文摘

甲基7 7′-dimethoxy-5′- (morpholinomethyl) [4, 4′-bibenzo [d] [1,3] dioxole] 5-carboxylate显示(IMM)是一种创新药物治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)由于其高疗效、低毒性。在这项研究中,五个小杂质(I, II, III, IV, V)被确定和分析使用光谱证据,化学合成方法,液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)。杂质包括玉米胚芽蛋白酶解物和氧化副产品中提取的药物在其最终配方和合成。毒性预测显示潜在的致癌性的杂质V包含N-oxygen片段。可靠和选择性高效液相色谱定量分析方法的杂质I-IV和敏感HPLC-MS潜在基因毒性杂质V / MS方法开发和优化。方法验证基于国际协调委员会的指导方针。获得了满意的线性分析物在0.1到-2.0之间μg / mL杂质I-IV和0.3 - -30.0 ng / mL杂质V,在所有情况下,拟合相关系数超过0.999。获得的探测值的极限是0.05 ng / mL, 0.005μ杂质V和杂质I-IV g / mL,分别。的精度和可重复性的方法是为每个杂质小于1.08%和8.72%。所有杂质的复苏的百分比在91.18% - -111.27%的范围,相对标准偏差小于3.69%。绿色评估的高效液相色谱法和HPLC-MS / MS法进行评估通过使用软件同意得分值为0.72和0.68,分别。推荐程序,准确、具体,和环保应用到现有的IMM活性药物成分,产生令人满意的结果。

1。介绍

非酒精性脂肪肝病(NAFLD),在1980年发现(1,2),是一种常见的慢性肝病,其特征是肝脏中脂肪的积累。在亚洲的非酒精性脂肪肝的患病率是29.62%在1999年到2019年之间,和流行病学数据显示,非酒精性脂肪肝的患病率急剧上升由于快速城市化和全球肥胖症3,4]。然而,目前还没有批准的药物治疗非酒精性脂肪肝的第二阶段和第三阶段临床试验由美国食品和药物管理局,欧洲药品局和国家医疗产品管理局(5]。双环醇是一种抵押品phenyl-structured药物广泛应用于治疗慢性肝炎,自2004年以来,中国已批准(6]。然而,由于穷人双环醇溶解度和生物利用度的,双环醇的结构优化是在我们集团的先前的研究。特别是甲基7 7′-dimethoxy-5′- (morpholinomethyl) [4, 4′-bibenzo [d] [1,3] dioxole] 5-carboxylate显示,简称IMM,被我们的研究小组(形成的成功7,8](其光谱数据显示在补充材料S1)。临床前研究表明,IMM,二环吗啉甲磺酸双环醇,具有更好的药理活性和药代动力学性质比双环醇肝脏方面的保护,因此拥有更大的潜力为未来有用的药物治疗非酒精性脂肪肝。此外,作为显示药物的残留甲基乙基磺酸甲酯和显示低于控制限度[9]。IMM目前在第一阶段临床试验。

在初步研究中,我们发现四个杂质(I-IV) IMM活性药物成分的合成(API)。此外,在强氧化条件下的强制降解试验,一个未知杂质超过识别限制被发现和命名杂质诉通过高效液相chromatography-ultraviolet光谱(HPLC-UV)和液体chromatography-tandem质谱(HPLC-MS / MS),我们进一步分析每个杂质的内容和可能的结构。杂质的化学结构,III, IV, V被确定通过合成和孤立。杂质形成的可能的路径图所示1。


图1
合成杂质电流-电压的过程。

通过设计的关键质量属性提出了质量是药品质量的措施(10- - - - - -16],特别是相关物质的调查[17,18]。杂质的存在,即使在少量,可以影响药物的安全性和有效性。药物分析的最重要的因素是新型治疗性化合物的稳定性和杂质概况(19),符合绿色的和技术分析也必须始终考虑和使用20.]。因此,有必要开发敏感、准确、有效和经济的方法的可靠估计IMM的杂质。在五个杂质前面所提到的,杂质V是氮氧化物,并有很强的亲电性。因此,杂质V控制低于阈值的毒理学问题(TTC)安全管理水平的药物临床引用为1.5μ长期治疗(克/天21]。考虑到最大程度上的每日剂量(50毫克),估计允许的杂质水平V药物IMM设置为30 ppm。

依照这些杂质的限制要求,准确、具体,方便建立了确定杂质I-IV,高效液相色谱法(HPLC)和高度敏感和可靠的HPLC-MS / MS方法是成功开发分析杂质V 30 ppm水平由于紫外检测器的灵敏度较低。按照我提出的方法验证指南(22- - - - - -26),绿色评估两种方法评估了使用同意软件(27,28]。拟议的高效液相色谱法和HPLC-MS / MS法代表有利的协议在药品生产质量控制和过程监控。研究结果可以提供可靠的技术参考和科学依据的安全长期临床应用这种产品。

2。材料和方法

2.1。材料、化学物质和试剂

IMM物质(批处理号。20211001、20211101和20220622)和杂质和杂质III-V生产在作者的实验室。杂质二世(纯度99.64%)是由北京联合制药厂(中国,北京)。乙腈(ACN),三乙胺(茶)和质级甲醇(甲醇)从innoChem购买科技有限公司有限公司(中国,北京)。质等级甲酸(FA)是获得从霍尼韦尔(美国MI马斯基根)。甲酸铵和过氧化氢(H2O2)购买化学试剂国药控股有限公司有限公司(中国,北京)。超纯水收购从Milli-Q净水系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。使用的蒸馏水是娃哈哈纯净水。

2.2。条件的确定杂质I-IV(高效液相色谱法)

高效液相色谱分析进行热终极U3000液相色谱仪配备了爸爸检测器(热费希尔科学有限公司)。IMM的液相色谱分离和杂质I-IV执行使用ODS C18列(4.6毫米×250毫米,粒子大小5μ米)维持在35°C。乙腈(ACN)被选为流动相,和移动阶段B是一个混合的0.1% (v / v)甲酸与三乙胺(pH值调整到4.0)和ACN的固定比例70:30 (v / v)。下面的梯度是用于一个40分钟的序列:流动相的比例B举行15分钟为100%,从100%降低到70%的15至30分钟,然后保持在70% 30到40分钟。流率保持在0.7 mL / min,注射量是20μL,紫外线(UV)检测在230海里。

混合溶剂乙腈和水混合的比例70:30 (v / v)。IMM的样品溶液制备在0.5毫克/毫升在混合溶剂。混合标准溶液的杂质I-IV准备为0.5μ克/毫升。标准混合物的浓度和示例解决方案进行优化,以达到期望的信噪比(S / N)和最优峰值形状。所有样品和标准的解决方案是透过0.45μm膜过滤器之前分析。

2.3。条件的确定杂质V (HPLC-MS / MS方法)

测定杂质V进行了使用安捷伦1290∞2高效液相色谱系统和6495 triple-quadrupole串联质谱仪(安捷伦科技公司,圣克拉拉,CA,美国)配备一个电喷雾电离(ESI)装置。一个Inertsil ODS-3列(3毫米×150毫米,粒度的3μ米)在35°C分离操作。流动相的混合2.5更易与L甲酸铵水溶液,含有0.05%甲酸(流动相)和甲醇(流动相B)的固定比例72:28 (v / v)在0.4毫升/分钟的流量。注射量设置为5μL .积极的应急服务国际公司分析如下的参数:干燥气体流量的11.0 L / min,喷雾器25 psi的压力,气体温度150°C,喷雾3000 V的电压。量化进行了使用多反应监测(mrm)模式。MS / MS过渡和毛细管电压(CE)条件如下:476.1⟶373.2 (米/z)(CE: 10 eV)杂质460.1 V和⟶341 (米/z为IMM) (CE: 20 eV)。

股票的杂质标准V准备50浓度μ克/毫升的甲醇。随后,一个标准的解决方案是在3 ng / mL稀释股票获得的标准以30%甲醇水溶液。IMM的样品溶液是刚做好的在0.1毫克/毫升。首先,大约20毫克的IMM准确称重,转移到100毫升容量瓶,加入75毫升30%的甲醇水溶液。接下来,解决方案是涡1 h,直到样品完全溶解,然后用30%甲醇水溶液稀释至100毫升。

2.4。验证的高效液相色谱方法

验证该方法的杂质电流-电压进行量化的标准的基础上我Q2和ICH Q3A,包括特异性、检测极限(LOD),量化的限制(定量限)、线性、准确性、精度和稳定性。

2.4.1。特异性

特异性的高效液相色谱方法评估使用强制降解研究样品溶液(0.5毫克/毫升)通过评估是否空白解决方案和其他降解杂质影响主峰与杂质。在峰纯度测试中,采用二极管阵列检测器(爸爸)和峰值同质性进行了分析。强制降解研究以下五个条件下进行:(1)酸水解。10毫克的IMM重,转移到20毫升容量瓶,添加到10毫升盐酸混合溶剂和2.0毫升的1.0米,并存储为24小时60°C。随后,氢氧化钠溶液中和了1.0米,然后用混合溶剂稀释至20毫升。(2)基本的水解。10毫克的IMM重,转移到20毫升容量瓶,添加到10毫升的混合溶剂和2.0毫升的1.0 M氢氧化钠和存储24小时60°C。随后,HCl溶液中和了1.0米,然后用混合溶剂稀释至20毫升。(3)氧化降解。10毫克的IMM准确称重和转移到20毫升容量瓶,然后添加到10毫升的混合溶剂和1.0毫升的30% H2O2,储存在60°C 24 h。随后,该解决方案与混合溶剂稀释至20毫升。(4)热降解。10毫克的IMM被转移到20毫升容量瓶和暴露在60°C的烤箱烘焙30天。随后,10毫升的混合溶剂添加的,解决办法是稀释20毫升达到0.5毫克/毫升的IMM的浓度。(5)光降解。10毫克的IMM被转移到20毫升容量瓶、光照4500 Lx±500 Lx 30天。样本水平定位提供最大的接触面积光源。

2.4.2。系统适用性

系统适用性评估通过注入混合解决方案包含IMM(0.5毫克/毫升)和杂质(0.5μg / mL)。山峰之间的分辨率IMM,杂质不应小于3。

2.4.3。线性

包含杂质的浓度校准情节准备用七I-IV在0.1到-2.0之间μg / mL建立线性。色谱图的峰面积与各自的浓度绘制杂质得到曲线,并计算回归线是使用最小二乘的方法执行。截距、斜率和相关系数计算使用线性回归。至少三个测量每个样品进行。

2.4.4。LOD和定量限

杂质的定量限和钟表I-IV评估通过确定的S / N比10:1和3:1,分别。使用最小的值进行了溶液浓度(0.1μg / mL)在线性,解决方案和混合溶剂逐步稀释。稀释的解决方案分别注入色谱仪。

2.4.5。精度

的准确性评估通过高效液相色谱法(HPLC)飙升复苏实验通过使用三个浓度水平,结果被表示为比例的平均回收率和相对标准偏差(RSD %)为每个浓度水平。样本IMM的解决方案(0.5毫克/毫升)测试包含四个杂质在低浓度(50%)、中等(100%),高(150%)水平的准备和分析(n= 3,每级)。经济复苏是由实际的百分比计算浓度和理论浓度通过使用一个外部的标准方法。

2.4.6。精度和稳定性

精度是决定使用标准的混合解决方案(n= 6)包含4个杂质浓度为0.5μ克/毫升。重复性是评估样品溶液的IMM(0.5毫克/毫升)混合加入已知浓度的标准溶液(0.5μg / mL), 6个并行解决方案准备获得重复性。解决方案建立了稳定分析的解决方案在不同的时间间隔(0、2、4、8、12、24 h)在室温下。结果总结了通过计算RSD %值。

2.5。HPLC-MS / MS方法的验证

拟议中的HPLC-MS / MS方法验证特异性而言,线性,精度、准确性和稳定性。特异性是由注射空白,混合溶液的IMM和杂质V (3 ng / mL),和解决方案包含单个杂质V 3 ng / mL的浓度和IMM浓度为0.1毫克/毫升。IMM的混合溶液和杂质V (3 ng / mL)也被用作系统适用性的解决方案。校准图准备通过分析七个标准解决方案的杂质浓度范围的V 0.3 - -24.0 ng / mL建立线性。然后,0.3 ng / mL的解决办法是逐步稀释30%甲醇水溶液,和和LOD被定义为定量限浓度,可以检测并能产生S / N比率10:1和3:1,分别。验证过程的精度和可重复性与高效液相色谱方法是一致的。精密测定使用的标准溶液杂质V 3 ng / mL的浓度(n= 6)。确定该方法的重复性与样品溶液(0.1毫克/毫升)的IMM,和六个并行解决方案准备。解决方案的稳定性在重复性室温下在不同的时间点观察。结果总结了通过计算RSD %值。方法的准确性取决于执行飙升复苏实验使用三个浓度水平。样本IMM的解决方案(0.1毫克/毫升)V测试包含杂质浓度较低(50%),中等(100%),高(150%)水平的准备和分析(n= 3,每级)。复苏的计算是通过比较实际和理论浓度。

2.6。隔离和杂质的合成
2.6.1。合成的7′-Dimethoxy-5′- (Morpholinomethyl) [4, 4′-Bibenzo [d] [1,3] Dioxole] 5-carboxylic酸(杂质)

IMM的混合物(300毫克,0.654更易)和氢氧化钠(261毫克,6.54更易)四氢呋喃(10毫升)加入1毫升的水。反应混合物在室温下搅拌8 h,其次是盐酸(1米)的添加最后一个pH值为7.0。然后,反应溶液过滤,滤饼是我作为一个获得杂质用水洗白色固体在64%的收益率。HPLC-purity是96.78%。1H核磁共振,13C NMR, HR-ESI-MS光谱数据和色谱纯度分析的补充材料所示S2和S3。

2.6.2。合成甲基7日7′-Dimethoxy-5′- (Methoxymethyl) [4, 4′-Bibenzo [d] [1,3] Dioxole] 5-carboxylate(杂质III)

杂质二世(400毫克,1.0更易)甲醇(10毫升)搅拌,和甲磺酸溶液(0.1毫升)补充道。反应混合物搅拌,回流2 h反应完全。反应混合物冷却后,集中在真空给残留物,溶解在二氯甲烷(20毫升)和饱和NaHCO洗3解决方案。合并后的有机相在无水干Na2所以4下,过滤,蒸发真空获得杂质三世白色固体在75%的收益率。HPLC-purity是99.18%。1H核磁共振,13C NMR, HR-ESI-MS光谱数据和色谱纯度分析的补充材料所示S6和S7。

2.6.3。合成4,10-Dimethoxy - [1,3] Dioxolo(4′, 5′: 3、4]苯并[1,2 - c] [1,3] Dioxolo(4′, 5′: 5、6]苯并[1,双电子]Oxepin-6(8小时)——(杂质(四)

杂质二世(400毫克,1.0更易)四氢呋喃(10毫升)搅拌,和盐酸溶液(0.1毫升,1 M)补充道。混合物在室温下搅拌2 h。之后,反应混合物集中在真空给残留物,溶解在二氯甲烷(20毫升)和饱和NaHCO洗3解决方案。合并后的有机相在无水干Na2所以4下,过滤,蒸发真空产生杂质IV白色固体在75%的收益率。HPLC-purity是99.66%。1H核磁共振,13C NMR, HR-ESI-MS光谱数据和色谱纯度分析的补充材料所示S8和S9。

2.6.4。隔离4 - ((7′-Dimethoxy-5′- (Methoxycarbonyl) [4, 4′-Bibenzo [d] [1,3] Dioxol] 5-yl)甲基)吗啉4-Oxide(杂质V)

IMM(5克,9.0更易)溶解在30% H2O2(25毫升)和存储60°C为20天。之后,二氯甲烷(60毫升)和水(25毫升)被添加并提取两次,和有机层是在无水钠饱和生理盐水清洗和干燥2所以4。然后,结合有机相受到硅胶(300 - 400目,20 g)柱层析法与二氯甲烷/甲醇(30:1)作为洗脱液产生白色固体(100毫克)。固体被进一步纯化制备薄层色谱法与二氯甲烷/甲醇(20:1)作为洗脱液获得杂质V在1.4%的收益率。HPLC-purity是95.63%。1H核磁共振,13C NMR, HR-ESI-MS光谱数据和色谱纯度分析的补充材料所示S10和S11。

2.7。计算毒理学的杂质V

在线ADMETlab 2.0 [29日],preADMET [30.,31日],pKCSM [32)计算机程序被用于毒性预测艾姆斯测试和评估潜在的致瘤的杂质诉化学结构的影响与微笑的语言描述。此外,Toxtree软件来预测毒性与结构报警功能组。

2.8。绿色评估拟议的方法

同意软件被用于评估拟议的高效液相色谱方法以及绿色HPLC-MS / MS方法。

3所示。结果与讨论

3.1。探测和识别的杂质

如图2(一个)(我),四个不显眼的杂质峰出现在保留时间(Rt) 6.087 (i), 27.380(2), 37.147(3),和32.797分钟(IV),除了IMM (Rt = 14.153分钟),在高效液相色谱分析方法,粗糙的物质。澄清这些杂质,我们提出并合成了几种可能的副产品IMM的预期在合成反应。Rt值四个杂质的高效液相色谱法进行了比较与反应物IMM的准备。比较分析显示,我IMM的水解产物杂质,杂质二世从起始物料(双环醇),杂质III(双环醇甲醚)是由双环醇与甲醇在酸性条件下,和杂质IV(双环醇内酯)是一个副产品由去除甲醇分子内的双环醇的一部分。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
高效液相色谱色谱IMM及其杂质:(a) (i) IMM原油物质(0.5毫克/毫升)和(2)空白;(b)氧化降解的IMM (30% H2O2)。

此外,我们发现IMM接触氧化降解后产生一个明显的杂质,如图2 (b),最高的内容达到了10.42%。它被命名为杂质诉HPLC-UV HPLC-ESI-MS阐明结构的分析和识别质量的杂质诉紫外光谱(λ马克斯231.21 nm)的杂质HPLC-UV V是类似于IMM (λ马克斯229.90 nm),表明二苯骷髅的存在杂质HPLC-ESI-MS诉在正离子模式下,杂质V和IMM显示他们的离子峰米/z476.1 [M + H]+和米/z460.1 [M + H]+(图316),表明分子量的差异之间的两个化合物。结合HPLC-ESI-MS数据之间的差异杂质V和IMM,杂质V的结构被认为是氮氧化物IMM的副产品。证实这一假设,高数量的杂质需要V。因此,我们长时间的氧化降解从24小时20天。用二氯甲烷和水反应混合物提取,然后采用硅胶柱层析法纯化产量与纯度增加杂质V(高效液相色谱法分析95%以上)。的1H NMR谱数据进一步揭示了结构杂质V 4 -((7日7′-dimethoxy-5′- (methoxycarbonyl) [4, 4′-bibenzo [d] [1,3] dioxol] 5-yl)甲基)吗啉4-oxide,证实我们的假设,这是过度氧化IMM在合成的副产品。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
(一)IMM HPLC-ESI-MS光谱(米/zV(460.1)和(b)杂质米/z476.1)。
3.2。分析方法开发

在这项研究中,分离IMM及其杂质是至关重要的考虑到他们的结构和极性相似之处。在初步的工作中,C8和C18静止阶段用于方法开发,与不同的pH值和各种移动阶段,不同比例的acetonitrile-buffer和methanol-buffer等解决方案,进行了测试。相对满意的结果在对称和分辨率观察ODS C18列用acn - 0.1% (v / v)甲酸与三乙胺(pH值调整到4.0)。权力平等主义的洗脱方式采用在研究的开始;然而,分离杂质我和50%乙腈和IMM才有效,运行时间超过80分钟30%乙腈。因此,梯度洗脱模式确定更合适的。有机相的比例从30%上升到50% 15至30分钟前进的Rt值后杂质IMM的巅峰。此外,杂质的最大吸收波长电流-电压是220,228,227,244,230纳米(图4),分别。因此,230海里被选为测定波长来提高方法的灵敏度。


图4
紫外光谱的杂质电流-电压。

5中杂质,杂质V包含结构提醒功能组要求额外的审查,允许水平,估计被设定为30 ppm。然而,上述高效液相色谱方法不能满足要求的检测和量化杂质V 30-ppm层面由于紫外检测器的灵敏度较低。在这项研究中,我们利用高效液相色谱法加上triple-quadrupole质谱量化这个杂质。

通过多个静止和移动的探索阶段,良好的峰分离是实现Inertsil ODS-3列(150毫米×3.0毫米和粒度的3μ米)通过使用甲醇,2.5 L更易与甲酸铵的混合物和0.05%甲酸溶液以恒定的比例28:72 (v / v)为流动相。列温度控制在33°C-37°C,和注射量是5μ460.1 l .具体定量离子⟶341 (米/zIMM)和476.1⟶373.2 (米/zV)杂质被用于定性和定量分析按照化学结构和分裂女士分解;的产品离子光谱[M + H]+从IMM离子和杂质V在正离子模式下获得补充材料所示S12和向。女士分化途径如表所示1。使用分析软件女士的参数进行了优化。此外,为了保护ESI源,流动相及其洗脱液变成了浪费IMM洗脱的时间范围。

表1
IMM女士片段通路和定量离子和杂质V。

提取杂质V使用甲醇和水的混合物从IMM 30的比例:70年,超声和振动治疗应用;选择后者,因为它是更少的有害的样本。我们发现不平等的杂质V IMM,认定IMM的每个部分应该彻底搅拌均匀。我们使用重复性化验检查提取是否可以满意地复制;在下一节中描述的结果。

3.3。方法验证

验证所提出的方法量化杂质的电流-电压进行标准的基础上我Q2, ICH Q3A,镜像特异性的引用标准,检测和量化限制,线性、准确性、精度和稳定性。验证实验的结果总结表2。

表2
拟议的方法验证报告的摘要。
3.3.1。特异性

的特异性方法是评估通过注射空白和IMM与单个杂质。相应的色谱图在最佳条件下所示的数字2和5。高效液相色谱色谱表明,开发方法可以成功地分离每个杂质(I-IV),从主药。HPLC-MS /女士色谱表明,IMM的峰值是到目前为止的杂质V是完全隔绝的浪费和不影响杂质的检测V .此外,没有发现干扰峰在空白的解决方案中,提取离子色谱图显示的前体和碎片离子杂质V (米/z476.1⟶373.2)。


图5
典型的MRM色谱显示IMM(一)混合解决方案并杂质V (3 ng / mL)。典型的MRM色谱图显示(b) IMM样品溶液(0.1毫克/毫升)。(c)标准溶液的杂质V (3 ng / mL)。(d)空白。
3.3.2。系统适用性

山峰之间的分辨率IMM和不洁我是用来评估系统适用性的高效液相色谱方法,杂质色谱表明,峰值以来我最接近主峰,结果大于10。同样,该决议杂质峰之间的V和IMM大于10。系统适用性准确分析的两种方法是适当的杂质。

特异性的高效液相色谱方法的评估显示,杂质我大大增加碱降解氢氧化钠(1米60°C),以减少7.14%的IMM药物浓度。与此同时,杂质V急剧上升到10.42%在强烈的氧化降解。这种新药IMM其他压力条件下相对稳定,如表中列出3。在所有强制条件,所有杂质峰的纯度验证证明没有干扰物质的保留时间。

表3
比例的IMM不同压力条件下的降解。
3.3.3。灵敏度

钟表和定量限的杂质被注入稀释估计解决方案与已知浓度的S / N比率3:1和10:1,分别。杂质I-IV的钟表和定量限分别为0.005和0.01μ分别g / mL。杂质V, LOD和定量限的值分别为0.05和0.17 ng / mL,分别相当于0.05和0.17 ppm,分别。这些值是足够的具体分析和定量限低表明,方法具有高灵敏度方法是令人满意的。

3.3.4。线性

7点线性评估每个杂质的浓度水平。线性范围是0.10 - -2.03μ杂质I-IV g / mL,杂质V的线性范围是0.34 - -27.31 ng / mL由于其高检测极限浓度要求。斜率、截距和回归系数计算使用最小二乘线性回归分析,如表所示2。方法显示线性校准范围内所有的杂质,相关系数分别为0.9999,0.9999,0.9998,0.9999,0.9999,杂质电流-电压,分别。

3.3.5。精度

准确性是评价通过飙升复苏实验。真实的杂质被上升到三个示例解决方案使用浓度为50%,100%,150%。三个决定为每个级别执行。恢复的数据的计算是通过比较实验和理论价值。复苏的91.18% -111.27%,RSD值低于3.69%实现了所有的杂质,和详细的数据如表所示2。

3.3.6。精度和稳定性

的精度和可重复性结果表示为RSD %和展示在表2。结果很低的可变性,RSD %值是小于1.08%,精度为5.22%,重复性的定量测定杂质I-IV。对于杂质V, RSD %值的精度和可重复性是0.36%和8.72%,分别指示精度高的开发方法。建立了稳定的标准和样品的解决方案通过分析在不同的时间间隔在24 h。RSD值在24 h所有杂质都不到4.04%。结果总结表2展示我们杂质量化方法的可靠性。

3.4。毒性的预测研究杂质V

杂质V的潜在肿瘤发生的影响进一步评估使用ADMET 2.0, preADMET, pkCSM计算机程序可用的在线和通过Toxtree软件。预测结果显示潜在的致癌性(nongenotoxicity)利用ADMET杂质V 2.0, preADMET, Toxtree软件。然而,pkCSM程序预测没有致癌性。虽然杂质V结构提醒官能团(N-oxide)没有诱变的风险预测的软件,还有基因突变的潜在风险,或在哺乳动物细胞系统重组NDA变化,考虑到IMM需要长期管理和氮氧化物一半是高度亲电子(33,34]。确保新的药物临床使用的安全性,杂质V仍低于“TTC”控制的水平。

3.5。样品分析

验证方法应用于测量IMM API的杂质在三个批次样品。杂质I-IV被量化的内容与外部标准方法通过计算峰面积;表中列出的结果4。所有的杂质都低于可接受范围定义,表明建立的条件下都是好控制。

表4
样品中的杂质IMM API。
3.6。绿色评估拟议的方法

提出的绿色评估方法评估了使用同意软件,和同意象形图评分值的0.72和0.68图所示6。HPLC-MS / MS方法比高效液相色谱方法,消耗更多的能量,因为它需要HPLC-MS级溶剂和N2大量的高纯度。结果表明,这两种方法都是环保和经济的高分数,虽然甲醇,乙腈,盐酸、氢氧化钠、H2O2有一定毒性,应该定期治疗,以防止任何潜在的不安全暴露于环境。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
绿色评估拟议的方法根据同意工具:(a)高效液相色谱法和(b) HPLC-MS / MS法。

4所示。结论

五IMM微量杂质,一个创新的大部分药物治疗非酒精性脂肪肝,是识别和分析了应用HPLC-MS / MS技术与光谱和经典的合成方法。在这些杂质,杂质V属于氮氧化物与强大的亲电性,和毒性预测研究中,使用不同的软件,提出了一个潜在的致癌性的杂质。按照我的指导方针,一个可靠的高效液相色谱法和敏感HPLC-MS / MS法开发和优化的定量分析五个微量杂质IMM api。从方法论的角度来讲,这些方法被证明是具体,精确、准确,线性浓度范围内评估。验证和绿色评估证明提出的方法具体,准确、敏感、环保、绿色、经济的分析。因此,他们可以应用在制药生产过程监测杂质。定量测定杂质的几个批次的IMM api透露这些方法的高效即使在低浓度水平,验证此方法在临床治疗药物安全评价的。我们系统的研究涉及的识别和确定杂质进一步科学研究提供了一个依据IMM api和持续发展奠定了基础的杂质检测方法应用于小说具有相似结构的药物发现过程。本研究有助于IMM活性药物成分的定量评价,提供了一个科学依据的有效发展创新药物治疗非酒精性脂肪肝。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和文件的补充信息。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

可是邵和冯京同样导致了这项工作。

确认

这项研究是由凸轮为医学科学(CIFMS没有创新基金。2021 - 12 - 030 - 1)。

补充材料

额外的支持数据收集补充材料文件,包括IMM的光谱数据和杂质,产物离子光谱[M + H]+从IMM离子和杂质V,高效液相色谱色谱I-IV, MRM V API样品的色谱图。(补充Materials20230730-version)