长期栽培的影响与补充Alpha-Ketoglutarate代谢过程的媒介酿酒酵母

文摘

在去年年中,alpha-ketoglutarate(爱科技),三羧酸循环的重要中间,集中研究与stress-protective膳食补充剂和潜在的抗衰老的效果。在这里,我们审查的影响外生爱科技酵母的代谢过程和生存酿酒酵母在长期的栽培。增长爱科技总细胞数没有影响,但增加活跃的细胞的数量在晚天的培养从7天(15)。总蛋白质含量逐渐增加,糖原和海藻糖被发现在7天在AKG-grown细胞培养有显著影响。控制细胞的代谢活动和超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活动减少,而水平的蛋白质羰基和low-molecular-mass硫醇增加7天期间种植。这表明氧化应激在固定相细胞的发展。与此同时,固定相细胞培养爱科技拥有更高水平的low-molecular-mass硫醇和羰基蛋白和低水平α二羰基化合物相比来控制的。集体、更高水平的存储碳水化合物和一个激活与减少蛋白质氧化损伤的抗氧化防御可以防止失去生殖能力在酵母细胞长期培养AKG-supplemented媒介。

1。介绍

Alpha-ketoglutarate(爱科技),alpha-ketoglutaric酸的阴离子,是三羧酸循环的重要中间,夫妻氨基酸代谢与葡萄糖氧化。在动物模型的研究表明膳食补充爱科技带来许多有利影响新陈代谢,抗压力,各种与年龄相关的流程和功能下降(1- - - - - -3]。爱科技的有利影响主要是由于其作为前体的某些氨基酸如谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸和脯氨酸(1,4]。此外,爱科技可以抑制蛋白质分解代谢和合成代谢激活过程在动物组织(5]。此外,外源爱科技可以参与三羧酸循环,从而强化线粒体呼吸(6]。结果,增加代活性氧(ROS),呼吸代谢的副产品,可能发生和发展导致氧化应激(7]。因此,线虫所示ROS水平就越高秀丽隐杆线虫生长在AKG-supplemented介质(8]。

先前的研究表明,外生爱科技可以诱导氧化应激的低强度伴随着一个激活的防御系统。保护机制的提到的刺激应该是负责高公差AKG-treated生物挑战强大的氧化或其他类型的压力。它也可能有助于防止功能随着年龄下降(2,3,9]。特别是AKG-supplemented食品防止老年性增加自由基损伤生物分子在老年小鼠3)和压力阻力增加黑腹果蝇苍蝇(9]。同时,爱科技影响不同的氧化压力参数和水平的存储大分子在年轻人和老年人d .腹(2,9]。我们最近报道增长AKG-supplemented介质阻力增加的指数增长的酵母酿酒酵母用过氧化氢氧化应激诱导。此外,AKG-grown酵母细胞显示更高的过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶的活动和更高水平的thiol-containing化合物,表明一个激活的抗氧化系统10]。

因为我们已经知道强烈抗氧化系统的功能与碳/能量代谢和蛋白质合成,本研究旨在检验爱科技的影响酿酒酵母细胞在长期栽培通过分析各种活性氧代谢参数及指标内稳态。在代谢参数,主要是关注总代谢活动和水平的存储的碳水化合物,蛋白质和糖原,酵母和海藻糖,扮演了一个重要的角色在长期生存能力(11- - - - - -14]。长期种植导致酵母老化时间文化,这意味着丧失生殖能力,紧随其后的是酵母细胞的死亡15,16]。根据数据显示,在多细胞动物爱科技有延缓衰老的作用,我们测试了如果爱科技能够延缓衰老酿酒酵母。对于这个目标,酵母培养的时间寿命有和没有的爱科技媒介是通过计算生殖活性细胞的数量决定的。

2。材料和方法

2.1。试剂

Phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF) ethylenediamine-tetraacetic酸(EDTA), 2, 4-dinitrophenylhydrazine (DNPH), 5、5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB), 2, 3,去除氯(TTC),吉拉德试剂T,淀粉转葡糖苷酶(# 10115),海藻糖酶(# T8778)、蛋白胨、酵母提取物和获得Sigma-Aldrich公司(美国);N, N, N′, N′-tetramethylethylenediamine (tem)和槲皮素来自Reanal(匈牙利);二钠盐alpha-ketoglutaric酸(纯度99%)来自原生生物AB(瑞典);所有试剂测定葡萄糖和triacylglycerides(标签)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)活动是PZ Cormay S.A.(Łomianki、波兰)。所有其他试剂获得从当地供应商(乌克兰),均为分析纯。

2.2。生长条件和固定相的生存

的酿酒酵母应变YPH250(宽的类型,垫一个trp1 -Δ1 his3 -Δ200 lys2 - 801 leu2 -Δ1 ura3-52 ade2 - 101)用于本研究提供的请Youshiharu Inoue博士(日本京都大学)。细胞生长在28°C风潮在液体YPD 175 rpm中含有1% (w / v)酵母提取物,2% (w / v)蛋白胨2% (w / v)葡萄糖,和10毫米的二钠盐α酮戊二酸(爱科技)。初始细胞介质的滴定度约为0.3×10⁶细胞/毫升。

酵母细胞的生存能力是由克隆形成试验(15]。为此,整除(100μl)从每个采样酵母文化,连续稀释,镀一式三份YPD与琼脂培养基。可行性评估作为一个单独的酵母细胞的繁殖能力,形成殖民地(克隆形成单位和CFU) YPD琼脂。在28°C细胞种植了三天前殖民地计数。酵母细胞的总数文化被计入Goryaev光显微镜下50倍稀释后室。

2.3。制备提取并测定游离酶活性和蛋白质的浓度

酵母细胞的总数文化是计算在18 h(指数后期阶段),42小时(早期的固定相),在第七天晚(固定相)的增长。计算后,细胞实验在室温下文化被离心收集(5分钟,3000年),用50 mM磷酸钾缓冲(КPi, pH值7.0)。酵母颗粒称重和resuspended在裂解缓冲(50 mMКPi、1毫米PMSF和0.5毫米EDTA)。细胞提取物是由激烈的涡流酵母悬浮液与玻璃珠(0.5毫米)如前所述17)和保存在冰立即使用。生化参数测量与分光光度计spekol - 211(卡尔蔡司,耶拿,德国)或SF-46 (LOMO、列宁格勒、俄罗斯)。

测量活动的超氧化物歧化酶(SOD, EC 1.15.1.1)和过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)进行了如前所述17]。

活动的天冬氨酸转氨酶(ASAT EC 2.6.1.1)和丙氨酸转氨酶(ALAT EC 2.6.1.2)是衡量修改方法根据国际临床化学联合会(IFCC)使用Liquick Cor-ASAT和Liquick Cor-ALAT包,分别。

可溶性蛋白质含量决定了考马斯亮蓝g - 250染色法(18)与牛血清白蛋白标准。

2.4。水平的测定Low-Molecular-Mass硫醇

确定的水平low-molecular-mass硫醇(L-SH)整除的细胞与三氯乙酸提取涨跌互现的最后酸浓度10%和离心机(16000 ,5分钟,21°C)去除颗粒状蛋白质和最后的上层清液用于化验。

免费thiol-containing化合物以获得无蛋白上层清液的吸光度硫醇配合5、5′-dithiobis-2-nitrobenzoic酸(DTNB) 412海里(19]。浮在表面的整除(75μl)和20孵化μ米DTNB 50 mM KPi缓冲区(pH值8.0)在最后一卷1.5毫升30分钟。在空白,上层清液代替相应的三氯乙酸溶液的体积。吸收在412 nm和读14×10的摩尔消光系数³米⁻¹厘米⁻¹被用来计算硫醇的水平。硫醇含量表示为nanomoles SH-groups每10⁸细胞。

2.5。的决心α羰基二羰基化合物和蛋白质

羰基化合物的含量蛋白(CP)测量通过确定的数量2,4-dinitrophenylhydrazone形成反应2,4-DNPH如前所述[17]。羰基含量从2的吸光度,计算4-dinitrophenylhydrazone以370海里使用22毫米的消光系数⁻¹厘米⁻¹。结果表示在nanomoles每毫克的蛋白质。

α二羰基化合物(DC)是衡量Girard-T反应(20.]。的吸光度双取代的化合物,它是由绑定两个吉拉德T分子二羰基试剂组,测量的最大吸收波长325 nm使用18.8毫米的消光系数⁻¹厘米⁻¹对乙二醛(16]。乙二醛的结果表示在nanomoles等价物每毫克的可溶性蛋白。

2.6。碳水化合物测定和Triacylglyceride水平

对于实验,2×10⁸细胞实验文化被收获,用蒸馏水洗两次。酵母颗粒在50 mM resuspended Na-acetate缓冲区(pH值5.2)测量碳水化合物或PBST缓冲区(10毫米Na₂HPO₄2毫米КН₂РО₄137 mМ氯化钠、2、7毫米氯化钾,特里同x - 100和0.05%,pH值7.4)triacylglyceride化验。细胞悬浊液和玻璃珠涡7分钟(2:1 w / w酵母/珠子)在室温和加热在70°C 5分钟内源酶的灭活。细胞碎片是15分钟在16000被离心分离在室温下。细胞提取物用于进一步分析。

自由细胞内葡萄糖的含量是衡量葡萄糖氧化酶试验使用一个诊断工具,Liquick Cor-glucose,遵循制造商的指示。糖原的含量和细胞提取海藻糖是由测量葡萄糖释放的淀粉转葡糖苷酶或海藻糖酶,分别为(21]。为此,10μ10 l的样本在一夜之间被孵化μl (1 U /毫升)淀粉转葡糖苷酶或10μl (0.025 U /毫升)海藻糖酶和轻微的搅拌在37°C。葡萄糖释放海藻糖和糖原的量是由Liquick Cor-glucose工具包。海藻糖的含量和糖原的减法计算的自由细胞内葡萄糖总葡萄糖含量的样品后隔夜孵化酶。标准葡萄糖溶液的浓度范围从2到20μg / ml被用来计算葡萄糖含量酵母细胞提取物。结果表示为μ每10 g葡萄糖⁸细胞。

Triacylglyceride(标签)水平测定使用诊断工具,Liquick Cor-TG,遵循制造商的指示。标准标记浓度范围从3 - 30的解决方案μg / ml被用于计算在酵母细胞中提取标签的内容。结果表示为μ每10 g标记⁸细胞。

2.7。测定代谢活动

评估酵母的代谢活动,2,3,去除氯(16]。实验中,3×10⁸细胞实验文化被收获,用蒸馏水洗两次。酵母颗粒在1毫升的50 mM resuspended KPi (pH值7.0)和混合0.35毫升的0.5% 2、3,去除氯(TTC)。新陈代谢活跃的细胞能够减少染料不溶于水的红色甲瓒从细胞中提取乙醇/丙酮混合物(2:1),和这个解决方案的吸光度测量485海里(22]。结果表示为OD_485年单位每10⁸细胞。

2.8。统计分析

实验数据表示为4 - 8独立实验的平均值±标准平均误差(SEM)。对比手段使用的小动物——一张长有学生的表现以及或方差分析(方差分析)其次是Student-Newman-Keuls测试。

3所示。结果

3.1。岁Alpha-Ketoglutarate增加酵母细胞的生殖能力的文化

富裕YPD酵母细胞培养介质。YPD介质,酵母细胞积极萌芽和产生大量的年轻的细胞。因此,人口总是包含年轻和年老酵母细胞的混合物。它会引起麻烦的准确估计最大酵母寿命。此外,酵母细胞的再生可以观察到由于利用养分释放的死细胞文化后达到最大密度(15]。尽管有这些限制,YPD介质中的种植允许可靠地估计不同的补充剂的影响人口老化速率的酵母(16,23,24]。特别是,我们之前发现的能力红景天的提取增加酵母生存YPD介质在长期栽培[24]。

前,我们检查的影响,不同的爱科技YPD介质浓度对酵母生长和抗氧化应激的指数增长的酵母细胞(10]。我们发现在10毫米爱科技的浓度没有影响酵母的增长还增强内源性抗氧化防御,增加酵母的抗氧化能力。此外,媒介与氯化钠作为补充额外的控制排除钠离子的影响。我们没有发现任何20毫米氯化钠对抗氧化防御系统的影响和酵母压力阻力。在这项研究中,总细胞数和活跃的细胞数量以酵母YPD培养基上的培养与10毫米爱科技补充。在控制和AKG-supplemented文化,总细胞数在类似的方式改变培养(图1(一))。在18 h的增长,酵母文化细胞数量最低,后来增加了42小时(大约两次 )。然后,细胞的数量略有增加第三天( 11)和保持不变,直到一天。16%和13%,减少总细胞数在控制和实验观察到在15天文化,分别与天相比11(图1(一))。活跃的细胞的数量在酵母文化是由一个细胞的能力评估YPD琼脂板上形成一个殖民地。见图1 (b)、克隆形成能力从第一天增加到11天在酵母的文化。它与更高的总细胞数在这些文化(图1(一))。然而,细胞总数和活跃的细胞数量只在第一天正好。在进一步的培养,生殖活性细胞的数量低于总细胞数,建议减少酵母的繁殖潜能与时代文化。克隆形成能力相似的控制和AKG-supplemented文化在1 - 3天。然而,AKG-supplemented文化有25%和35%更活跃的细胞在天7和11比控制的。在15天,酵母细胞的生殖能力明显下降相比,11天,但控制细胞显示更多实质性的损失比AKG-grown的繁殖能力。类似的总细胞数,AKG-supplemented文化有60%更多的生殖细胞比控制在15天。

3.2。培养爱科技增加细胞生物量和酵母细胞的蛋白质水平

保护爱科技对酵母生存能力的影响观察已经第七天的培养(图1 (b))。因此,我们研究了几种生化参数描述代谢过程的强度酿酒酵母细胞培养有或没有10毫米爱科技在7天内。参数测量在细胞收集后期指数(18 h)阶段,早期的固定相(42 h),和后期增长固定相(7 d)。在图2,我们将展示水平的水溶性蛋白质和氨基酸代谢的两种酶的活动,ALAT和反卫星上。水溶性蛋白质水平的上升而种植的控制和AKG-supplemented媒体(图2(一个))。结果,控制和AKG-cultivated细胞蛋白质含量要高出60%和43%,分别在第七天与18 h的增长。与此同时,种植在酵母细胞AKG-supplemented媒介提升更高的蛋白质含量。特别是,AKG-grown细胞显示更高的蛋白质含量在31%和19% 18 h和第七天,分别,而在同一时间点控制的。值得注意的是,与在指数期蛋白质含量增加,AKG-grown细胞湿生物质比控制的要高出15%(表1)。

ALAT类似的活动在控制和AKG-grown细胞在培养期间(图2 (b))。酵母细胞表现出最高的增长与ALAT活动18 h进一步降低酶活性在42 ~ 40%和50% h和7天,分别。ASAT显示不同的活动模式的活动控制和AKG-cultivated细胞(图2 (c))。在18 h的增长,AKG-grown细胞ASAT活动相比要高出40%控制细胞。ASAT活动不变在控制细胞在第二天的培养,而在AKG-grown细胞,活动展示了一个依赖于时间的减少,在42 23%和40%降低h和7天,分别与一个18 h。

3.3。爱科技增加了酵母细胞的贮藏碳水化合物含量

在控制和AKG-supplemented文化内容的存储的碳水化合物,海藻糖和糖原,在实验时间(数据3(一个)和3 (b))。海藻糖含量相似18 h和42 h培养的酵母文化(图3(一个))。在第七天,3.3倍和4.6倍的增加海藻糖水平观察细胞培养和没有爱科技,分别与相同的酵母文化相比18 h的种植。当比较控制和AKG-grown酵母文化在第七天,补充酵母中海藻糖水平高出1.4倍。糖原的水平降低了40%在对数生长期细胞生长与爱科技补充而控制的(图3 (b))。似乎在第二天的培养,糖原显著积累在酵母细胞从两种文化,但控制细胞比AKG-supplemented表现出更少的糖原的。因此,糖原含量控制细胞的1.4倍和2.5倍,4.8倍和5.5倍高AKG-cultivated细胞42小时和7天,分别在18 h值相比增长。一个钟形模式的葡萄糖含量对酵母细胞(图观察3 (c))。控制和AKG-grown细胞,血糖水平是最低的18 h和表现出显著增加42小时(在控制2.4倍和5.5倍AKG-grown细胞)。AKG-supplemented酵母,然后,在第七天葡萄糖含量成为低于先前观察到在42 h的种植,但仍高于18 h,而对于控制酵母,并没有显著的差异。应该注意,AKG-grown细胞显示低39%和40%更高的自由在18 h和42 h葡萄糖水平,分别比控制细胞的培养时间。在第七天,在血糖水平没有区别细胞两种文化。标签在酵母细胞的水平并没有改变无论种植周期或者爱科技补充(表1)。

3.4。爱科技对活性氧的代谢活动和参数的影响在酵母细胞内稳态

酵母细胞的总代谢活动降低随着时间的培养在控制和AKG-supplemented媒体(图4)。在细胞培养和补充爱科技、代谢活动在指数期高出1.3倍(18 h)和低28%酵母进入固定相(42 h)与控制细胞。细胞培养的第七天,从控制和实验文化有类似水平的这个参数。

调查爱科技对酵母细胞的抗氧化系统的影响,抗氧化酶的活动和氧化应激的标记被估计。在已知的抗氧化酶,我们测试了超氧化物歧化酶(SOD),过氧化阴离子自由基催化歧化作用(过氧化氢(H)₂O₂),过氧化氢酶,分解H₂O₂无毒的水和氧气(7]。SOD是相似的活动控制和AKG-grown细胞在18 h和培养(图的第七天5(一个));只有在42 h,细胞培养爱科技显示,55%较高的SOD活性相比,控制的。在控制酵母文化,SOD活性最高的18 h,然后随着年龄的增长而逐渐下降的酵母的文化。在AKG-grown细胞SOD活性达到极大值42小时,18岁患病率高于h,在第七天它下降到接近观察到18 h。不管介质类型、过氧化氢酶活性最低18 h和最高42小时的培养与适度的减少在7天(图(~ 2倍)5 (b))。过氧化氢酶活动的显著差异之间的控制和实验观察细胞只在18 h, AKG-grown细胞26%过氧化氢酶活性高于控制的。氧化应激标志物的水平,low-molecular-mass硫醇(L-SH)(图5 (c)(图)和羰基蛋白(CP)5 (d)),玫瑰在培养时间在细胞生长中有或没有爱科技10毫米。同时,AKG-grown细胞有61%,43%,和29%在18 h L-SH水平较高,42 h,第七天,分别与控制细胞在同一时间点。CP水平并没有从两种文化在不同细胞中18 h(图5 (d)),但显著增加此参数控制细胞中可观察到下一天的培养。因此,控制细胞高出63%和74% CP水平42 h和第七天,分别与各自的价值相比在18 h。同时,CP水平AKG-grown细胞仅为31%和37%,42 h和第七天,分别与18 h。我们还测量了水平的α二羰基化合物在细胞(DC) 7天的文化。这些化合物与活性氧中间产品的非酶的糖化/自然氧化的单糖(16,23]。直流低24%水平细胞生长在爱科技的存在而控制细胞培养酵母的文化(表的第七天1)。

4所示。讨论

酵母酿酒酵母被广泛用于理解分子机制调节哺乳动物细胞的代谢过程。有人建议,酵母文化固定相是一个很好的模型来研究衰老的体细胞在高等真核生物,因为在这个阶段酵母成为postmitotic细胞和依赖的线粒体呼吸来维持生存。酵母,过程中进入固定相是最好的研究glucose-containing液体介质在30°C和展品几个不同的阶段,包括指数期,在此期间主要增长率最大和细胞利用葡萄糖作为碳和能源,和固定相,当所有碳能源耗尽和细胞数量维持在相对稳定的价值(13,15]。各种各样的实验数据支持关键作用的抗氧化剂防御和存储的碳水化合物在固定相酵母寿命的延长11- - - - - -16,23- - - - - -27]。

Alpha-ketoglutarate(爱科技)是一个重要的中间许多代谢过程的分解代谢和合成代谢功能相结合。我们之前的结果表明,爱科技并不影响增长的补充酿酒酵母YPH250应变(野生型)glucose-containing介质从接种到72 h的培养(10]。在这里,我们表明,爱科技补充没有影响总细胞数在15天培养期间YPH250文化(图1(一))。同时,总细胞数在酵母生长变化符合典型的增长模式的特点酿酒酵母在批处理文化。细胞数量是最低的18 h和增加42小时的两倍。因此,18 h的增长与增长曲线的指数后期阶段。真正的固定相在第三天开始,因为没有观察细胞数量增加了,这阶段持续了11天(图1(一))。在15天,总细胞数下降阶段,表明文化死亡的一个阶段。总细胞数、活跃的细胞的数量在酵母文化也依赖于时间的培养(图1 (b))。在指数增长阶段(第一天),几乎所有的细胞能够增殖,形成殖民地YPD平皿上。爱科技的积极作用在增殖能力观察在7 - 15天,当控制细胞形成的GFUs数量低于AKG-grown的。因此,爱科技增加了酵母岁人口的繁殖潜能。机制保护爱科技效果可能与代谢途径的调制,这个酮酸可能涉及。我们的研究结果表明,爱科技推广不同对数生长期和稳定期细胞代谢变化。

我们这里显示指数增长的酵母细胞有更高价值的总代谢活动(图4(图),蛋白质水平2(一个)(图),ASAT活动2 (b))和低水平的糖原(图3 (b)免费)和葡萄糖(图3 (c))AKG-supplemented中比在控制。这些结果让我们表明,外生爱科技修改蛋白质/氨基酸和葡萄糖代谢在对数生长期的细胞。氨基酸代谢的爱科技的参与是建立;特别是爱科技发现作为生物合成的前体氨基酸如谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸和脯氨酸1,4,9]。显然,一个AKG-induced氨基酸浓度的增加可以刺激蛋白质合成,导致更高水平的总蛋白在酵母细胞(图2(一个))。支持这一发现,爱科技提高蛋白质合成的能力由于增加生产的氨基酸在小肠猪上皮细胞(5]。AKG-grown细胞蛋白质合成的增加可以导致更高的这些细胞生物量控制相比(表1)。此外,AKG-supplemented细胞蛋白质含量高于控制的固定相的增长。这可能表明爱科技预防与年龄有关的蛋白质合成下降和/或增加蛋白质的分解代谢11]。此外,一些研究表明,高浓度的氨基酸媒体可以促进酵母生长和延长寿命的研究28,29日]。因此,AKG-promoted合成的氨基酸可能是重要的为了更好的酵母生存能力在我们的实验。

除了参与蛋白质/氨基酸代谢、爱科技是克雷布斯循环中间。先前的研究表明,外部添加爱科技正积极通过三羧酸循环利用,导致增加线粒体呼吸和氧化磷酸化6)和ATP生产(30.免费),以及减少葡萄糖和标记水平(2,4,31日]。这些事实可以解释在AKG-grown细胞中葡萄糖和糖原水平较低,因为一个更积极的克雷布斯循环(由于增加数量的中间体)需要更多的乙酰辅酶a的分子中形成葡萄糖有氧氧化。然而,应该注意的是,三羧酸循环和呼吸链运转不良酿酒酵母细胞呈指数级增长(2%)血糖水平很高。葡萄糖是优先通过无氧糖酵解代谢形成nonfermentable碳化合物,尤其是乙醇,它产生很强的降解物阻遏呼吸所需的酶或酶的克雷布斯循环11,32]。葡萄糖耗尽后,酵母细胞重组他们的新陈代谢从发酵呼吸以利用其他碳源在中乙醇等。在我们之前的研究中,我们表明,葡萄糖浓度在18 h(从控制和AKG-grown收集媒体的增长酿酒酵母文化是低于0.2%。这意味着细胞不低于葡萄糖压迫和能够获得能量耗氧(10]。我们目前的总代谢活动(图上的数据4)支持增加代谢率在酵母细胞生长在爱科技指数阶段。因为方法用于测定线粒体代谢活动反映了主要功能(22),它可能是猜测,细胞生长与添加爱科技媒介可以呼吸更积极地比没有爱科技补充。

因为爱科技可以强化线粒体呼吸,它可能导致通过线粒体ROS增加生产。特别是,增强ROS水平被发现秀丽隐杆线虫生长在爱科技(8]。在响应中ROS水平,增加抗氧化系统可以被激活(7]。在我们之前的研究中,我们展示了一个激活抗氧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶,连同一个增强的low-molecular-mass硫醇,代表主要的谷胱甘肽(33),在AKG-grown酵母细胞对数生长期(10]。在这里,结果指数增长的细胞(图5证实了我们的以前的观测。

在固定相,控制和AKG-grown细胞水平较高和葡萄糖、糖原和海藻糖(图3)。很期待,因为许多研究证明增加糖质新生和积累储备碳水化合物在固定相酵母细胞11,14,23]。储备碳水化合物不仅作为能源和碳源在饥饿的细胞也有stress-protective功能,特别是海藻糖(11- - - - - -14]。培养基的补充与爱科技提升更高的储碳水化合物和葡萄糖值固定相细胞(图3)。这表明爱科技可能在酵母细胞刺激糖质新生。这种效应可以实现通过使用爱科技等氨基酸合成糖原的谷氨酰胺(1,4)或通过代谢爱科技与草酰乙酸克雷布斯循环,一个著名的前体在葡萄糖生物起源。活动的增加ASAT年初固定相细胞生长在爱科技(图2 (c))也可以为草酰乙酸供应糖质新生就像饥饿的动物(所示8]。反过来,增加储备的葡萄糖水平可以直接合成碳水化合物。

损失的酵母生存在固定相是伴随着减少总代谢活动和氧化损伤生物分子的积累11,13,16,25,26]。同时,激活抗氧化防御和积累储备碳水化合物被认为是有益的事件对酵母细胞在年龄让他们仍然可行的文化在长时间的营养消耗(11,13,14,26,27]。我们的结果与文献数据吻合很好。在控制细胞SOD活性和降低L-SH水平和过氧化氢酶活性增加,羰基蛋白水平观察在早期固定相(42 h(增长),而18 h的增长。这些变化表明,酵母细胞氧化应激的发展进入固定相,这是与其他作者的数据一致16,25,27]。此外,固定相减少细胞代谢活动在长时间保持生存能力(11,13,23]。我们的研究结果与这一机制,证实减少总在细胞代谢活动固定相相比,酵母在指数期(图4)。同时,它被发现之前,代谢活动放缓并不总是伴随着活性氧的产量下降;ROS水平甚至可能升高(34),和固定相细胞患有慢性氧化应激(25]。因此,生物分子的氧化改性可能超过抗氧化系统的能力。在我们的例子中,增加氧化蛋白质控制中可观察到细胞水平在早期和晚期静止阶段,尽管更高价值的过氧化氢酶活性和L-SH-level在这些细胞相比,对数期细胞。此外,降低SOD活性在42 h和第七天比较值在18 h和过氧化氢酶活性在第七天相对下降到42 h可能引起的氧化改性的这些酶(早些时候报道17,35]。

在AKG-supplemented文化的情况下,高水平的L-SH和减少氧化损伤蛋白相比,固定相酵母细胞观察控制的数据5 (c)和5 (d))。SOD、过氧化氢酶的活动AKG-grown酵母在控制酵母类似7天,但在42 h AKG-grown酵母中SOD活性高于控制(图5(一个))。此外,AKG-grown细胞水平较低α二羰基化合物(DC)比控制在7天(表1)。的α二羰基化合物与活性氧中间产品的非酶的糖化/自氧化葡萄糖,在酵母(参与衰老过程16]。更高水平的糖化产品形成高葡萄糖水平在中(2%葡萄糖),通过发酵葡萄糖主要是利用,它缩短时间酵母的寿命16,36]。然而,热量限制或开关的葡萄糖代谢发酵酵母呼吸可能会降低糖化和延长寿命(36]。从上面我们讨论爱科技可能促进呼吸代谢在酵母细胞在高浓度葡萄糖时,这可能有助于降低直流酵母细胞岁水平。此外,低水平的氧化蛋白(CP)和直流AKG-supplemented细胞在晚天的培养可能是由于增加的抗氧化潜力这些细胞在培养早期,而控制细胞。与我们的数据协议,增加超氧化物生成被发现作为一个信号在年轻秀丽隐杆线虫动物引发的基因表达变化阻止或减弱的影响后续老化(37]。因此,我们可以假设AKG-induced轻度氧化应激在指数增长的细胞可能会导致自适应感应的防御机制。这种适应性反应可以提供足够的保护任何后续强氧化或其他压力,防止自由基损伤的增加与年龄相关的生物分子,从而更好的在长期培养酵母生存能力。

5。结论

我们的结果表明,栽培AKG-supplemented媒介修改在酵母代谢过程酿酒酵母岁的生殖潜力,防止损失的文化。爱科技的主要代谢影响包括总蛋白质含量的增加和储备碳水化合物、糖原和海藻糖,以及增强抗氧化防御与随后的减少氧化损伤蛋白在酵母细胞。这些变化应该有助于更好的生存AKG-supplemented细胞长期培养下不肥沃的媒介。因此,我们的研究结果扩展知识爱科技发现之前在动物和延缓衰老的影响表明,爱科技也可能是有益的在细胞水平上通过增加补充抗氧化应激和维护细胞的增殖潜力。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢y Inoue博士提供酿酒酵母应变,感谢学生l . Izerska和Kh。Hryshuk技术援助。奥尔加。Kubrak博士他们表达诚挚的感谢(斯德哥尔摩大学)英语文章的校正。

引用

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