的机制改变Akt监管我们观察到肥胖Zucker跖肌下检查高频在Akt抑制剂PTEN的影响。人们认为的磷酸化PTEN抑制磷酸酶活动(20.]。像预期的那样从胰岛素抵抗是如何影响我们的分析p70S6k的基底phosophorylation mTOR和Akt,我们发现了一个更高层次的基底PTEN磷酸化的肥胖Zucker跖肌相比,观察精益动物(图6)。此外,我们发现明显降低收缩的磷酸化PTEN在跖肌肌肉从肥胖Zucker获得动物。这是否减少PTEN磷酸化与收缩足以解释我们看到一种蛋白激酶磷酸化的差异我们观察胰岛素抵抗跖肌目前未知。同样,值得注意的是,PTEN的功能作用在调节Akt激活不能准确评估在缺乏进一步的研究来评估这种蛋白质的实验操作。额外的研究也许用人策略旨在直接抑制或激活PTEN在高频可能有助于解决这些可能性。

进一步探索Akt-related信号,我们下一个调查Akt衬底GSK-3的规定。类似于我们的发现有关Akt在308年用力推磷酸化,我们未能找到任何GSK-3增加(Ser 9)磷酸化与高频肥胖Zucker跖肌。这一发现的意义目前不清楚,不过据说GSK-3 Akt-dependent磷酸化导致通路的激活促进通过减少抑制蛋白质合成的翻译起始因子eIF2B53]。综上所述,这些数据表明,胰岛素抵抗可能与变更有关的能力快速收缩肌肉激活一种蛋白激酶。为什么Akt在高频的规定可能不同的肥胖Zucker老鼠并不广为人知,但这种变化可能是由于胰岛素的能力缺陷激活PI3K信号以响应增加肌肉负荷。或者,它被假定Akt激活后收缩活动的程度可能取决于类型的收缩活动,收缩强度,和/或刺激的持续时间(21]。鉴于这种争论,这是可能的,信号响应模型之间的差异可能与选择的时间点进行评估。同样,值得注意的是,尽管大小或时间的contraction-induced信号可能在不同的实验小组,全面激活的程度两组运动后相似的一种蛋白激酶信号蛋白检查。这样的差异可能contraction-induced级“激活”我们观察到可能简单地归因于不同的初始基磷酸化水平。未来研究利用其他时间点或实验方法当然是必要的。

总之,我们的数据是一致的认为胰岛素抵抗可能改变在骨骼肌收缩信号转导途径。仅这一发现是否能够解释不同的胰岛素抵抗肌肉如何应对运动方式是未知的,超出了本研究的范围。同样,是否我们观察模型之间的差异是由于胰岛素抵抗或其他异常的存在与肥胖表型相关或其他特征的肥胖Zucker鼠模型是目前不清楚。考虑到众多因素被认为是参与调节骨骼肌如何“感官”和“回应”来增加负荷刺激(如肌肉缺氧,活性氧水平,肌肉损伤,局部释放生长因子和细胞因子。54)这将是有趣的进一步研究什么,也许使用体外收缩模式将增加我们对胰岛素抵抗和之间的相互作用的理解contraction-induced肌肉信号。

确认

这项研究受到了美国国家老化研究所授予ag - 027103 - 1 E.R.B. Anjaiah Katta和苏尼尔Kakarla这项研究同样起到了推波助澜的作用。