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化学分析方法杂志
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化学分析方法杂志/2020/文章

研究文章|开放获取

体积 2020 |文章的ID 8873003 | https://doi.org/10.1155/2020/8873003

艾哈迈德Mostafa， “同时测定制剂和人尿中不同药物的分光光度法和多元校正技术:绿色度评价”,化学分析方法杂志， 卷。2020， 文章的ID8873003， 15 页面， 2020。 https://doi.org/10.1155/2020/8873003

同时测定制剂和人尿中不同药物的分光光度法和多元校正技术:绿色度评价

艾哈迈德Mostafa1

1伊玛目Abdulrahman Bin Faisal大学临床药学院药物化学系，Faisal King Road, P.O. Box 1982, Dammam 31441，沙特阿拉伯

学术编辑器:安东尼奥诉Herrera-Herrera
收到 2020年4月9日
公认 2020年5月01
发表 2020年5月29日

摘要

开发并验证了两种环保、快速、经济的分光光度法测定阿替洛尔、对乙酰氨基酚、氢氯噻嗪和左氧氟沙星的方法。第一种方法是新发展的扩展导数比(EDR)，第二种方法是多元曲线分辨率-交错最小二乘(MCR-ALS)。在EDR法中，分别用281.6,237.6,279.2,282.8 nm的扩展导数比值振幅定量阿替洛尔，对乙酰氨基酚，氢氯噻嗪，左氧氟沙星。在MCR-ALS方法中，建立了校准模型，并使用了相关约束。采用7种混合物组成的外部验证数据集，计算了预测的均方根误差、预测的标准误差、偏差和预测的相对误差等不同的优点值，取得了满意的结果。两种方法的结果具有可比性。该方法已被验证并应用于测定目标分析物在剂型，添加和真实的人尿。然后将所得结果与已发表的方法进行统计学比较，结果在准确度和精密度上无显著差异。此外，利用国家环境方法指数NEMI和分析生态尺度对方法的绿色度进行了评价。所开发的方法可作为一种有效的、环保的、简单的、经济的替代方法，用于对所研究的剂型药物和人类尿液进行常规分析。

1.介绍

阿替洛尔(在)(图图1（a））是一种选择性SS1受体阻断剂，用于治疗高血压和冠心病心脏疾病的治疗。AT小经历或在肝脏中没有代谢和主要尿中排出（所吸收的药物的85％以上是在尿作为未改变的药物排泄）1]。不同的分析技术已被报道用于分析AT，如高效液相色谱(HPLC) [2-4),光谱光度测量的(2，五，6]、毛细管电泳[7，8]，气相色谱法（GC）[9，以及荧光光谱法[10)方法。

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图1
阿替洛尔(a)、对乙酰氨基酚(b)、氢氯噻嗪(c)和左氧氟沙星(d)的化学结构。

扑热息痛(PR)或扑热息痛(图)图1（b）)是一种非处方(OTC)止痛解热药。PR在肝脏代谢，主要通过尿液排出。大约1-4%的给药剂量被不变地排出体外[11]。然而，47-62%的剂量通过与葡萄糖醛酸偶联的扑热息痛排出，25-36%通过与硫酸盐偶联排出([12，13]。少量（8-10％）通过氧化代谢形成半胱氨酸和巯基尿酸缀合物[13]。

文献中有很多关于PR分析的研究，包括HPLC [14-17GC (),18),分光光度法19，20.],伏安法[21，及电泳[22]。

氢氯噻嗪(HZ)(图图1（c）)是一种噻嗪类利尿剂，用于治疗与充血性心力衰竭等疾病相关的高血压和水肿。HZ(>95%)以尿液中未改变的药物排出[23，24]。不同的测定HZ的方法已被报道，如高效液相色谱法[25-28GC (),29),分光光度法30.，31，以及伏安法[32]。

左氧氟沙星(LV)(图1（d）)是一种氟喹诺酮类抗生素，分别抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的DND拓扑异构酶IV和gyrase。用于泌尿、呼吸道、皮肤和软组织感染[33]。文献中有许多关于LV测定的报道，包括HPLC等不同的方法[34，35),分光光度法34，36],伏安法[37，以及毛细管电泳[38]。

部分患者可同时使用AT、PR、HZ、LV，主要随尿液排出。据我们所知，目前还没有同时测定这四种药物的方法。

绿色分析化学(GAC)关注发展可持续和更环保的新方法，已引起分析化学家的极大兴趣[39，40]。然而，挑战在于如何在提高已开发方法的质量和改进方法的绿色度之间达成妥协[39，41]。紫外可见光谱被认为是比高效液相色谱更绿色的分析技术。紫外-可见光谱是一种快速的技术，消耗低的溶剂量，从而减少产生的废物的数量。此外，这种技术具有成本效益，不需要昂贵的溶剂或精密仪器[42，43]。然而，使用UV-Vis光谱分析的主要挑战是分析多组分混合物，特别是当分析物的光谱有强烈重叠时[42，44]。为了克服这一挑战，作者提出了使用非传统的分光光度技术，即扩展导数比(EDR)。此外，使用多元校准有助于数学分辨率的多组分混合物。

因此，本工作旨在开发绿色、经济和精确的分析AT、PR、HZ和LV的方法。两种方法包括非传统单变量方法(例如,扩展比例导数(EDR))和多元方法(例如,多元曲线resolution-alternating最小二乘(MCR-ALS))开发和验证,然后成功地应用分析的四个分析物在不同的药物剂型,飙升和真正的人类的尿液。此外，采用国家环境方法指数(National Environmental Methods Index, NEMI)对方法greenness进行评估[45，46]和分析生态量表[47]。

1.1。理论背景
1.1.1。扩展导数比率技术(EDR)

让我们考虑一下混合中号由四种化合物组成( ，X，Y,和ž)。一旦在整个波长范围内都遵守了啤酒定律，吸收光谱中号将等于四种分析物各自光谱的总和(即比尔定律的添加性)。由下式定义: 在哪里 的吸光度是中号在波长 ， ， ， 和 化合物的摩尔吸收率是多少 ，X，Y,和ž在波长 和 ， ， 和 是的浓度 ，X，Y,和ž,分别。

复合 测定、混合(米1）包含所有其他三种化合物（X，Y,和ž)除了复合 ，可表示为:

对于这两个公式（1）和（2光程被认为是1cm。

划分混合光谱中号通过米1会导致以下比率谱: 其中K是常数。

的衍生物比谱可以被表示为如下：

方程(4)表明导数比谱幅值与化合物浓度有关，并与化合物浓度成正比 。因此，可以通过划分纯化合物的不同浓度的光谱来绘制校准曲线 通过其它三种化合物的三元混合物，可以得到一个回归方程。同样，其他三种化合物也可以用同样的方法测定 。

1.1.2。多元曲线分辨率-交互最小二乘(MCR-ALS)

MCR是一种提取多组分系统中纯组分相关信息的软建模算法。它可以通过数据矩阵的双线性分解来实现d如下: 在哪里C和小号Ť是纯的浓度和光谱曲线[48]。Ë为未被双线性模型解释的数据的残差矩阵。的C和小号Ť剖面可以使用交替最小二乘(ALS)迭代优化，直到达到一定的收敛标准。利用组分光谱的初步估计来启动优化过程，以及简单易用的交互式自建模混合分析(SIMPLISMA) [49)是就业。特定的约束，如非负性、闭包性、单模性和相关性约束[50，51]可在优化过程中应用。在本文的工作中，采用了非负性谱约束、非负性浓度约束和相关约束。后一个约束增强了建立校准模型的能力，该模型允许在存在未知干扰的情况下对组件进行定量分析[50，52]。

的MCR-ALS模型的一致性和可靠性可以使用缺乏拟合方程的百分比（（被测量6))和占总解释方差的百分比(式(7))。这两个参数的计算公式如下: 在哪里 是数据矩阵的元素d和 为相关残差(实验数据输入与模型再现数据之间的差值)。

(1)模型验证。使用由7种混合物组成的数据集作为外部验证集，将评估所开发模型的性能。根据以下公式计算不同的优点值来评估所获得的结果[50]:

预测（RMSEP）的均方根误差，

偏见,

预测标准误差(SEP)，

浓度预测的相对误差百分比(RE %)， 在哪里 和 样品中已知和预测的分析物浓度是多少 ，分别为, 为验证样本总数。

在已知浓度和预测浓度之间进行线性回归拟合，并计算斜率、截距和确定系数。

2.材料和方法

2.1。仪器和软件

采用Shimadzu UV-1800双光束分光光度计(日本东京)，1cm石英光电池进行数据采集。扫描范围为200-330 nm，间隔0.2 nm。光谱由岛津(Shimadzu) 2.62 uv探针获得。MCR模型使用MCR- als GUI 2.0软件开发，Matlab 2015a使用[53]。该软件是免费提供的http://www.mcrals.info。

2.2。化学药品和试剂

阿替洛尔(CAS no。29122-68-7;最低纯度98%)，扑热息痛(CAS no. 98)。103-90-2;和氢氯噻嗪(CAS no. 98)。58-93-5;最低纯度98%)购自Sigma-Aldrich(德国Steinheim)。半水合左氧氟沙星138199-71-0;99%最低纯度)购自Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Canada)。螺旋pomatiaβ用于水解的-葡萄糖醛酸苷酶取自Sigma-Aldrich(美国圣路易斯)。

乙醇(LiChrosolv®，HPLC级)取自默克公司(德国达姆施塔特)。超纯水(18.2米Ω)获得的纯实验室超水系统(ELGA,韦康比高,英国)和用于所有样品制备。

本研究获得了沙特阿拉伯伊玛目Abdulrahman Bin Faisal大学临床药学学院研究和伦理委员会的批准。在获得知情的书面同意后，从三名健康志愿者(23-25岁)收集空白尿液样本，并将其保存在−20℃。

所研究药物的商业药物剂型是在本港市场购买的，详情如下:(我)Tenormin®片(批次PF742)由英国阿斯利康有限公司生产，标记为每片含100毫克。（ⅱ）Panadrex®片(批次JT377)由科威特沙特制药工业公司生产，标签为每片含500毫克PR。(3)HCT Georetic 25®片(批次# 1832207)由埃及Marcyrl制药工业生产，标记为每片含25 mg HZ。(iv)Tavanic®片剂(第7PK7A批次)由法国赛诺菲温斯洛普工业公司生产，标示每片含500毫克LV。

2.3。程序
2.3.1。标准的解决方案

将10 mg AT、PR、HZ和LV分别溶于10 mL乙醇中，配制成库存溶液，作为EDR和MCR-ALS方法的库存标准溶液。所有溶液在4℃下保存，至少可以稳定3个月。用超纯水适当稀释得到工作溶液，使其达到各方法的校准范围。

2.3.2。光谱特征

溶液的紫外光谱由10μ克毫升-1的μ克毫升-1在200-330 nm的波长范围内分别分析PR、HZ和LV。

2.3.3。功能的方法

AT的各标准储备液的适当体积，PR，HZ和LV转移到四组不同的10毫升容量瓶稀释，并用超纯水以达到5-40的校准范围，1-25个，1-15个，和1-15 μ克毫升-1分别为AT, PR, HZ, LV。以超纯水为空白，在200 ~ 330 nm范围内测定了吸收光谱。

(1)确定。一种由7,2,4组成的混合物μ克毫升-1PR，HZ，和LV，分别被针对超纯水扫描为空白和谱存储（AT除数）。工作AT的标准溶液的UV光谱通过所存储的除数划分，将所得比谱的二阶导数计算采用Δλ= 4nm和10作为比例因子。的一种米plitudes at 281.6 nm were directly proportional to AT concentration. The calibration curve was obtained and the corresponding regression equation was calculated.

(2) PR的确定。十五，三，五的混合物μ克毫升-1在超纯水上分别扫描AT、HZ和LV的空白，并存储光谱(PR因子)。公关的紫外光谱工作标准的解决方案是除以除数存储,和由此产生的比率的一阶导数光谱计算采用Δλ= 4nm和10作为比例因子。237.6 nm处的振幅与PR浓度成正比。得到了校准曲线，并计算了相应的回归方程。

（3）HZ的测定。的15，10和5组成的混合物 μ克毫升-1在超纯水上分别扫描AT、PR和LV的空白，并存储光谱(HZ因子)。赫兹的紫外光谱工作标准的解决方案是除以除数存储,和由此产生的比率的一阶导数光谱使用Δ计算λ= 2nm和10作为比例因子。在279.2 nm处的振幅与HZ浓度成正比。得到了校准曲线，并计算了相应的回归方程。

LV的（4）的测定。由15 7和2组成的混合物μ克毫升-1AT，PR和HZ，分别被针对超纯水扫描为空白和谱存储（LV除数）。工作LV的标准溶液的UV光谱通过所存储的除数划分，将所得比谱的二阶导数计算采用Δλ= 4nm和10作为比例因子。在282.8 nm处的振幅与LV的浓度成正比。得到了校准曲线，并计算了相应的回归方程。

2.3.4。MCR-ALS方法

由25个样本组成的校准和验证集采用五级四因素设计[54]，其中引入了AT、PR、HZ和LV五种不同浓度水平。水平范围为5 - 25,1 - 10,1 - 10,1-7μ克毫升-1分别为AT, PR, HZ, LV。所有样品的紫外光谱以0.2 nm的间隔在220 ~ 330 nm进行扫描。18个样本用于建立校准模型，7个样本用于外部验证，随机选择。利用MCR-ALS GUI 2.0软件将吸收光谱输出到Matlab中，建立MCR-ALS校正模型[53]。快速非负最小二乘法（用于光谱和浓度分布）和相关性约束被使用。

2.4。样品制备
2.4.1。药品制剂分析

每种商业配方称量10片，然后粉碎。将相当于100.0 mg AT、PR、HZ和LV的部分精确地加入到100 mL锥形瓶中，用50 mL乙醇超声检测30分钟。将溶液过滤到100ml容量瓶中，用乙醇标记。下节所详细描述的EDR和MCR-ALS方法的程序如下2.3。3和2.3。4,分别。

2.4.2。分析添加的和真实的人类尿液样本

所有尿样经注射器过滤至0.45μμm尼龙过滤器。100等份 μL of blank urine were transferred into a set of 10 mL volumetric flasks. Different volumes of the stock standard solutions of AT, PR, HZ, and LV were added, vortex mixed, and the volume was completed to mark with ultrapure water. The procedures for EDR and MCR-ALS methods were followed as detailed under Sections2.3。3和2.3。4,分别。用相应的回归方程计算分析物的浓度。

方法应用在真正的尿液样本的分析:(A)尿液收集经历h后从一个健康志愿者管理的单一口服500毫克剂量的公关,和(B)尿液收集后从一个健康的志愿者经历h的500毫克的LV。收集的尿液量被准确地测量。一个100μ用超纯水稀释成10 mL，直接测定PR和LV。

3。结果与讨论

数字2显示了AT、PR、HZ和LV的零阶吸收光谱。在整个波长范围内(200-330 nm)，四种分析物的吸收波段有严重的重叠。因此，这些药物的同时测定受到传统校准程序的阻碍，而没有预先分离。因此，我们提出了简单、可靠和精确的非常规单变量和多变量化学计量辅助分光光度法，用于同时分析药物剂型、添加的和真实的人类尿液样本中的AT、PR、HZ和LV。此外，对开发的方法的性能进行评估，并与已发布的方法进行统计比较[3，16，28，34]。


图2
零阶吸收光谱为10μ克毫升-1阿替洛尔（AT），5 μ克毫升-1扑热息痛(PR) 10μ克毫升-1氢氯噻嗪(HZ)和5μ克毫升-1左氧氟沙星(LV)。
3.1。功能的方法
3.1.1。除数和衍生参数的选择

感兴趣的分析物的严重光谱重叠证明了该方法的分辨能力。每个分析物可以通过使用由其他三种分析物组成的除数混合物来确定。

在线性范围内制备了六种不同浓度的AT、PR、HZ和LV的合成混合物。记录并保存了溶液的零级吸收光谱。

为了确定AT的，含有AT，PR，HZ，和LV标准溶液的所存储的光谱通过所存储的AT除数划分;然后将所得到比谱的二阶导数（2DD）使用Δ计算λ= 4nm，缩放因子10(图3(一个))。为了测定AT，从得到的导数光谱中选择了一个可重现的振幅。在281.6 nm处计算出的振幅与at的浓度成正比。

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(一)
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(b)
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(c)
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(d)
图3
得到的导数比值谱叠加:(a)2日雨量(5-40)μ克毫升-1);(b)1PR的DD (1-25)μ克毫升-1);(c)1赫兹(1-15)μ克毫升-1);和(d)2LV的DD（1-15 μ克毫升-1)。

另一方面，对于PR的测定，采用同样的程序，使用PR因子得到如上所述的比值谱。则比值谱的一阶导数(1DD)用人Δ计算λ= 4nm和10作为比例因子(图3 (b))。在237.6 nm处计算出的振幅与PR的浓度成正比。

此外，确定HZ使用类似的程序使用HZ除数，和1DD是用人Δ计算λ= 2nm和10作为比例因子(图3 (c))。测量了279.2 nm处的振幅，发现它与HZ的浓度成正比。

此外，用LV除数和2使用ΔDD计算λ= 4nm，比例因子为10(图3 (d))。在282.8 nm处的振幅被计算，发现与LV浓度成正比。

为了可靠、准确地测定感兴趣的分析物，对影响所发展的方法性能的主要参数进行了优化。这包括除数选择的优化，这是提出的技术的关键步骤。选择除数中各分析物的浓度时，吸光度较低，但光谱特征明显[55]。制备了不同的混合物，并进行了除数试验，选出了最优的混合物。计算并测试了比值谱的一阶导数和二阶导数。在PR和HZ情况下，一阶导数提供了可靠和准确的结果。然而,2DD比1在AT和LV情况下使用DD，因为它提供了更好的光谱分辨率和更精确的结果。此外,Δ的效果λ为1DD和2DD是优化并使用Δ最好的结果λ  2 for HZ and Δλ 4代表AT, PR和LV。此外，对比例因子进行了优化，发现10的比例因子适用于所有分析物。

3.1.2。方法验证

根据国际协调会议（ICH）的建议[进行验证的方法56]。

（1）线性。七个浓度在5-40，1-25，1-15，1-15和浓度范围内使用 μ克毫升-1在，PR，HZ，和LV，分别。所提出的方法显示出高相关系数（ ）和不具有统计学意义的截距值( ）不同于零。回归参数见表1。
参数 在 公关 赫兹 LV
校准范围(μ克毫升-1） 5-40 1 - 25 1 - 15 1 - 15
回归方程:
斜率(b） 0.0053 0.1830 0.1211 0.0998
拦截(一种） −1.43×10-4 −3.23×10-4 −6.10 × 10-3 −1.37×10-3
相关系数([R2） 0.9995 0.9998 0.9994 0.9996
坡度标准差(小号b） 5.19×10-5 1.24×10-3 1.32×10-3 8.50×10-4
截距的标准偏差（小号一种） 1.22×10-3 1.7五 × 10-2 1.18×10-2 7.66×10-3
LOD一种（μ克毫升-1） 0.76 0.31 0.32 0.25
定量限b（μ克毫升-1） 2.31 0.95 0.98 0.77
准确度(平均值±标准差)C） 99.82±0.88 99.93±0.85 99.98±0.69 100。26 ± 0.77
精确：
盘中(%相对标准偏差d） 0.70 0.66 0.93 0.98
Interday(%相对标准偏差Ë） 1.26 0.88 0.90 0.94
一种检测极限。b量化的极限。C三种不同浓度的标准差，每种分析一式三份。d在同一天内分析3个重复的三种不同浓度的相对标准偏差。Ë连续三天三份分析三种不同浓度的相对标准偏差。
表1
特征验证参数的提出的EDR方法，以确定AT, PR, HZ和LV。

(2)检测和定量限。根据ICH标准计算检测限(LOD) 定量限制计算为 ，其中“ 为截距的标准差， 为校准曲线的斜率(表)1)。

(3)准确性和精密度。用三份不同浓度的每种药物来评价方法的准确性，并计算每种分析物的百分比回收率。通过分析同一天(日内)和连续三天(Interday)内每种药物三种不同浓度的三次重复分析来评估其精确性，并计算相对标准偏差(%RSD)。样品按照“2.3.3”中的步骤进行分析。结果汇总在表中1显示出优异的回收率和％RSD 1.26比指示所提出的方法的良好的准确性和精度降低。

（4）选择性。使用包括线性范围内以不同的浓度比的四种分析物几个实验室合成的混合物的方法的选择性的影响。在表中所示的结果2表明了该方法的高选择性。
混合。不。 浓缩的。（μ克毫升-1） %的复苏
在 公关 赫兹 LV 在 公关 赫兹 LV
1 15 10 3 6 98.15 99.70 100.70 101.5
2 30. 2 五 五 97.85 99.15 99.70 99.40
3 25 6 8 4 100.20 101.20 98.45 100.00
4 25 五 7 4 99.56 100.91 101.62 100.25
五 10 1 4 1 102.11 98.70 101.90 99.10
6 15 4 五 3 98.40 100.00 99.80 99.80
的意思是 99.38 99.94 100.36 100.01
±SD 1.61 0.97 1.30 0.84
表2
使用所提出的方法EDR在合成混合物AT，PR，HZ，和LV的测定。

(5)统计分析。本署将所开发方法的所得结果与公布的测定AT的方法进行比较[3,公关16],赫兹[28]，和LV [34]。所得结果见表3所提出的方法与已公布的方法在准确度和精密度方面并无显著差异。
在 公关 赫兹 LV
功能 发表的方法(3] 功能 发表的方法(16] 功能 发表的方法(28] 功能 发表的方法(34]
的意思是 99.77 100.05 101.04 100.11 101.07 100.30 99.69 100.15
±SD 1.10 1.06 1.16 1.05 0.71 0.96 1.22 1.12
ñ 3 3 3 3 3 3 3 3
Ť一种 0.23 1.32 1.08 1.63
F一种 1.08 1.21 1.86 1.19
一种重要的价值观Ť和F是4.30和19.00，分别在（ )。
表3
提出的EDR方法与公布的测定AT, PR, HZ和LV方法的统计比较。
3.2。多元曲线分辨率-交替最小二乘

四个分析物和尿液矩阵需要使用多变量校准模型的未知样品干扰的存在之间的严重的光谱重叠解析这种混合物。第一阶多元校准方法可以在这种情况下一个很好的选择只有当干扰背景在校准阶段很好的体现。然而，如果这种干扰不会在校准表示的，一阶方法可能不是一个很好的选择。在这种情况下，二阶多元校正模型甚至可以在未知干扰的存在更好地工作，由于其良好的预测能力[57]。在这项工作中，建立了MCR-ALS模型，用于测定药物剂型中感兴趣的四种分析物，并在校准样品中加入尿液样本。

3.2.1之上。校准设置

采用多级多因素实验设计构建四种分析物的25种混合物，从而提供相互正交的因素[54]。在校准范围内，对每个分析物使用五个不同的浓度水平。共使用18种混合物建立校准模型，7种混合物作为外部验证集，如表所示4。
混合。不。 在 公关 赫兹 LV
1 15 5.5 5.5 4
2 15 1 1 7
3 五 1 10 2.5
4 五 10 3.5 7
五 25 3.5 10 4
6 10 10 5.5 2.5
7 25 5.5 3.5 2.5
8 15 3.5 3.5 5.5
9 10 3.5 8 7
10 10 8 10 5.5
11 20. 10 8 4
12 25 8 5.5 7
13 20. 5.5 10 7
14 15 10 10 1
15 25 10 1 5.5
16 25 1 8 1
17 五 8 1 4
18 20. 1 5.5 5.5
19 五 5.5 8 5.5
20. 15 8 8 2.5
21 20. 8 3.5 1
22 20. 3.5 1 2.5
23 10 1 3.5 4
24 五 3.5 5.5 1
25 10 5.5 1 1
用作外部验证集的混合物。
表4
用于准备MCR-ALS方法的校准和验证集的浓度矩阵。
3.2.2。波长范围的选择

多变量校准的质量取决于所选择的建立校准模型的波长范围。因此，200 - 220nm区域的数据由于噪声被丢弃。此外，290-330 nm的波段也被排除，因为AT在该区域的吸收不明显。因此，所开发的MCR-ALS方法使用的区域为220-290 nm，间隔为0.4 nm。

3.2.3。开发MCR-ALS型号

没有数据预处理是在校准矩阵进行，同时开发MCR-ALS模型。以获得由MCR-ALS模型合理的分辨率，所述目标分析物的纯光谱的初始估计被进行。发现五个组成部分负责不同样品中的变化。非负性约束（用于光谱和浓度分布）和相关性约束中开发模型中使用。该模型解决了五个品种。第一四条曲线非常相似，AT，PR，HZ，和LV光谱与相关系数（ = 0.9996, 0.9998, 0.9997，和09999，分别)之间的实际和计算在，PR, HZ，和LV光谱。第五光谱被估计为干扰尿基质。估计的光谱剖面如图所示4。使用每个分析物的解析矩阵来找到每个分析物的浓度剖面，获得了令人满意的结果，低缺乏拟合(% lof)为0.1721。开发的模型捕获了分析光谱中99.99%的方差。数字五显示由MCR-ALS模型解析的浓度值与真实浓度值的散点图。四种分析物的测定系数均不小于0.9998，具有较好的预测能力。表格五展示了所开发模型的不同优点。


图4
MCR-ALS分辨光谱的四个目标分析物(AT, PR, HZ, LV)和干扰尿基质。
(一)“ñ一种米Ë=
(一)
(b)“ñ一种米Ë=
(b)
(c)“ñ一种米Ë=
(c)
(d)“ñ一种米Ë=
(d)
图5
实际药物浓度与MCR-ALS AT、PR、HZ和LV预测值的散点图。
参数 在 公关 赫兹 LV
校准范围(μ克毫升-1） 5-25 1 - 10 1 - 10 1 - 7
坡 0.9998 1.0000 1.0001 1.0014
斜率标准误差 3.28×10-3 3.00×10-3 2.80×10-3 1.88×10-3
截距 3.27×10-3 4.96×10-4 −7.84×10-5 -3。29 × 10-3
截距标准误差 5.67×10-2 1.95×10-2 1.81×10-2 8.00×10-3
RMSEC 9.08×10-2 3。34 × 10-2 3。67 × 10-2 1.66×10-2
SEP 8.83×10-2 3.25×10-2 3.56×10-2 1.62×10-2
偏见 −7.15×10-4 −3.90×10-4 −3.00×10-4 −2.01×10-3
回覆 （％） 0.526 0.515 0.567 0.391
决定系数（[R2） 0.9998 0.9999 0.9999 0.9999
表5
用于校正AT、PR、HZ和LV的MCR-ALS模型的优点图。
3.2.4。MCR-ALS模型的验证

在感兴趣的分析物的校准范围内，开发的模型被应用于一系列由7种不同合成混合物组成的外部验证数据集(表)4)。回收率汇总在表中6显示出令人满意的结果。为了进一步验证该模型，优点包括RMSEP，SEP，RE％的不同的数字，并且[R2为外部验证集计算，得到满意的结果如表6。此外，还计算了外部验证集的精度、日内精度和日间精度，以进一步评价模型。在准确度和精密度方面得到了令人满意的结果(表)6)。
参数 在 NP 赫兹 LV
准确度(均值±标准差)一种 99.71±1.16 99.71±1.22 99.94±0.85 100.01±0.79
精确：
盘中(%相对标准偏差)b 1.57 1.32 1.35 0.86
Interday(%相对标准偏差)C 1.70 1.24 1.65 0.72
RMSEP 0.2033 0.0307 0.0461 0.0366
SEP 0.1882 0.0284 0.0426 0.0339
偏见 6.63×10-2 −8.34×10-3 −1.08×10-3 2.60 × 10-3
回覆 （％） 1.39 0.49 0.72 0.71
[R2 0.9994 0.9999 0.9999 0.9996
一种7次测定的平均值和标准偏差。b在同一天内分析3个重复的三种不同浓度的相对标准偏差。C连续三天三份分析三种不同浓度的相对标准偏差。
表6
对于AT, PR, HZ和LV的验证集的MCR-ALS模型的优点图。
3.3。实际样本分析
3.3.1。药物配方分析

所建立的方法被成功地用于定量的AT, PR, HZ和LV在不同剂型和结果进行统计比较与报道的方法配对Ť-检验和F比率在95%置信水平。结果令人满意，与报道的方法在准确度和精密度方面无显著差异(表)7)。
参数 浓缩的。称(μ克毫升-1） 功能 MCR-ALS 参考方法
浓缩的。发现(μ克毫升-1） %的复苏 浓缩的。发现(μ克毫升-1） %的复苏 浓缩的。发现(μ克毫升-1） %的复苏
在 Tenormin®平板电脑 10 10.05 100.50 9.96 99.60 10.10 101.00
15 14.85 99.00 15.05 100.33 15.08 100.53
20. 19.61 98.05 19.75 98.75 19.9 99.50
的意思是 99.18 99.56 100.34
±SD一种 1.24 0.79 0.77
Ťb 3.50 2.26
Fb 2.59 1.07
公关 Panadrex®平板电脑 3 2.96 98.67 3.02 100.67 2.98 99.33
五 5.05 101.00 4.93 98.60 5.03 100.60
10 10.04 100.40 10.1 101.00 9.8 98.00
的意思是 100.02 100.09 99.31
±SD一种 1.21 1.30 1.30
Ťb 0.79 0.53
Fb 1.15 1.00
赫兹 HCT georetic 25®片 3 3.03 101.00 3.01 100.33 3.04 101.33
五 4.92 98.40 4.96 99.20 4.98 99.60
10 9.88 98.80 10.11 101.10 9.92 99.20
的意思是 99.70 99.77 100.47
±SD一种 1.84 0.80 1.23
Ťb 2.31 0.19
Fb 0.66 1.41
LV Tavanic®平板电脑 3 2.98 99.33 3.01 100.33 2.98 99.33
4 4.03 100.75 4.04 101.00 4.02 100.50
五 5.03 100.60 5.01 100.20 5.03 100.60
的意思是 100.23 100.51 100.14
±SD一种 0.78 0.43 0.70
Ťb 1.00 0.89
Fb 1.22 2.70
一种标签索赔金额的回收率平均值的标准偏差。b理论值Ť和F下午4时30分及19时( ),分别。 AT的参考方法[3,公关16],赫兹[28]和LV [34]。
表7
所提方法和参考方法测定剂型中AT、PR、HZ、LV的结果。
3.3.2。分析添加的和真实的人类尿液样本

EDR和MCR-ALS方法被成功地用于定量的四种感兴趣的分析物的人的尿液样本，并获得了令人满意的结果8)。
样品没有。 浓缩的。（μ克毫升-1） 功能 MCR-ALS
在 公关 赫兹 LV 在 公关 赫兹 LV 在 公关 赫兹 LV
1 25 3 3.5 4 104.10 102.90 103.15 102.9 99.88 99.20 101.83 102.64
2 10 五 4 1 97.81 101.30 104.7 105.35 101.41 97.94 100.86 102.12
3 15 7 2 3 102.15 103.70 103.71 98.11 102.77 96.86 98.69 101.04
的意思是 101.35 102.63 103.85 102.12 101.35 98.00 100.46 101.93
±SD 3.22 1.22 0.78 3.68 1.45 1.17 1.61 0.82
表8
利用所提出的方法加标人尿样品中AT，PR，HZ，和LV的测定结果。

PR的药代动力学研究报告，它主要以偶联物的形式从尿液中排出[12，13]。因此，将PR尿样经酶解得到总PR (free +偶联)。相当于400单位的β口服PR剂量后，在收集的尿液样本中加入具有硫酸酯酶活性的-葡萄糖醛酸酶。使用醋酸盐缓冲液将pH调至5,37℃孵育1 h [58]。用所建立的方法测定了同一样品在孵育前和孵育后有酶解和无酶解的PR浓度。由于酶解引起的PR浓度的增加，没有得到显著的差异。结果表明，该方法可直接测定尿液中总PR，无需水解步骤。此外，已公布的高效液相色谱法[16]用于测定尿液样品经酶解后的总PR，测定的浓度与未经酶解的方法得到的浓度非常接近(表)9)。
复合 参数 功能 MCR-ALS 参考方法
公关 浓度(μ克毫升-1） 454.5 459.7 457.4
排泄量(0 - 12h) (mg) 445.4 450.5 448.2
排泄率(0 - 12h) 89.1 90.1 89.6
LV 浓度(μ克毫升-1） 315.3 324.9 318.5
排泄量(0 - 12h) (mg) 302.7 311.9 305.8
排泄率(0 - 12h) 60.5 62.4 61.2
参考方法:PR [16]和LV [34]。
表9
用EDR和MCR-ALS方法测定健康志愿者单次口服500 mg PR或LV后的PR和LV的尿排泄

尿液中排出的总PR浓度为454.5和459.7μ克毫升-1和一种Cumulative (0–12 h) urine excretion of 89.1 and 90.1% of the administered dose using EDR and MCR-ALS, respectively. This is in agreement with previous studies that reported similar PR urine excretion percentage [16，20.]。

另一方面，当使用开发的方法分析尿液样本B (LV剂量)时，通过EDR和MCR-ALS给药剂量分别累积(0-12小时)尿排泄量的60.5和62.4%测定LV。这一结果与之前报道的左室排泄率相似的研究结果一致[34]。并将所得结果与已公布的高效液相色谱法进行比较[34，如表所示，无显著性差异9。PR和LV的尿排泄结果列于表9。

3.4。评价方法的绿色度

采用NEMI和分析生态尺度两种不同的方法对所开发的方法进行了绿色度评价。

3.4.1。国家环境方法指数(NEMI)

该评估方法使用由四个象限组成的代表方法方面的绿色度profile符号，根据以下标准:使用的任何化学物质是持久性的、生物积累性的或有毒的(PBT)、危险的、腐蚀性的(pH <2或>12)，以及产生的废物量(>50克)。如果方法是绿色的，所有四个象限将被着色为绿色。然而，如果程序不满足这些方面中的任何一个，相应的象限将被留空(即，未着色)。

在所提出的方法中，乙醇，这被认为是绿色溶剂，用于制备储备溶液和使用水作为所有进一步的稀释和分光光度测定的溶剂。既不乙醇没有水被列为PBT或危险。的pH is not corrosive and the produced waste is <50 g per sample. Therefore, the proposed method passes the four criteria, and the four quadrants of the greenness profile are green.

3.4.2。分析Eco-Scale

该方法采用更定量的评价方法，计算数值分数来评价方法的greenness，高生态尺度分数(即> 75)表示方法的greenness。凡使用危险化学品、产生废物、能耗高或有接触危险的方法，可从满分100分中扣除扣分[47]。所提方法的生态尺度得分较高(95)表明所开发方法的绿色度较好(表)10)。因此，它们可用于药物制剂及尿样研究药物对环境很少有害影响的常规分析。
法物品 值 点球点(PPs)
试剂
(水)试剂 < 10毫升 1
试剂危险 没有一个 0
(乙醇)试剂 < 10毫升 1
试剂危险 2
总PPs(试剂量的PPs)×PPs试剂风险) 2
仪器
能源 <0.1千瓦时每个样品 0
职业危害 向空气中排放蒸汽和气体 0
浪费 1 - 10毫升 3
总PPS（聚苯硫醚仪器的总和） 3
总PPs (PPs试剂)+PPs仪器) 五
分析生态量表总分 100−5 = 95 95
表10
对所提出的方法进行分析生态尺度评分。

4.结论

开发了快速、准确、成本效益高的绿色非常规单变量和多变量化学计量辅助分光光度法，用于测定不同剂型的AT、PR、HZ和LV。此外，所提出的方法成功地应用于测定四种分析物在添加和真实的人类尿液样本，两种方法提供了可比的结果。对这两种方法的绿色度剖面的评估表明，它们对所研究的药物具有很好的绿色分析效果，对环境的有害影响很小。此外，所提出的方法不需要任何样品制备，复杂的高效液相色谱仪器，或昂贵的溶剂。此外，EDR方法的优点是简单，不需要任何复杂的数学算法需要MCR方法。然而，发展EDR方法的主要挑战是选择最佳除数，以获得选择性和重复性的结果。与其他一阶多元校正方法相比，MCR-ALS方法的优势在于，即使存在在校正阶段没有出现的推断，也能够产生良好的预测。所提出的方法可作为一种有效的、环保的、简单的、经济有效的替代方法，用于对所研究的剂型药物和人类尿液进行常规分析。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

的利益冲突

提交人无利益冲突需要申报。

致谢

这项工作是由科学研究的伊玛目·阿卜杜拉赫曼斌费萨尔大学王国Deanship，沙特阿拉伯（批准号：医药-2017-250）的支持。

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