净化的花青素来自黑芸豆(菜豆l .)模拟移动床

文摘

净化的花青素来自黑芸豆(菜豆l .)通过柱层析法和模拟移动床(SMB)方法研究,和黑芸豆的花青素。SMB优于柱层析法在处理效率、运营成本、自动化程度对比测试。最好的SMB条件导致纯度和产量的黑芸豆花青素为24.61±0.21%和87.85±0.32%,分别。半最大抑制浓度(IC₅₀)1、1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)清除活动和2 2ʹ-azinobis——(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)激进(abt +∙)清除活动是精制花青素的0.95和2.14,分别显示强大的抗氧化能力。三个花青素检测并被UPLC-Triple-TOF /从黑芸豆皮女士:delphinidin-3-O-glucoside petunidin-3-O-glucoside, malvidin-3-O-glucoside。实验结果表明,SMB可以帮助促进工业化和净化的花青素的芸豆,以及从其他植物材料。

1。介绍

芸豆(菜豆l .)是一个在中国广泛种植豆类作物,具有重要的营养和药用价值。近年来,蛋白质(1,2)、油(3),凝集素(4),肽(5)、淀粉(6- - - - - -8),多酚(9,10),类黄酮(11芸豆的研究,代表了一个伟大的成就。芸豆的利用率将增加这些研究的发展,导致丢弃大量的皮肤。的皮肤颜色的芸豆具有优越的抗氧化活性与白芸豆,因为它富含花青素(12,13]。大多数研究都集中在抗氧化特性(14,15)和处理方法的影响花青素的生物活性的芸豆(16),但研究是罕见的花青素的净化方法来源于彩色芸豆。研究彩色芸豆主要集中在瑞典红色和棕色的芸豆,很少有在黑芸豆。

净化花青素的方法包括对大孔吸附树脂(17- - - - - -19),液体和亚临界二氧化碳(20.),膜分离21),制备高效液相色谱法(22),水相萃取(23,24),离子液体的解决方案(25)、高速逆流色谱法(26),高压纸电泳(27),和柱层析法28]。这些方法可以达到高纯度,但许多实验室,不能工业化。集成和组合技术被用来净化花青素,和过程效率已得到改进,但仍有一些差距在工业化之前(29日- - - - - -31日]。连续色谱系统是一种模拟移动床(SMB)色谱法是一种有效的和先进的净化技术。与传统的柱层析法相比,SMB方法有短的处理时间和良好的生产力和需要较少的缓冲和树脂的体积32]。SMB系统已经应用在很多领域的蛋白质分离(33),银杏叶浓缩(34),和肝素钠净化(35]。使用SMB系统的净化花青素还没有报道。本研究的目的是净化花青素来自黑芸豆使用SMB系统和调查在体外抗氧化性能的黑芸豆花青素(BKBA)。BKBA的主要组件进行了讨论。这将提供有用的信息,开发一种新的工业化纯化花青素(参见图的方法1)。

2。实验

2.1。方法

2.1.1。黑芸豆集合

黑芸豆种植在市区,黑龙江省,收集在2017年秋。豆子被储存在−20°C 2 h内集合。

2.1.2。BKBA提取

在提取之前,黑芸豆(简历。LongYun没有。4)浸泡在30°C 8 h,和皮肤。提取了BKBA李的方法等。36]:麸皮中提取了超声波处理器(JinBaiTe,中国)两次70% (v / v)乙醇和0.6%盐酸了20分钟。操作参数设置如下:液体材料比20 mL / g,超声波频率24 kHz,超声波功率300 W,萃取温度30°C,蒸发干燥用旋转蒸发器(瑞士Buchi) 50°C。BKBA花青素的含量大约是40毫克/ g (37];量(21.5毫克/克)通过这个方法是与先前的研究一致38]。

2.1.3。分离条件对净化的BKBA AB-8树脂

使用AB-8树脂(大孔聚苯乙烯微极性吸附树脂,纳米孔隙大小13 - 14日,比表面积450 - 530²/ g,水分含量65 - 75%,体积密度0.62 - -0.72 g / mL,粒径0.315 - -1.25毫米,孔隙度42 - 46%,白色不透明球状颗粒)放到一个色谱柱(15×500毫米)(由国家粗谷类食品工程技术研究中心)。AB-8吸收BKBA通过表面吸附和氢键,形成相对稳定的结构和完成吸附过程。然后,BKBA而眠的树脂洗涤用不同极性溶剂,不断破坏形成氢键。花青素具有2-phenyl氮烯酮结构的化合物;除了酮羰基,他们常常含有醇羟基和酚羟基。不同的花青素有不同的极性。因此,花青素的分子结构包含两个氢键供体和氢键受体组,所以可以使用极性和非极性树脂吸附和解吸。操作参数设置如下:列温度30°C;BKBA浓度的100、150、200、250和300毫克/毫升(解吸流量:2.0毫升/分钟);解吸流速的1.0,1.5,2.0,2.5,和3.0毫升/分钟(BKBA浓度:200毫克/毫升)。 After saturated feed, the chromatography column was washed by deionized water (3 BV) and desorbed by 60% ethanol (3 BV). The lyophilized product was collected, and the purity and yield were calculated to study the effect of concentration on the purification of BKBA by the AB-8 resin.

2.1.4。通过柱色谱法净化BKBA

柱层析法是一个固定的模式,一个真正的移动床(三甲)。AB-8树脂被制备色谱柱(15×500毫米)。操作参数设置如下:列温度30°C, 200毫克/毫升的浓度,解吸2.0毫升/分钟的流量。饱和提要之后,色谱柱是由去离子水清洗(3 BV)和眠20%,40%,和60%的乙醇(3 BV)。洗脱液,分别收集,最后,分析了样品的紫外分光光度计,测定抗氧化活动,通过柱色谱法研究BKBA的净化。

2.1.5节讨论。净化的BKBA SMB

SMB(20列25毫米×500毫米,国家粗谷类食品工程技术研究中心)被用在这个实验。使用SMB技术,提高了传统SMB根据技术要求。整个过程周期由一个磁盘的多数树脂列列(20)和多孔分配阀。通过磁盘的旋转和转换的阀口,吸附的分离柱完成整个过程,净化、解吸和再生循环的过程。在连续分离系统,流程步骤同时进行。20(25毫米×500毫米)的层析柱分离过程被用于这项研究。

研究表明,花青素主要存在于黑芸豆的40%乙醇溶液。因此,SMB分离的色谱分离系统BKBA分为5个部分:吸附区,精制区,解吸装置区、再生区,和水洗涤区。原料添加到系统吸附区,吸收的花青素是树脂。再生区也可以被视为该地区除杂质。20%的乙醇被用于去除蛋白质、多糖等杂质。与40%乙醇解吸区是筛选了获得高纯度BKBA产品。再生区,用80%的乙醇清洗色谱柱,和其他杂质在列完全移除。清洗区,去离子水被用来去除乙醇从色谱柱和准备饲养区。系统有20色谱柱。当系统运行时,树脂柱和支持底盘固定位置。 The rotary valve rotated at a regular rate, and consequently, 20 chromatographic columns were used during the operation of five procedures, including continuous adsorption, purification, elution, regeneration, and water washing. Twenty slots were matched with the stiff end of the 20 columns. When the system was running, the liquid flow into or out of the fixed slot was constant and uninterrupted. When the rotating valves rotated in a circle, each column of resin underwent a complete process of adsorption, refining, desorption, regeneration, and water washing. On the basis of single column experiment, the equivalence and conversion relation between the SMB and TMB is linked by the following equations [39]。

固体流之间的转换关系和SMB开关时间如下:

三甲的流动比率公式如下:

SMB的流动比率之间的转换关系,三甲的流动比率如下:

之间的转换关系流量比和三甲的流动比率如下: 在哪里问_年代是固体流,问_j的移动状态流区吗j,ɛ孔隙度,t是保留时间,米_j流动比率区吗j在三甲,u_j流量的比例带吗j,u_年代固体的流量比率,D_j轴向扩散系数。

根据BKBA AB-8树脂的吸附实验,参数,包括饱和吸附容量、饱和时间、洗脱液,洗脱和再生剂和水的流量、再生和清洗效果,和树脂和设备的实际运行性能,测定。IE-SMB色谱分离的类型的分布区域被定义。初始工艺参数计算根据树脂的静态和动态实验和三甲的物质平衡方程模型。根据三甲实验的基本参数,工艺参数的分离和净化的BKBA SMB进一步优化。

2.1.6。花青素的测定

两个样品的花青素与氯化钾溶液被稀释缓冲(pH值1.0)和醋酸钠缓冲(pH值4.5),两种解决方案的比例是1:15日使用蒸馏水作为空白,吸附是衡量一个紫外分光光度计(美国220年的进化,热费希尔科学)在515 nm和700 nm。花青素含量计算公式(5),cyanidin-3-O-glucoside (C3G)作为标准: Δ在哪里一个吸光度的差,Δ一个= (一个_510海里−一个_700海里)_pH1.0−(一个_510海里−一个_700海里)_pH值4.5的分子量,Mw C3G(449.2克/摩尔),DF是稀释倍数,ε= 26900是C3G的摩尔消光系数,和l的光学距离试管(cm)。

2.1.7。为BKBA UPLC-Triple-TOF / MS分析

UPLC-Triple-TOF /女士是由王等报告的方法。40]。5600年UPLC-Triple-TOF / TOF MS系统⁺的Acquity™超三(美国马水公司,米尔福德)配有ZORBAX-SB C₁₈1.8(4.6毫米×100毫米μm,安捷伦科技公司有限公司,位于加州帕罗奥图的CA,美国)。紫外检测器的波长被设定为520海里。注射量是5μL和列温度是30°C。流动相组成的水溶液含有0.1% (v / v)甲酸,当B流动相乙腈溶液含有0.1% (v / v)甲酸。梯度程序0.8毫升/分钟的流量如下:0-25分钟:5% B;25 - 35分钟:25% B;35-38分钟:95%的b是配备了一个电喷雾电离源(美国AB Sciex有限公司)和正离子模式监控、雾化气体GS₁是50 psi,雾化气体GS₂50 psi,空气幕气体(坏蛋)35 psi (TEM)离子源温度为600°C(积极的),离子源电压(是)是5500 V(积极的),和米/z设置范围是100 - 1500。第一层扫描:集群电压(DP)、100 V,并专注电压(CE), 10 V。二次扫描:质谱数据收集的TOF MS-Product Ion-IDA模式。CID能源是20、40和60 V。在注射之前,由cd泵质量轴是纠正,所以,质量轴误差小于2 ppm。化合物被确定使用SciFinder和Reaxys数据库(41]。

2.1.8。测定DPPH自由基清除活性

美国DPPH(σ)自由基清除活性的方法决定Maeda等人有轻微的修改42]。样品在不同浓度(0-50(2毫升)μg / mL)添加2毫升的0.4毫米DPPH自由基。混合大力动摇了,在黑暗中站了30分钟前吸光度测量在517 nm甲醇空白。抗坏血酸(Vc)作为一个积极的控制。DPPH的抑制百分比计算根据以下方程: 在哪里一个的吸光度DPPH自由基+甲醇和B是DPPH +测试样品的吸光度。所有的决定都是一式三份。集成电路₅₀样品需要的浓度减少50%的DPPH浓度相对于控制。

2.1.9。测定abt +∙自由基清除活性

abt +∙自由基清除活性取决于Arnao等人的方法和张等人轻微的修改(43,44]。Sigma-Aldrich (abt)解决方案(7更易/ L;5毫升)和过硫酸钾溶液(2.45更易/ L;5毫升)混合在黑暗中12 h,生产abt +∙。abt +∙解决方案是稀释用水,和吸光度是0.70±0.02在734海里。abt的抑制百分比计算根据以下方程:

2.2。统计分析

这些数据意味着±SD。统计分析使用统计SAS程序进行,每组的意义是由单向方差分析验证之后,邓肯的测试 。

3所示。结果

3.1。分离条件的结果BKBA的净化AB-8树脂

结果显示浓度的显著影响BKBA的净化AB-8树脂(图2)。几乎没有BKBA纯度和产量的差异在低浓度(100 - 200毫克/毫升),和BKBA纯度和产量突然拒绝当浓度高于200毫克/毫升。BKBA分子之间的高度集中导致不充分接触和树脂吸附能力下降,影响了BKBA净化的AB-8树脂。最好的浓度是200毫克/毫升。

AB-8树脂的解吸流量显著影响BKBA净化(图3)。几乎没有BKBA纯度和产量的差异解吸低流速(1.0 - -2.0 mL / min)和BKBA纯度和产量为解吸流量突然减少2.0毫升/分钟以上。更高的吸附流速AB-8树脂吸附,降低了吸附容量不足。这可能影响BKBA净化。最好的解吸流量为2.0毫升/分钟。

3.2。通过柱色谱法净化BKBA

清除能力BKBA BKBA显著不同浓度和不同浓度EtOH(图4)。大多数BKBA集中在40%的乙醇洗脱的解决方案,和小集中在去离子水或20%乙醇和60%乙醇洗脱的解决方案。此外,40%乙醇纯度高于其他的洗脱液。

结果表明,测试样品和积极控制风险投资有抑制作用(表1),IC₅₀DPPH和集成电路₅₀abt +∙清除40%的乙醇溶液的活性分别为0.95和2.14μ分别g / mL。这是低于其他样品,清除活动是按照以下顺序:40%乙醇> 20%乙醇> Vc(积极控制)> 60%乙醇>蒸馏水。因此,最好的结果清除活动BKBA 40%乙醇溶液。40%的乙醇洗脱方案比抗坏血酸表现出较高的抗氧化活性。然而,集成电路₅₀/ DPPH BKBA我们获得略低于IC₅₀/ DPPH花青素的果子小檗属植物heteropodaSchrenk (2.25μg / mL)报告的太阳et al。45),以及集成电路₅₀/ abt +∙BKBA我们获得略低于IC₅₀/ abt +∙蓝莓花青素的(4.33μg / mL)报道了赵et al。46]。这是因为我们把20%和60%乙醇溶液,20%和60%的乙醇洗脱方案类似的抗氧化活性,抗坏血酸,所以BKBA的纯度较低,可能含有蛋白质、多糖、类黄酮,和其他杂质。

因此,我们收集了40%的乙醇洗脱溶液在SMB。

3.3。SMB净化为BKBA

使用柱层析法和自由的清除能力研究成果和相关理论,我们指定的分区模式SMB和SMB的主要参数。SMB有5个区域:吸附、精炼、解吸装置、再生,和水洗涤区。这五个区有六个(串联),四(串联),三(串联),四(平行逆流),分别和三个列(串联)。SMB-IEC被吸附的主要参数区12毫升/分钟的流量,精制区26毫升/分钟的流量,解吸装置区24毫升/分钟的流量再生区20毫升/分钟的流量,水洗区30毫升/分钟的流量,和1080年代的开关时间。结果(表2通过实验优化。

SMB测试结果表明,没有。4测试比其他六个测试(表2),当我们认为治疗的数量,材料比水,纯度和产量。的最佳条件是吸附区流量12.5 mL / min,精制区流速28.5 mL / min,解吸装置区流速24.5 mL / min,再生区流速为22.5毫升/分钟,水洗区流速为38.5毫升/分钟,和1080年代的开关时间,导致BKBA的纯度和产量24.61±0.21%和87.85±0.32%,分别。

3.4。为40%的乙醇洗脱UPLC-MS分析组件

花青素有相似的结构,类黄酮,可以很容易地困惑在常规质谱分析中,我们使用正离子检测,也就是说主要花青素主要集中在7 - 15分钟(45]。UPLC-MS分析40%乙醇洗脱表示三个化合物的40%的乙醇洗脱BKBA(图5)。

3.5。组件1

化合物1的高峰时间是9.26分钟,[M]⁺米/z465.1019 Da,分子式是C₂₁H₂₁O₁₂⁺。根据二级质谱的母核化合物303 Da,这表明花翠素。有一个六元糖结构的化合物。搜索SciFinder delphinidin-3-O-glucoside Reaxys数据库显示,复合。质量和mass2光谱和可能的化合物结构式如图16。

3.6。组件2

化合物2的高峰时间是11.67分钟,[M]⁺米/z479.1173 Da,分子式是C₂₂H₂₃O₁₂⁺从高分辨率质谱分析的结果。根据二级质谱的母核化合物317 Da,母核与一个亚甲基的组件1,表明它是矮牵牛配基。的米/z317 (m - 162)和米/z302年[m - 162 - 15]暗示有骨架的化合物。碳水化合物的结构和甲氧基组是使用SciFinder和Reaxys数据库检索和显示petunidin-3-O-glucoside化合物2。质量和mass2光谱和可能的化合物的结构公式如图所示7。

3.7。组件3

化合物3的高峰时间是11.67分钟,[M]⁺米/z达493.1331,拟合公式是C₂₃H₂₅O₁₂⁺,使用高分辨率质谱分析的结果。根据二级质谱的母核化合物331 Da,与一个比父组件2核,亚甲基二甲花翠素。的米/z331 (m - 162)表示,其中包括一个六元糖结构。使用SciFinder和Reaxys数据库、碳水化合物和甲氧基组的结构检索和显示化合物3 malvidin-3-O-glucoside。质量和mass2光谱和可能的化合物的结构公式如图所示8。

4所示。讨论

SMB和三甲相当不同的程序。SMB喂养方式是连续的,三甲喂养方式是间接的。SMB控制模式是自动,三甲控制方式是手动(表3)。除了不同的控制设备,在操作条件下有很大差异。同样的树脂,SMB的处理能力是三甲的5倍。在同样的日常处理能力,乙醇和水的消耗SMB只有三甲的0.48和0.63倍,分别。在纯度和产量没有明显差异SMB和三甲分离方法(表3)。结果是符合离子交换分离的原则。然而,SMB在工业生产与三甲相比有明显的优势。首先,SMB分离是一种连续操作系统20列。SMB的树脂系统有更高的利用率和更高的生产效率。三甲是单个列间接操作系统及其树脂有较低的利用率,降低生产效率。达到相同的治疗能力,SMB需要20多个列三甲系统分离。每个列三甲的体积是SMB的两倍,并相应面积的增加。SMB设备是一个结合紧密的结构,占用更少的土地,方便安装和使用1/2-1/3三甲的树脂的量。第二,与三甲相比,洗脱液的量、再生器,和水用于SMB低40 - 60%。 Finally, the SMB method used automatic control to adjust the parameters at any time according to the needs of the production process to reach an optimal economic state. Comparison of parameters showed that the SMB system had a larger operational capacity, lower solvent consumption, lower cost, higher production efficiency, and continuous production advantage. The SMB method was therefore very suitable for the industrial production of BKBA.

我们所知,这是第一次报告的净化BKBA SMB。此外,抗氧化活动是提高了SMB。低成本的SMB方法;这是一个简单的过程和连续操作,与组合色谱法(相比有明显的优势47和高速逆流色谱法双水相系统48在工业生产。这些结果有助于指导BKBA的工业生产。他们还提供依据其它农业副产品的生产和应用。然而,结果只代表了样本测试和可能不是彩色的人口芸豆的代表。SMB的分离和纯化参数在不同品种在未来应该被测试。

5。结论

我们所知,这是第一次报告的净化BKBA SMB。此外,抗氧化剂抑制活动是提高了SMB。这些结果是有用的作为BKBA工业生产的指导。它还提供了证据其它农业副产品的生产和应用。然而,我们的研究结果只代表了样品我们测试,可能不一定代表黑芸豆的人口。SMB的分离和纯化参数在不同品种在未来应该被测试。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持的“数百万”科技重大特殊项目(2019 zx06b02)的黑龙江省,处理和利用的工程研究中心谷物副产品,教育部,青年科技创新人才项目(unpysct - 2017111)从黑龙江教育部门和玉米功能糖生产的关键技术(2019 zx06b02-1)从黑龙江科技部门。

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