鉴定化合物抑制高血糖IGF-I信号

文摘

提高响应性的血管细胞生长因子IGF-I已卷入与糖尿病相关并发症。在这里,我们描述了开发一个图书馆的鉴定和筛选化合物的能力加速乳沟的跨膜蛋白integrin-associated蛋白(IAP)从而扰乱IAP和SHPS-1之间的联系,我们已经显示为关键IGF-I血管细胞的增强的响应。细胞ELISA利用抗体检测裂解,但不完整,IAP。测试的1040个化合物,14日被认为是积极的刺激的能力增加抗体结合的IAP乳沟的说明。在实验中平滑肌和视网膜内皮细胞培养在高血糖的情况下,每个活动复合显示加速IAP的乳沟,这是与减少IAP相关协会与SHPS-1由coimmunoprecipitation蛋白质的细胞溶解产物。由于IAP乳沟的加速度,所示的化合物抑制IGF-I-stimulated磷酸化的关键信号分子包括自燃和ERK1/2,这反过来会降低IGF-I-stimulated细胞增殖。这些化合物的识别,利用这种机制有可能产生新的治疗方法预防和治疗糖尿病血管并发症。

1。介绍

增加细胞响应胰岛素样生长因子(IGF-I)已经涉及到几种并发症糖尿病血管并发症如动脉粥样硬化(1- - - - - -3和糖尿病性视网膜病变4- - - - - -6)以及其他并发症如神经病变(7- - - - - -16]。直接针对IGF-I或其受体;然而,可能是与不必要的副作用。我们的长期目标是制定治疗策略,特别是对抗IGF-I的影响还与高血糖相关保护IGF-I的有利影响。

1型和2型糖尿病患者动脉粥样硬化发展速度显著加速比非糖尿病患者(17- - - - - -19]。最近的研究表明,高血糖加速的损伤中起着重要作用的发生和发展1型和2型糖尿病患者(20.- - - - - -22]。增生性糖尿病视网膜病变(PDR)的特点是生长的血管和intravitreous新血管形成(IVNV) [23]。这些新血管的形成需要视网膜内皮细胞(REC)增殖和迁移24]。高血糖似乎有助于SMC增殖和迁移与动脉粥样硬化相关(25]。和the neovascularization associated with PDR [21]。胰岛素样生长因子(IGF-I)刺激SMC迁移和扩散,因此卷入病变进展(1- - - - - -3]。类似的各种研究已经涉及IGF-I作为一个贡献者与PDR(相关的视网膜新生血管形成4- - - - - -6]。REC和SMC生长在高葡萄糖更敏感的刺激影响IGF-I相比,细胞生长在正常葡萄糖(26]。

激活内在的激酶活性的IGF-I受体(IGF-IR)需要触发下游信号事件导致细胞增殖。没有丰富的差异或IGF-IR激活程度之间SMC生长在正常或高葡萄糖;因此,这并不占IGF-I反应的差异(26]。两个矩形的增殖反应和SMC IGF-I高血糖取决于两个跨膜蛋白的胞外域之间的交互,integrin-associated蛋白(IAP)和轴马力基板1 (SHPS-1) [27]。当IAP必将SHPS-1, SHPS-1的胞质域内酪氨酸残基磷酸化反应激活的IGF-IR [27]。磷酸化的酪氨酸残基是SHPS-1招聘所需的信号分子,他们的招聘要求引出SMC增殖增加以应对IGF-I [28,29日]。我们的研究表明,当矩形和SMC生长在5毫米葡萄糖条件下的细胞外领域IAP和残余IAP裂解片段仍然是相关的细胞表面不能绑定SHPS-1 [30.,31日]。当血管细胞生长在高葡萄糖(例如,12毫米),IAP保护从乳沟和有一个显著增加其与SHPS-1互动。这反过来SHPS-1磷酸化与增加,增强激活下游信号事件和增加细胞增殖反应IGF-I [31日,32]。这些观察让我们假设刺激IAP乳沟的高血糖可能是小说策略IGF-I-stimulated REC和SMC增殖的抑制作用。

青少年糖尿病研究基金会(美国)与国立Health-National糖尿病和消化肾脏疾病研究所(NIDDK)资助的一个项目,选择屏幕面板1040化合物预防各种细胞类型的细胞功能障碍与糖尿病相关并发症(一个文档,其中包含一个总结开发的各种化验结果是网上(http://www.t1diabetes.nih.gov/Investigator/Drug-ScreeningSummary-Final.doc))。为了这个项目我们设计、实现和验证细胞ELISA,测量每个化合物的能力,加快IAP乳沟SMC生长在高葡萄糖。在这项研究中我们描述的初始测试化合物导致14个化合物的识别,分析了抑制IGF-I信号在血管细胞的能力。

2。材料和方法

2.1。材料

人类,endotoxin-free IGF-I是从基因泰克的礼物(南旧金山)。聚乙烯二氟化物膜(止动剂P)从密理博公司购买(Billerica, MA)。Cl-Xposure autoradiographic电影从皮尔斯(罗克福德,IL)。胎牛血清,杜尔贝科的修改中,青霉素和链霉素从生活技术,购买(大岛,纽约)。单克隆抗体antiphosphotyrosine (PY99)购买从圣克鲁斯(圣克鲁斯,CA)。anti-Shc和磷/总ERK1/2抗体购自BD转导实验室(肯塔基州的列克星敦)。anti-SHPS-1抗体购自北部细胞信号解决方案(弗吉尼亚州夏洛茨维尔)。所有其他试剂购自σ化学公司(圣路易斯,密苏里州),除非声明。

2.2。Anti-IAP抗体

B6H12, anti-IAP单克隆抗体纯化从特定细胞系来源于一个b细胞杂种细胞就像我们前面描述的(33]。anti-IAP抗体生成通过接合肽锁眼坚守岗位的血凝素和用于免疫正如我们前面描述的34]。使用肽抗体生成R569同源的氨基酸41 - 61细胞外的领域IAP (KGRDIYTFDGALNKSTVPTC) [31日];R593生成使用肽同源的氨基酸74 - 96细胞外域和R250生成使用肽同源的氨基酸279 - 292 (31日]。从没有免疫兔血清作为控制抗血清。

2.3。猪SMC

从猪主动脉SMC外植体由罗斯(协议的修改35正如我们前面描述的(26]。后隔离SMC维持在高葡萄糖生长培养基(HG-GM) (DMEM包含4500 g / L(25毫米)葡萄糖)或正常葡萄糖(NG-GM) (DMEM包含900 g / L的葡萄糖(5毫米))+ 10%胎牛血清的边后卫,青霉素(1000 U /毫升),链霉素(160g / mL)和0.5毫米丙酮酸钠。SMC喂养每3天与HG -或NG-GM并通过每7天在适当的介质。所有实验进行SMC之间通过数字4和10。我们以前确定SMC培养这两种不同条件下没有显著差异的分化状态(26]。为渗透性的差异控制,甘露醇(19.5毫米)添加到NG-serum-free介质(26]。我们之前已经确定,甘露醇的存在与否不影响SMC生长在NG的反应(26]。

2.4。视网膜血管内皮细胞

主要牛RECs得到从矢量技术公司(纽约伦斯勒理工学院)。推荐的股票文化是生长在一个定义的EC生长培养基(mcdb - 131完成)VEC技术公司提供的包含5毫米葡萄糖。推荐的股票文化是生长在10厘米与50菜预镀g / mL纤连蛋白在PBS 30分钟37°C。研究化合物的影响在高葡萄糖培养基补充25毫米葡萄糖作为我们前面描述的(30.]。

2.5。主要化合物的筛选:试验设计和验证

SMC在HG-GM保持在10厘米的菜肴。个人实验SMC在96年被镀孔板(Falcon) HG-GM 5000细胞的密度。smc种植confluency超过5天没有媒体的改变。

2.5.1。抗体

积极的控制:单克隆抗体B6H12结合同样IAP在正常和高葡萄糖,也就是说,它不区分完整或裂解IAP。因此这个抗体的结合是用来控制总量的IAP (31日]。消极的控制:抗体R250是多克隆抗体在兔子长大与氨基酸肽同源人类IAP (VASDHKTIQPPRNN)的279年到292年。IAP的这个地区是最c端区域的胞质域,因此作为负控制这个地区以来IAP不是表面暴露,不能绑定到IAP当细胞完好无损。测试抗体:抗体R593是兔子对肽的多克隆抗体引起同源的氨基酸74年至96年,成熟的人类IAP序列(KGDASLKMDKSDAVSHTGNYT)。R593结合以亲和力高于分开IAP完好无损的IAP由于暴露neo-epitope乳沟。

抗体的特性是补充图所示在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2009/267107。

2.5.2。试剂

无血清培养基(SFM) +是由混合DMEM (HG或NG)和20毫米玫瑰,叠氮化钠BSA的0.2%和0.02%。这是立即使用前准备和保存在冰试验的持续时间。二乙醇胺(DEA)缓冲库存解决方案准备,储存在4°C,和保护。500毫升的缓冲区,4.8毫升的85%二乙醇胺(费雪猫没有。MgCl D45)和0.25毫升的1米₂混合995毫升的水。立即使用前,碱性磷酸酶底物的解决方案是由混合20毫升的DEA缓冲区的一片Para-nitrophenyl磷酸(pNPP)(σ猫没有。N2765)。

2.5.3。治疗细胞与测试化合物

启动前化验,治疗在SFM准备。为每一个分析9井仅在NG-SFM孵化,其余井孵化与HG-SFM葡萄糖加上或者减去测试或控制。控制化合物(a) vitronectin的肝素结合域和(b)血小板反应蛋白的IAP绑定域名。两个控制化合物可以抑制IAP解理(数据没有显示)。细胞单层膜和无血清培养基洗了三次(SFM),然后100年L SFM加减治疗或控制了。为每个分析九井被冲洗,然后SFM包含5毫米葡萄糖添加。九个额外井仅接受HG-SFM和其余井收到测试或控制在HG-SFM化合物。96板被放置在一个37°C孵化器(5%股份有限公司₂和80%的湿度)6个小时。每个复合测试三个浓度(2、5和10米)。

2.5.4。孵化与初级抗体

六个小时后板是放在冰。SFM从每口油井和水井吸气冲洗与100年的三倍L (SFM包含0.2%的牛血清白蛋白,20毫米玫瑰和0.0%叠氮化钠(SFM +)。与SFM冲洗后加上适当的细胞单层培养初级抗体在SFM +准备。9个控制井(孵化与高收入或正常葡萄糖媒体),三个井被暴露于100年L (B6H12(的稀释),负控制抗体R250(的稀释与测试抗体R593()或稀释)。剩下的井被暴露于一个R593稀释。盘子被孵化一夜之间在4°C温柔的摇摆。

2.5.5。孵化与二次抗体

隔夜孵化后板被放置在一个托盘上的冰,每一个吸气。他们冲洗三次与SFM +孵化之前适当的二次抗体。井被暴露于B6H12与100年孵化L的稀释的山羊antimouse碱性磷酸酶共轭二次抗体和井孵化R593或R250多克隆抗体与100年孵化L的稀释的山羊anti-Rabbit共轭二次抗体。孵化了一小时在室温下与温和的摇摆。

2.5.6。添加碱性磷酸盐基质和颜色的发展

5分钟结束前一小时孵化碱性磷酸酶底物开发解决方案。一小时后二次抗体被除去,井与SFM +洗了三次。50L的碱性磷酸酶显影液被添加到每个好,颜色被允许开发被保护起来,避免在室温下光了20分钟。的黄色硝基酚为405 nm给光学密度(OD)阅读每个治疗。

2.5.7。数据分析

OD阅读后决定抗体绑定SMC暴露于汞从OD阅读减去抗体绑定SMC NG。这个值被称为。抗体绑定的OD阅读SMC对待HG然后减去从每个化合物的OD阅读()。分数为百分之一复合然后计算都是由以下方程:。

2.5.8。标准的识别正面冲击

一种化合物被认为是积极的,如果在化合物的存在,增加抗体(特别是承认裂解IAP)绑定到细胞在HG至少75%的价值获得抗体绑定时量化NG。因此百分比分数是衡量能力的化合物(10米)增加抗体绑定。化合物达到这个结果被测试范围从0.2米到10米(0.2,0.5,2、5、10米)。化合物的浓度的增加,细胞抗体绑定在高葡萄糖50%的区别抗体绑定到细胞在正常葡萄糖相比高葡萄糖被认为是₅₀。

2.6。免疫印迹验证主要筛选结果

确认化合物增加抗体ELISA绑定可能改变IAP乳沟,矩形或SMC一直保持在HG-GM当时暴露在化合物溶解产物被免疫印迹的准备和分析使用anti-IAP抗体只能识别完整IAP (R569)或单克隆抗体B6H12承认完整和IAP([的残膜相关的片段31日)和补充图)。REC和SMC镀在10厘米的菜肴在HG -或NG-GM增长为7天confluency介质是改变每2 - 3天。7天的生长介质被和汇合的单层膜冲洗三次SFM-HG或NG然后孵化隔夜(16 - 17小时)。6小时的化合物被添加。细胞细胞溶解在修改里帕缓冲区。离心后,等量的细胞蛋白(确定使用BCA蛋白质化验(皮尔斯)数据未显示)与nonreducing凝胶混合加载缓冲区,加热到70°C 10分钟,通过sds - page分离(8%)。sds - page后,IAP被免疫印迹可视化为我们先前描述的33]。

2.7。化验确定化合物加速IAP乳沟抑制IGF-I信号在高葡萄糖

2.7.1。细胞增殖

细胞增殖检测进行了正如我们前面描述的(36]。smc是镀在每个细胞每口井24板在HG-SFM或NG-SFM + 2%的边后卫。细胞在一夜之间被允许附加在媒介新鲜SFM所取代。24小时后SFM取代了SFM + 0.2%血小板可怜的等离子体(PPP)有或没有添加IGF-I (50 ng / mL)。化合物的浓度增加了5M立即添加IGF-I之前。细胞数量确定胰蛋白酶化后,台盼蓝染色,计数29日]。

2.7.2。细胞溶菌作用,免疫印迹免疫沉淀反应和西部

REC和SMC文化受到测试试剂如上所述的二次筛选试验。免疫沉淀反应研究人体自燃现象(使用anti-SHPS-1和抗体)进行如前所述[33]。后sds - page我们以前的蛋白质免疫印迹可视化的描述(33]。免疫印迹抗体(B6H12 R569, SHPS-1, p-Tyr,自燃,pERK1/2)之间的使用浓度和。

2.8。统计分析

化学发光图像进行扫描获得使用DuoScan T1200(爱克发布鲁塞尔,比利时)和带强度的扫描图像进行了分析使用NIH形象,1.61版。学生的以及用于比较不同治疗方法。结果显示,表达的意思SEM,代表至少三个独立的实验。

3所示。结果

3.1。主要检查

措施的蛋白水解程度乳沟的ELISA IAP在测试化合物的存在和缺乏在25毫米的SMC葡萄糖依赖抗体(R593)承认的neo-epitope亲和力的抗体增加解理(补充图)。测试的1040个化合物14被认为是“积极的支安打”部分中描述的标准2。这些都是列在表中1。进一步分析这些化合物的允许ED的决心₅₀和有效浓度范围(表1)。

3.2。二次筛选(SMC)

相比的主要筛选试验,利用抗体发现IAP乳沟,二级筛选化验使用两种抗体,R569,结合IAP的裂解部分,因此并不承认,剩下的残余跨膜碎片劈理或anti-IAP单克隆抗体后,B6H12,认识到完整和残膜碎片(31日]。从这些化验的结果取决于西方免疫印迹而不是ELISA。SMC的14个化合物的治疗导致显著减少的数量完整才能发现IAP(图1(一个)显示了一个示例使用化合物1 - 3的结果和数据表的所有14个化合物进行了总结2)。

3.3。二次筛选(REC)

然后我们测试了化合物1到3的能力加速IAP乳沟REC生长在high-glucose中(图1(b))。3化合物的数量明显减少完整才能发现IAP相比矩形生长在高葡萄糖。

3.4。“积极打击”化合物的效果与SHPS-1 IAP协会

我们之前的研究表明,为了使IGF-I刺激增加REC和SMC迁移和增殖必须形成一个特定的信号复杂。具体地说,两个跨膜蛋白,IAP和SHPS-1必须联系起来,通过细胞外域允许SHPS-1磷酸化在回应IGF-I [27]。的磷酸化SHPS-1 SHP-2-Src-Shc的形成需要复杂的人体自燃导致随后的磷酸化和激活的地图和PI-3激酶信号通路因为IGF-I-stimulated所需的迁移和扩散29日]。当推荐或维护smc在5毫米葡萄糖SHPS-1磷酸化因此这个复杂的不形式的乳沟IAP (30.,31日]。因此,确定化合物的影响加速IAP乳沟IGF-I信号我们检查IAP-SHPS-1信号复杂的形成。

每个化合物显著降低IAP协会与SHPS-1(图2(一个)和表2)。IAP-SHPS-1中断的重要性评估通过测量SHPS-1磷酸化。在每个化合物的能力IGF-I刺激SHPS-1磷酸化明显受损(图2 (b)和表2)。

IAP-SHPS-1协会的破坏和抑制SHPS-1磷酸化预测会抑制下游的信号。每个化合物显著抑制IGF-I刺激人体自燃现象的磷酸化(图3(一个)和表2人体自燃现象)和招聘SHPS-1(图3 (b)和表2)。我们之前的研究表明,人体自燃现象的磷酸化激活下游信号通路需要包括MAPK通路。符合人体自燃现象显著减少磷酸化,激活MAPK的分析如图所示的磷酸化形式的ERK1/2 IGF-I,也显著受损的每个化合物(图143 (c)和表2)。

在25毫米葡萄糖这些变化导致增强应对IGF-I SMC增殖。当SMC保持在25毫米葡萄糖IGF-I-stimulated显著,SMC增殖增加3倍。相比之下,每个化合物的增加导致至少2倍减少IGF-I-stimulated扩散(图4和表2)。

4所示。讨论

动脉粥样硬化是死亡的主要原因在1型和2型糖尿病(37- - - - - -39]。密集的多因子的治疗高血糖、血脂异常和高血压可以显著降低心血管疾病的发病率,但只有一小部分病人能够管理所有这些因素达到足够的控制降低风险(40]。因此需要一个系统性疗法抑制这些患者的疾病的进展。增生性视网膜病变是糖尿病并发症最严重和普遍。发病后34年确诊病人在30岁之前有一个患病率为70%。即使改善血糖控制糖尿病视网膜病变发展的概率有1型糖尿病后30年大于60%。由于这种高患病率糖尿病视网膜病变仍是失明的第二大原因个人超过60岁。在1型糖尿病患者继续长寿失明由于糖尿病性视网膜病变的患病率可能会增加。因此将继续有需要这种类型的1型糖尿病患者的治疗方法。治疗这种疾病已经通过技术程序如凝固(41和玻璃体切除术42)或预防措施,如降低高血糖(43)、血压(44]。介绍了三种疗法基于生化信号通路抑制病理生理的变化。最有效的是抑制血管内皮生长因子(VEGF)、视网膜静脉内皮细胞的有丝分裂原(45]。当VEGF抗体直接注入人体的眼睛他们限制增生性疾病的阶段46]。同样增强蛋白激酶C的激活β通路存在和口服βPKC抑制剂减少视网膜病变进展(47]。治疗低血清浓度IGF-I已经尝试过,但因为他们的相对无效率降低血清浓度IGF-I他们疗效有限48]。

我们的研究已经确定的重点预防和治疗策略相关的血管并发症的糖尿病患者通过识别信号事件对高血糖的特定环境。这样的目标识别有潜力发展的治疗,防止疾病相关的事件,而不会干扰细胞的正常功能。

活动增加IGF-I已经与动脉粥样硬化和糖尿病性视网膜病变。因为我们之前有研究表明,矩形和SMC生长在高葡萄糖比那些生长在正常葡萄糖响应性(26)和响应能力的差异是由于监管IAP解理(30.,31日]我们假设IAP乳沟的加速度是一个潜在的战略专门IGF-I-stimulated血管细胞增殖的抑制高血糖的条件。在这项研究中我们筛选1040种化合物的能力加速IAP乳沟在裂解的细胞ELISA使用抗体特定形式的IAP。虽然IAP乳沟刺激的程度上的每个化合物不同,在每种情况下IAP乳沟的程度足以显著破坏IAP-SHPS-1协会。我们先前已经表明,扰乱IAP-SHPS-1协会anti-IAP抗体,B6H12,抑制IGF-I-stimulated信号(27]。结果表明,每个化合物抑制SHPS-1磷酸化(27]。此外,招聘和自燃的磷酸化激活下游信号通路的所需29日)在回应IGF-I明显受损的每一个活性化合物。鉴于IAP的重要性在调节响应REC和SMC IGF-I有理由得出这样的结论:识别化合物可以扰乱高血糖诱导增加IAP-SHPS-1协会有可能抑制IGF-I信号在血管细胞体内。

最活跃的化合物可以分为三组。溴吡斯的明和头孢菌素ii第四纪吡啶化合物。第二组都是二肽类似物(例如,n-formyl methionyl leucly苯丙氨酸)。第三组是arylalkylamino化合物包括chloropromazine,多巴胺,肼苯哒嗪,mephenentermine。研究将需要确定每个化合物的分子途径刺激调解对IAP劈理的影响。特别是,它将决定是否感兴趣的信号通路之间存在收敛性引发的形形色色的化合物。

我们已经确定,蛋白酶的乳沟负责IAP当smc保持在正常葡萄糖MMP-2 [31日]。转换MMP-2充分活跃的形式是一个多步过程涉及复杂的形成包括结合的膜结合MT1-MMP TIMP-2进而pro-MMP-2结合。然后这个复杂的催化转化MMP-2中间,然后酶的活性形式(49- - - - - -56]。需要进一步的研究来确定这些化合物改变MMP-2的数量和TIMP-2。

虽然我们的数据支持我们的结论,每个化合物的抑制作用是由其影响IAP乳沟,我们不能排除这样一种可能性,即化合物也有额外的抑制性影响IGF-I不介导的信号通路通过IAP乳沟的加速度。IAP是matricellular蛋白的结合位点血小板反应蛋白- 1 (TS-1) [33]。我们先前已经表明,有一个显著增加TS-1沉积SMC周围的基质中培养高葡萄糖比正常的葡萄糖和TS-1发生是一种潜在的刺激IGF-I信号(26,33]。一个替代机制有别于MMP-2 IAP乳沟的规定是化合物调节与IAP TS-1联系的可能性,从而调节其解理的易感性。

这些研究的结果表明,体内研究现在的确定积极的功效达到化合物在抑制IGF-I-stimulated REC和/或体内SMC增殖。我们已经表明,抑制IAP协会在糖尿病小鼠SHPS-1导致衰减SMC增殖的32]。自加速IAP乳沟体外IGF-I活动导致了类似的变化我们的研究结果支持这样的结论,这些化合物将有效的体内抑制SMC IGF-I反应。治疗加速IAP乳沟会旨在扭转定性不同病理生理的高血糖的影响,因此应该允许IGF-I信号在血管细胞的正常维护。

总之,在这项研究中,我们开发了一种细胞ELISA允许小分子的大规模筛选识别那些加速IAP乳沟。这个实验现在用于第二代化合物的筛选来自最有前途的铅化合物。得到活性化合物的体外数据似乎高度可能的进一步开发和测试我们可以得出一个新颖的化合物可以确定当单独使用或结合其他疗法预防或治疗糖尿病血管并发症。

承认

这项工作是由国立卫生研究院的资助hl - 5685051。

补充材料

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