开发的简单分析方法用于b族维生素的营养产品:酶消化和UPLC-MS /量化女士

文摘

7同时测定的方法用于b维生素包括硫胺素、核黄素、烟酸、烟酰胺,吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺营养产品通过使用酶消化后质/ MS量化进行了研究。质/ MS条件如女士转换、流动相程序,和甲酸铵缓冲的浓度,和样品处理过程(如缓冲溶液的浓度、消化温度,和消化时间)。分析方法的性能是由多个评估标准如选择性、线性、检测和量化限制,可重复性,再现性,和恢复使用真正的样本矩阵。验证方法已成功应用于分析维生素B的浓度在不同的营养产品,如ultra-heat-treated牛奶、奶粉、营养粉。维生素B的浓度变化范围从低于检测大约9000的极限µg / 100 g,这取决于维生素组,复合形式,和样本类型。测量浓度用于b族维生素的样本通常是在良好的协议与价值观的标签要求。

1。介绍

用于b族维生素组成八种水溶性维生素(即。,vitamin B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, and B12) and one type can exist in different forms, also called vitamers [1]。维生素、特别是用于b族维生素是必不可少的对于维护各种人类的身体功能,和维生素缺乏可能导致不良的健康影响1,2]。因为食物是最重要的维他命的来源,营养均衡的饮食可以消除缺陷(1- - - - - -3]。然而,维生素过量的负面影响也被指出[4]。世界卫生组织推荐表量维生素在人体营养2]。可靠和有效的开发方法同时测定多种维生素类型和形式的食品和营养产品需要描述的发生这样的营养食品和监管机构提供有用的信息,厂商和消费者(5,6]。

为了从食物中提取用于b族维生素矩阵,应用几种提取和纯化方法,例如,与C18固相萃取(SPE)吸附剂(7,8),色散SPE与分子印迹生物聚合物(9)、治疗与沉淀试剂(5,10),并与乙腈萃取(6,11]。每种方法都有自己的优点和局限性。从绿色化学的角度来看,使用的有机溶剂(6,11),重金属盐(5),和潜在的有毒化学物质三氯乙酸(10应该避免。此外,强酸水解可能负责的一些杂质,干扰色谱信号的一些用于b族维生素(5]。应用酶消化从复杂的食品矩阵中提取用于b族维生素富含蛋白质和碳水化合物已经被各种研究报告(12,13]。至于仪器分析用于b维生素、液相色谱与质谱检测(特别是超高效液相chromatography-tandem质谱UPLC-MS / MS)已经成为标准方法由于其出色的特异性,灵敏度和效率(12- - - - - -14]。

在目前的研究中,四种类型与七形式用于b族维生素的检查,包括维生素B1(硫胺素)B2(核黄素),B3(烟酰胺和烟酸)和B6(吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺)。我们专注于三个营养产品,如ultra-heat-treated牛奶,奶粉,营养粉,通常富含微量元素包括用于b族维生素。样本被一个简单的和“绿色”提取方法,它利用酶消化不使用有机溶剂和重金属盐。分析方法(即性能。,UPLC-MS/MS with isotope dilution/internal standard quantification) was strictly validated, showing adequate specificity and accuracy. Concentrations of individual vitamers over a wide range (fromµg毫克/ 100克)营养产品报告全面洞察他们的总水平,概要文件和营养食品标签的有效性。据我们所知,这是第一个研究调查的发生多个用于b维生素营养产品在越南以及东南亚。

2。材料和方法

2.1。标准和试剂

分析标准包括盐酸硫胺素(THI),核黄素(肋骨),烟酰胺(NIC),烟酸(NIA)、盐酸吡哆醇(PYN),盐酸吡哆醛(所有),和吡哆胺盐酸盐(宾),和其他化学药品和试剂(如甲酸铵、甲酸、甲醇,酸性磷酸酶,木瓜蛋白酶,和 - - - - - -淀粉酶)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。Isotope-labelled内部标准(¹³C₄这,¹³C₄¹⁵N₂肋骨,²H₄网卡,²H₄nia,¹³C₄-PYN,²H₃所有,²H₃宾)获得IsoSciences(美国宾夕法尼亚州Ambler)。重蒸馏的去离子水被用来准备缓冲和标准的解决方案。酶混合解决方案,包括200±10毫克的酸性磷酸酶,80±5毫克 - - - - - -淀粉酶,400±10毫克的木瓜蛋白酶为200毫升的50 mM甲酸铵溶液和调整与甲酸pH值4.0 - -4.5。本机混合工作标准(多工作站系统)和内部标准混合物(ISSM)准备在50 mM甲酸铵溶液。工作标准的解决方案(WS1 WS7)准备在个人天然化合物的浓度从0.20到1200 ng / mL和内部标准浓度从0.20到20 ng / mL。

2.2。仪表和优化的质/ MS条件

在这项研究中,液相色谱仪(ACQUITY UPLC h级;水)配备一个串联质谱仪(Xevo TQD;水域)和一个ACQUITY UPLC本·C18柱(100毫米×2.1毫米×1.7μ米,130;使用水)。基本参数的质/ MS系统研究总结在表1。

基于基本参数表所示1与流动相的20毫米甲酸铵溶液称为采用AOAC公认的正式方法2015.14 [14随后,我们进行了三个实验确定如下:(1)转换目标化合物的女士和内部标准;(2)流动相程序对保留时间的影响和分离效率;和(3)甲酸铵浓度的影响分析物信号强度的流动相。女士过渡参数(例如,定量和定性离子,锥电压,和碰撞能量)是自动优化。流动相的不同项目进行调查,其中包括一个权力平等主义的程序和三个梯度程序(表2)。甲酸铵的浓度优化范围从5到50毫米。

2.3。样品制备过程的优化

样品制备过程进行优化实验通过使用营养粉样品。提取条件显示最高恢复大量的维生素在本例中选择。我们调查的影响(1)浓度的甲酸铵的5到100毫米,(2)消化温度在35到50°C,和(3)消化时间的3 - 16 h,对萃取效率7维生素。营养粉样品(10±0.3 g)重组在蒸馏水(总重量100±2 g)通过使用电磁搅拌器。1 g的整除重组样本被转移到一个50毫升管,与内部标准(100年飙升µL ISSM标准)和5毫升的酶鸡尾酒的解决方案,通过使用一个旋涡混合器和混合。样品管在一个恒温培养瓶过夜。提取被转移到一个25 mL容量瓶,25毫升了50 mM甲酸铵溶液,并透过0.2µ聚四氟乙烯膜质/ MS分析之前。

2.4。方法验证

的特异性、选择性和线性量化七人被证实根据标准提出的采用AOAC公认的国际(14)和欧洲经济共同体委员会决定2002/657 / EC (15]。基于优化的过程中,额外的营养产品样品进行了分析评价方法的性能。三种类型的样本矩阵进行包括ultra-heat-treated (UHT)牛奶、奶粉、营养粉。对于每个样本类型,可重复性(天复制实际样品的分析,n= 6)、再现性(天之间复制实际样品的分析,n= 4)方法检测和量化的限制(复制低浓度样品的分析,n= 10),和恢复(matrix-spiked样本的复制分析三个水平激增,n每个级别= 3)进行评估。我们的方法的准确性也证实了方法开发和婴儿配方奶粉样品的分析结果采用AOAC公认的多个实验室的研究(2018年)和雀巢的内部测试(在2019年和2020年)。

2.5。应用程序验证方法的营养产品

验证分析方法应用于确定7用于b维生素浓度在不同的营养产品,包括UHT牛奶(n= 5)、奶粉(n= 5)和营养粉(n= 5)样本。所有获得的样本随机从几个经销商和杂货在河内,越南,2019年和2020年之间。

3所示。结果与讨论

3.1。MS / MS条件

MS / MS条件包括质量转换,锥电压,和碰撞能量的七人,各自的内部标准自动优化结果如表所示3。目标化合物的质量转换在我们的研究是在良好的协议与采用AOAC公认的官方报告的方法2015.14 [14]。对于每一个化合物,一个定量离子(产品离子)和两个定性离子(前体离子和一个产品离子)。这个方案是按照性能标准委员会提出的质/女士决定2002/657 / EC,显示4识别点(15]。MS / MS条件列在下表中1和3被用于下一个实验。

3.2。信用证条件

3.2.1之上。流动相的程序

与流动相一个20毫米甲酸铵溶液和移动阶段B作为甲醇,我们分析了工作标准WS5(个体浓度从6到600 ng / mL)在四个项目列入表中2。目标化合物的保留时间如表所示4和色谱图呈现在图S1补充数据。在权力平等主义的程序中,所有的人都在2.5分钟,筛选了一些化合物几乎coeluted(例如,网卡,所有供试PYN)。此外,山峰的本地NIA的内部标准和宾和平衡(即不锋利。尾矿的峰值)。一个合适的梯度程序是必要的。程序梯度1和2给尾矿山峰NIA和宾。程序梯度3被选中,因为它提供了好看,夏普,和平衡的山峰的化合物。

3.2.2。甲酸铵浓度流动相的影响

的流动相浓度的甲酸铵的5、10、20、50毫米是调查。信号强度的7人工作标准WS5呈现在图1。一般来说,随着盐浓度下降的信号。强度没有显著不同的盐浓度从5 - 20毫米,远高于那些来自50 mM。盐浓度的5毫米,信号的肋骨,宾,所有不平衡与肩或尾矿峰值。因此,我们选择流动相为10毫米甲酸铵溶液。一些其他的研究使用20毫米甲酸铵(14,16),但10毫米的浓度也应用在其他地方(17]。最后,移动阶段(10毫米甲酸铵)和B(甲醇)用于程序梯度3(表2)。总运行时间10分钟。

3.3。样品制备过程

3.3.1。甲酸铵浓度的影响

测试样品(约1 g的重组营养粉)与内部标准上升和5毫升的酶消化鸡尾酒在37°C 12 h。然后,消化混合物被转移到25毫升容量的玻璃瓶和稀释浓度的甲酸铵溶液5、10、20、50、100毫米。七人在测试样品的浓度甲酸铵不同解决方案呈现在图2。因此,所有化合物的提取率最高获得50 mM的盐浓度。这个解决方案(即。,50 mM ammonium formate) was also used by the AOAC Official Method 2015.14 [14]。

3.3.2。消化温度的影响

测试样品(约1 g的重组营养粉)与内部标准上升和5毫升的酶消化鸡尾酒的解决方案在12 h在不同的温度下35岁,37岁,40岁,45岁和50°C。然后,消化混合物被转移到25毫升容量的玻璃瓶和50 mM格式铵溶液稀释。七人在测试样品的浓度不同消化温度图所示3。很明显,样品在37°C的所有化合物的浓度最高。从40°C开始,大量的维生素从矩阵随着温度下降中恢复过来。在用于b族维生素、维生素B1 (THI)是相对敏感的高温比别人(如维生素B2和B6) [18]。然而,温度范围调查在这个研究没有超过50°C和仍低于正常水温准备使用公式(例如,大约70°C) (19]。此外,这个浓度没有显著变化在温度从37到50°C (RSD = 7%),表明维生素稳定性不太可能是一个重要的因素。因此,提取效率在很大程度上归因于酶活动,强烈影响的孵化温度。木瓜蛋白酶的最适温度, - - - - - -淀粉酶、酸性磷酸酶和65年,37岁和37°C,分别20.- - - - - -22]。因此,消化温度高于37°C可以抑制酶的活性 - - - - - -淀粉酶、酸性磷酸酶,防止自由维生素的彻底解放。根据优化结果,消化温度37°C被选中。

3.3.3。消化时间的影响

测试样品(约1 g的重组营养粉)与内部标准上升和5毫升的酶消化鸡尾酒的解决方案在不同时期37°C / 3、6、9、12、14、16 h。如图4,从矩阵中提取大量的维生素从3 h 14 h逐渐增加,然后下降16 h消化。大多数化合物的浓度获得12 h和14 h后消化没有显著不同。因此,最佳的消化时间12 h和14 h之间的不同。相比其他样品制备方法(例如,蛋白质沉淀和酸水解),酶消化方法的手术时间是更长的时间12]。在我们的实验室中,样本孵化一夜之间,这有助于节省时间在工作时间。此外,精度最低限度依赖小的变化在附近工作的消化时间信号的峰值/消化时间的关系。

3.3.4。最佳的样品制备过程

在分析之前,样品(即。,UTH milk, powdered milk, and nutritional powder) were homogenized thoroughly. The powdered milk or nutritional powder sample (10 ± 0.3 g) was reconstituted in distilled water (total weight 100 ± 2 g) by using a magnetic stirrer. An aliquot of 1 g UHT milk or reconstituted powder sample was transferred to a 50 mL tube, spiked with internal standards and 5 mL of the enzyme cocktail solution, and mixed by using a vortex mixer. The sample tube was then incubated at 37°C in a thermostatic shaker overnight (about 12 to 14 h). The extract was transferred to a 25 mL volumetric flask, filled up to 25 mL with 50 mM ammonium formate solution, and filtered through a 0.2 µ聚四氟乙烯膜质/ MS分析之前。

3.4。方法验证结果

3.4.1。方法特异性、选择性

如上所述,我们分析方法的特异性和选择性的要求采用AOAC公认的国际(即。证实了,每个复合一个前体离子和两个产品离子)(14)和2002/657 / EC(即欧盟委员会的决定。4识别点)(15]。程序上的空白样品(n= 10)进行了分析与测试和实际样品,没有任何目标化合物的信号。可能从化学物质污染、试剂和实验室器皿和环境被排除在外。结果标准、样品和matrix-spiked样本信号之间还表示好协议(即。、保留时间和质量转换)的化合物从标准和样品。此外,同位素稀释/内标量化方法利用稳定isotope-labelled化合物被证明为最合适的技术质量控制质/女士。一般来说,我们的具体量化方法和选择性测定多个用于b维生素食品矩阵形式。代表色谱维生素和内部标准在每个样本类型如图S2这些化合物,表明不同的和清晰的出现在样本矩阵。

3.4.2。校准曲线

我们准备7工作标准解决方案(WS1 WS7)构造校正曲线对所有目标化合物。浓度范围的七人校准标准如下:THI(2.7 -136),肋骨(11.5 -230),NIC (23 - 1170), NIA (2.4 -120), PYN(3.0 -149),所有供试(0.23 - -11.6),和宾(0.26 - -13.2)ng / mL。工作标准的解决方案准备类似于真正的样品,包括与5毫升的酶消化鸡尾酒的解决方案,在37°C孵化大约12 h,宪法在25毫升的50 mM甲酸铵溶液,通过0.2和过滤µ聚四氟乙烯膜质/ MS分析之前。参数校正曲线的七人展示在表5,包括方程系数的决心,工作范围,和偏见。系数确定的所有化合物都高于0.998各自的工作范围内。偏见(已知浓度的相对误差)对所有化合物小于±8%,符合要求的采用AOAC公认的国际(14]。

3.4.3。方法检测极限,量化限制和量化范围

根据筛选结果,我们选择维生素浓度较低(即实际样品。,个人对所有供试浓度从1.70±0.10,11.9±1.0µg / 100 g网卡)和执行复制分析(n= 10)来确定方法检测极限(MDLs)和量化限制(mql)。MDLs和mql估计的三倍和10倍标准差,分别。如表所示6,MDLs七人从0.28到2.8不等µ对液体样品和从2.8克/ 100克至28日µ克/ 100克粉样品,显示我们的方法的高灵敏度。量化范围跨度超过三个数量级,表明该方法可以申请样品与宽维生素浓度范围(例如,µg毫克/ 100克)。

3.4.4。方法重复性、再现性和恢复

重复性(天复制实际样品的分析,相对标准偏差_r)和再现性(天之间复制实际样品的分析,相对标准偏差_R)我们的方法测定三种样本包括UHT牛奶、奶粉、营养粉。没有显著差异的相对标准偏差_r(2.9 - -9.1%)和相对标准偏差_R(2.1 - -9.8%)值之间的个体人三个示例类型(表7)。我们的方法的相对标准偏差值低于10%,表明足够的精度。我们的相对标准偏差值也满足标准提出的采用AOAC公认的国际标准偏差_r< 15%,相对标准偏差_R< 22%浓度水平的100 (23]。选取有代表性的三个矩阵与已知数量的维生素水平上升三个浓度水平和分析来确定方法恢复。化合物和样本类型之间的飙升的水平不同,生成一系列从50到5000µ克/ 100克。所有目标化合物的回收率从107%到80不等,显示良好的精度。这些恢复值落在可接受的范围之内(80 - 110%)预计采用AOAC公认的国际浓度水平的100到10 ppm (23]。我们的方法的可靠性也证实了方法开发婴儿配方奶粉样品的结果采用AOAC公认的2018年的多个实验室的研究(14]。此外,我们还加入了雀巢公司的内部测试在2019年和2020年婴儿配方奶粉样品。比率的维生素B1、B2、B3和B6含量来衡量我们的方法和分配的值范围从113%到79≤z分数值2,建议可接受的精度水平。

3.5。浓度用于b族维生素的营养产品

验证方法应用于分析7用于b维生素营养产品的浓度从经销商和杂货在河内城市,越南。实际样品的分析结果列在下表中8。阮,肋骨、网卡和PYN量化在所有的样品。NIA样本中检测出牛奶(奶粉样品5/5和3/5 UHT牛奶样品)而不是营养粉样品。两个其他形式的维生素B6(即。,所有供试和宾)were found in powdered milk samples only. Concentrations of NIC (724–8630 µ克/ 100克)一般都高于其余化合物(不检测- 2480µ克/ 100克)。粉末样品(如维生素B的浓度。,powdered milk and nutritional powder) were higher than liquid samples (i.e., UHT milk). However, these concentrations were derived for original samples and “actual” concentrations in prepared forms of the powder samples were not considered. Total vitamin B concentrations (i.e., vitamins B1, B2, B3, and B6) measured by our method were compared with label values, showing good agreement with average measured/labelled ratio as 96 ± 11%.

总维生素维生素浓度的贡献,我们的结果表明,NIC和PYN维生素B3和B6的主要组件,分别。NIC占100%到95(99±1%)的总维生素B3。产品标签上的营养信息的维生素B3通常被称为“维生素B3”或“烟酸,”尽管NIA被发现在低水平,甚至没有发现。我们的研究结果是在良好的协议与婴儿配方产品的报道(24,25]。这些观察结果表明制造商的责任需要报告确切的产品标签上的营养信息。网卡也更丰富的比NIA母乳(26和新鲜的牛,山羊,和牛奶27]。在我们的样本中,PYN占100%到90(98±4%)的总维生素B6。比例的PYN奶粉样品,所有,在总维生素B6和宾93±3%,4±2%,2±1%。在婴儿配方奶粉样品中所有被发现的重要水平(22 - 26%的PYN +所有)(14]。所有主要的人被发现在人类牛奶(87 - 97%的PYN +所有+ PYM) (26]。除此之外,所有的重要比例和其他一些维生素B6形式(例如,吡哆醛5′磷酸和4-pyridoxic acid)发现了新鲜牛奶样品中(27]。因此,详细和全面的分析不同的维生素的形式,而不是总维生素和维生素,需要在将来的研究中。

4所示。结论

在这项研究中,一个简单而无溶剂的萃取分析方法用于b维生素营养产品进行了研究。液体样品(包括UHT牛奶和复原乳和营养粉)是消化的酶混合物,由甲酸铵溶液稀释,过滤之前使用质/ MS方法量化。我们的优化方法显示足够的特异性、准确性、重复性、再现性,敏感性的同时测定7用于b维生素在宽的浓度范围三个数量级(例如,µg毫克/ 100克)。该方法成功地应用于测量几个营养产品的维生素B的浓度从河内城市,购买越南,显示协议总维生素水平的测量和标记值。然而,差异造成(如维生素识别和贡献。维生素B3和B6)应该考虑。我们的研究结果表明,维生素形式的详细描述食品和营养产品是必要的。

数据可用性

的主要部分研究数据包括在本文中。其他数据可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢员工的食品质量和食品添加剂检测的实验室,国家食品控制研究所,越南,在实验的支持。作者感谢教授亚历山大Scheeline(美国伊利诺伊大学香槟分校)的关键编辑手稿。

补充材料

图S1:色谱用于b维生素和内部标准在标准的解决方案由不同流动相的程序。图S2:色谱用于b族维生素的营养产品和内部标准(补充材料)。(补充材料)

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