波形蛋白在口腔黏膜下纤维化中的免疫组化分析

摘要

背景。口腔粘膜下纤维化（OSF），癌前状态，其特点是在口腔粘膜下层的胶原纤维的异常蓄积。波形蛋白是一类2中间丝（IF）和间充质来源的细胞中表达。波形蛋白也发现涉及细胞生长，细胞周期和肿瘤分化。客观的。这项研究的目的是比较OSF的各种组织学分级波形蛋白的表达。材料和方法。为了评估在OSF的20轻度病例，OSF的20严重的情况下，与正常口腔颊粘膜10例波形蛋白的免疫组化表达。结果。波形蛋白整体染色强度明显增高()在OSF情况下超过正常控制。严重的OSF患者的成纤维细胞中波形蛋白染色强度也明显增加()。结论。考虑到本研究中波形蛋白的显著表达，未来的研究应该包括OSF成纤维细胞的细胞骨架IF和其他丝。

1.介绍

槟榔果俗称“槟榔果”，是印度最古老的口腔按摩机构之一。据估计，全世界约有6亿人使用槟榔。1]。咀嚼AN对口腔健康的影响是多种多样的。在其对口腔结构的众多影响中，重要的是口腔粘膜下纤维化(OSF)的发展，这是一种潜在的恶性疾病[2]。

OSF的特征在于在口腔粘膜下层的胶原纤维的异常蓄积。实验研究已经表明，AN的乙醇提取物在人真皮成纤维细胞[刺激胶原蛋白的合成3]。AN提取物还可以稳定胶原纤维，并将其呈现抗降解。与正常成纤维细胞相比，成纤维细胞OSF合成较大量的胶原蛋白;他们有较高的胶原mRNA水平;和它们产生I型胶原三聚体，其是抗降解[4]。

到目前为止，很少有研究探讨槟榔碱对细胞骨架成分的可能影响[五，6]。该vimentin antibody recognizes a 57 kDa IF and labels a variety of mesenchymal cells, including melanocytes, lymph cells, endothelial cells, and fibroblasts [7]。波形蛋白表达在细胞生长、细胞周期、肿瘤分化和肿瘤发生过程中显著增强[五]。虽然OSF被视为癌前状态，波形蛋白表达在人颊粘膜在槟榔碱的存在的程度并不清楚。

该研究的目的是比较在OSF的各种组织学分级波形蛋白的表达，并将其与该正常黏膜。此外，试图阐明波形蛋白在OSF的发病机制中的作用。

2.对象和方法

该研究共有40名患者访问了作者所在的研究所，并被诊断为临床和组织学上的OSF。该同意书收集了所有患者，并得到了机构审查委员会的批准。OSF病例的组织病理学评估和分级采用Pindborg和Sirsat给出的标准[8]。从年龄和性别匹配的受试者中获得的10个正常口腔黏膜(颊黏膜)样本构成了对照组。

2.1。苏木精和伊红染色

用福尔马林固定石蜡包埋标本进行了4次实验μm厚切片，苏木精和伊红染色，以组织学证实临床诊断和其他评价。这些切片用于OSF的分级。

2.2。免疫组化协议

用聚l -赖氨酸(PLL)切片，8微米厚，用抗imentin单克隆抗体(Vim 3B4, 1:200)染色;使用标准亲和素-生物素-过氧化物酶络合方法。用蛋白水解酶(蛋白酶K)进行酶促消化，以提高福尔马林固定组织切片的染色强度和均匀性。然后使用二氨基联苯胺(DAB, Zymed)作为定位抗体结合的底物。用Harris苏木精复染，用中性固定培养基固定，光镜下观察免疫过氧化物酶反应性。以扁桃体组织染色阳性作为阳性对照，以上皮组织染色阴性作为波形蛋白染色阴性对照。

2.2.1。评分

vimentin染色切片由三位口腔病理学家独立进行详细研究，组织切片分级如下。

将切片最初被认为在低功耗和结缔组织基质被分为两个区域，表层区域和深区。每个区被单独考虑，并用0表示没有染色，1表示轻度染色，2表示中度染色，和3表示强染色得分的0-3分。

随后在高倍镜下观察组织切片，并研究染色的细胞定位。将成纤维细胞和内皮分别染色，评分范围为0 - 3分，0分为未染色，1分为轻度染色，2分为中度染色，3分为染色强烈。

所有病例均显示整体染色强度，评分范围为0 - 4分，0分为无染色，1分为轻度染色，2分为中度染色，3分为染色强烈，4分为染色最强烈。

2.3。统计分析

所包括的频率（与评分0，1，2，3例数，和4），平均值和标准偏差的描述性数据对于所有组来确定。由于染色的评估是基于得分完成后，非参数方法，曼 - 惠特尼测试中，使用成对比较。Interobservers’精密度通过使用单因素ANOVA用于多个组分析同时计算三个观察者之间的平均得分评估。对于所有的测试中，小于或等于0.05为有统计学意义。所有的计算都是在个人电脑上使用Minitab软件完成的(美国，v.16)。

3.结果

50例总样本大小包括在研究中。四十例OSF的构成的研究组和正常10案件（图1）作对照。年龄从18岁至45岁不等的OSF病例，平均年龄为。超出正常对照组共有十例，年龄范围为20至37岁，而是平均年龄。在40例病例中，极早期占10%(4)，早期占40%(16)，中晚期占40%(16)，晚期占10%(4)。非常早期的病例和早期病例一起被认为是轻度组，共20例2)。中、晚期合并为重度组，共20例(图)3)。分析比较不同组的染色方式。波形蛋白染色在不同区域和整体强度的分布评分在表中表示1，2，3，4和五。

染色的强度进行评分系统对结缔组织的不同区域;也就是说，表面/皮下区和深层中分别考虑。染色单个电池还注意到与染色强度的图案的成纤维细胞和内皮细胞分别分级。这些分级是由一个病理学家和单独两种口服病理学家作出。得分后进行了比较interobservers的信心和很高的保密性，记录其节目得分的方法是可靠的。分数进行分级上的0-3的组织定位（浅表和深部）和细胞定位（成纤维细胞和内皮细胞）的比例，而在0-4尺度的得分被记录为总强度。

浅表得分温和的情况下有一个平均的1.8与1.1的标准差，而在严重的情况下得分有1.1值平均为1.9和标准偏差。正常情况下，并没有表现出与3分任强染色，但有1.2与0.8偏差的平均分数。曼 - 惠特尼测试呈轻度与重度的情况下，温和与正常情况下，重度与正常情况之间没有显著差异。

深比分为轻症病例均重度患者得分均值为2.1，标准差为0.7。正常病例无明显染色，平均评分为1.2，偏差0.8。的显著差异值严重和正常情况之间注意而作为群体的其余部分并没有表现出任何显著的差异。

记录成纤维细胞染色模式，轻度OSF的平均评分为2.3分，重度OSF的平均评分为2.4分，明显高于正常病例的1.5分。该重度和正常患者的数值均为0.03分，差异有统计学意义。

内皮显示，轻症病例和OSF的严重病例强烈染色模式，但没有病例显示在正常情况下强染色。2.5的平均分录得温和的情况下，2.7重症病例和1.4在正常情况下。该轻度与正常和重度与正常之间的值非常显著。

整体强度的模式在0到4的范围内进行评分。轻度表现为3 / 10,4 / 4，平均均值2.7，标准差1.2。重度染色强烈，8例评分3分，10例评分4分，平均3.2分，偏差1.2分。正常病例无明显染色，14例仅为2分。正常病例的平均得分为1.5分，变异为0.8分。该值是在温和的情况下与正常和严重的情况下与正常非常显著。

4.讨论

OSF的发病机制和治疗一直是一个有争议的话题，自从Schwartz [9首次描述这种情况是在1952年。1980年，Pindborg估计印度大约有25万OSF病例，但2002年的估计增加到200万，增加了8倍。9]。随着越来越多的使用gutka /泛马萨拉产品在印度的OSF病例数急剧增加。OSF是这被认为是癌前病变一个奇特的疾病;然而，它展示了一个可变生物学行为和任何治疗的响应仍然是一个令人沮丧的。近年来一些流行病学研究都强调AN的OSF的病因作用。

槟榔碱，对AN的主要生物碱，有报道为致病因素之一为OSF患者的染色体畸变[10]。使用从OSF受试者获得的人类成纤维细胞进行的组织培养实验显示，与对照培养相比，胶原合成提高了170% [3]。已证明槟榔碱和槟榔素促进胶原形成[11]。稳定口腔粘膜胶原蛋白和防止胶原酶降解，以及赖氨酸氧化酶活性的增加有助于OSF细胞外基质成分的积累[12]。

大多数脊椎动物细胞的细胞骨架由微丝，微管，和IF的。IF起着支撑或一般结构的作用[13]。波形蛋白是2类IF，主要表达于间充质来源的细胞中，在IF中最为丰富[14]。在牙齿组织，它已经在牙齿发育过程中免疫定位在牙周膜和牙髓成纤维细胞，成牙本质细胞中，并在牙乳头和牙囊的成纤维细胞[15]。波形蛋白的功能包括调节细胞附着、亚细胞组织和从细胞膜到细胞核的信号转导。有研究表明，波形蛋白在体外的表达是去分化的标志[16，17]。

研究表明槟榔碱能诱导胶原形成，具有细胞毒性，并能促进双链核酸的合成[10]和细胞形态变化。这种变化在细胞形态牵连槟榔与在细胞有丝分裂和细胞内运输机制干扰有关细胞骨架紊乱。槟榔碱对正常人颊粘膜成纤维细胞的波形的效果已被极少数作者先前研究。

Antivimentin抗体先前已用于研究染色在OSF情况下的强度[五]。在槟榔碱诱导的OSF染色的强度的变化根据个体的组织或细胞染色没有清楚地记录和本地化。因此，本研究旨在注意到正常人颊粘膜成纤维细胞的波形蛋白的表达，并使用免疫组织化学方法OSF患者的各种组织学分级的成纤维细胞高表达进行了比较。这项研究还旨在阐明在OSF的发病波形可能发挥的作用。

本研究采用抗imentin抗体(克隆:vim3b4)进行免疫组化染色。该克隆优于其他研究人员使用的克隆V9 [五]，以Vim 3B4克隆有一个附加的优点，即它在福尔马林固定的组织切片染色以及[7]。这一过程还包括使用蛋白酶K进行酶解或抗原提取。在我们的研究中获得的染色模式更均匀，并注意到更大的染色强度。

正常颊粘膜的结缔组织由固有层中松散编织的胶原束组成，在上皮附近可见精细的网状结构，在固有层深处可见较粗的结构。波形蛋白在胶原纤维中轻微被标记，而在炎症细胞周围更为明显[7]。

正常和OSF患者的成纤维细胞染色有显著差异。然而，这种差异可能是纤维母细胞亚型存在的结果，该亚型更容易受到外部刺激或基因调节。这表明，在我们的研究中，OSF病例中强度模式的增加与其他研究相似[五]。这些数据表明波形的OSF的发病机制可能参与。虽然这些发现的全部意义尚待阐明，研究表明，如果在OSF的情况下表达的是一个复杂的现象。如果被认为发挥细胞内的主要结构的作用。出现波形蛋白的表达，不仅输入和分化的阶段，而且对细胞动力学和接触[基本性能密切相关13]。我们认为，我们的研究结果可以进一步了解OSF可能的发病机制。

5.结论

这种病的发病机理和发生仍是一个未解之谜。该疾病是研究病理纤维化的一个极好的模型，与身体其他部位的病理纤维化有相似的组织学图像。目前的需要是开发出一种成功治疗疾病的治疗模式，而这只有通过了解疾病过程的病理生理学才能实现。在研究成纤维细胞的细胞骨架成分的同时，也应考虑胞浆内细胞器的研究。波形蛋白在培养细胞和体内细胞中的作用尚不清楚。需要进一步的研究来检测波形蛋白基因转录本，并了解OSF的演变是否仅仅是由AN构成增加改变波形蛋白的从头合成和沉积引起的。考虑到本研究中波形蛋白的明显表达，未来的研究还应包括细胞骨架IF和其他细丝，这可能被证明是OSF的潜在治疗靶点。

利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

承认

作者想感谢马乔里·科雷亚博士，病理学，圣约翰医学院，班加罗尔，印度系，她的专业知识和工作的免疫组化和幻灯片的分析扩展帮助。

参考文献

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