一个验证容积吸收Microsampling-Liquid色谱串联质谱分析方法量化尿液的强力霉素水平:一个应用程序监控疟疾药物预防合规

文摘

因为物流和成本约束,监测符合抗疟药物预防药物在生物样品的定量不是一个简单的操作。事实上,分析运输设备是脆弱的,必须在完全控制的环境中使用。这也是的试剂和供应,和废物管理限制。因此,样品应该被遣返。他们应该被冻结后,收集和冷链运输没有破裂。这是至关重要的生成,可判断的数据,但通常没有任何困难。因此,提出一个可选择的解决方案更容易实现,在尿液的定量方法确定强力霉素使用体积吸收微量试样(VAMS进行验证^®)设备。吸墨纸,装置在室温下收集和转移后干燥,但相反地干点,体积是完全重复的集合。分析VAMS^®与高效液相色谱法进行耦合的质谱仪。核壳C18柱上的色谱分离实现了。意思是提取回收率为109% (RSD为,5.4%,n= 6)对强力霉素和102%(意味着RSD为7.0%)的内部标准。没有显示基体效应。Within-run天精度和准确性分别低于14%,从106%到96不等。研究了信号/浓度比在0.25 -50µ克/毫升范围,复苏back-calculated浓度在96 - 105%之间(RSD < 11.0%)。RSD在坡度为10%。实现验证,这个新的定量方法应用于实际样品。同时,一个简单的稀释后直接样本进行了分析。没有观察到的统计差异,确认VAMS的使用^®是一个很好的替代设备监控强力霉素合规。

1。介绍

疟疾仍然是一个主要公共卫生问题影响了大约一半的世界人口生活在流行地区。全球2.19亿疟疾病例发生在2017年,大约435000人死亡,其中大多是儿童在非洲区域(1]。同时,25到3000万人旅行每年流行地区,导致大约30000临床病例(2]。多发地旅行者中,士兵或工人是特定的人群可能呆几个月在环境条件下有利于疟疾传播。因此,预防规则的遵从性是基本保持卫生和操作能力。

每年超过10000名法国士兵部署在疟疾流行地区。尽管预防对策(向量保护、化学预防(CP)、健康教育,等等),每年数以百计的疟疾病例发生,导致一些不可用在那些天,卫生疏散;严重的情况下可能导致死亡3- - - - - -5]。多年来,CP在法国武装部队主要是确保每日口服剂量的强力霉素100毫克,已被证明是有效和耐受性良好6]。然而,以前的研究显示相关性强疟疾的发生和缺乏CP合规(7]。如果毫无疑问,战斗设置可能会导致这个缺陷,也指出过早关闭CP服药应延长4周(强力霉素)在流行地区。有趣的是,这种缺乏CP合规不具体,已经被其他军队8,9]或民用研究[10,11]。

在CP监控工具,量化强力霉素的尿液是一个有趣的方法。事实上,强力霉素是消除部分通过尿液(35 - 60%以上)在其活性形式,允许非侵入性抽样(12]。此外,尿液浓度是血浆浓度时间大约十倍(13),最大和最小稳态血浆浓度在0.5 - -4.0µ克/毫升范围(14]。因此,尿强力霉素浓度是一个纪念标志最后几天后管理。强力霉素很容易量化与不同的技术,特别是(超)高性能液体色谱法耦合的紫外线或质谱检测器。然而,由于缺乏可用的工具,这在专业实验室定量是国土。考虑强力霉素的稳定性和生物矩阵处理,因此需要冻结样品收集和船下特别的条件。这已经通过物流和预算问题产生重大影响。的确,冻结很少可用字段和干冰的样品运输成本是昂贵的。为了克服这些限制,航运的干样品将是一个不错的选择。然而,使用传统的集合在吸墨纸不可用定量取样的方法由于再现性差。

因此,本文提出一种定量方法,已经被完全使用完全校准微量试样设备进行验证。样品采集后,该设备可以被发送到国土实验室环境温度在一个简单的邮政包裹。然后进行液相色谱分析耦合串联质谱分析系统。工作是在(我)定量的验证方法应对指南的领域15- - - - - -17),(2)稳定性研究设备,和(3)分析样本工人在疟疾流行地区和那些接受CP与强力霉素。并行,直接量化方法的简单样品稀释后验证,结果与微量试样的方法。

在提交工作成果表明,强力霉素CP合规领域很容易被监控使用完全校准容积吸收微量试样(VAMS^®)设备。推而广之,VAMS^®可能是一个有趣的替代监控大规模人群(18,19),特别是在preanalytical阶段简化样本管理(运输和存储特别)。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

强力霉素hyclate(高效液相色谱法纯度≥98%),盐酸四环素(高效液相色谱法纯度≥95%)和三氟乙酸(组织)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。乙腈和甲醇HiPerSolv CHROMANORM®(质等级)和醋酸取自VWR (Fontenay-sous-Bois、法国)。使用Milli-Q Ultra-high-quality水获得积分3水净化系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。密特拉®微量试样设备(10µL)由Neoteryx(托兰斯、钙、美国)。尿液样本用于开发和验证过程收集的健康志愿者不接受药物治疗。这些样品被整除,一直冻结在−80°C,然后在研究用于标准和质量控制(QC)的制备样品。

2.2。仪器及色谱条件

优化各种实验参数包括固定相的性质,洗脱液的组成,性质的有机改性剂,电离和碰撞参数(数据未显示)。

色谱分析是使用一个安捷伦1100色谱仪(安捷伦科技,Les乌里,法国)配备了第四纪抽油机,脱气装置和一套autosampler 6°C。色谱分离是通过使用Kinetex C18 100Ǻ列(50×2.1毫米,2.6µ米)保护Kinetex C18警卫队列(2.1毫米ID)从Phenomenex购买(Le Pecq、法国)。列温度设定在40°C,注入体积是5µl .色谱法通过600年梯度系统的流量µL / min。涉及的流动相洗脱液的混合物,water-TFA (99.9: 0.1, v / v)和洗脱液B, acetonitrile-acetic酸(99.5:0.5,v / v)。开始的洗脱液洗脱液的混合A-eluent B是90:10 (v / v),分别;2分钟后洗脱液B是线性上升到50%的比例在3.5分钟,然后线性上升到95%在1分钟,1分钟洗列,然后回到它的初始条件在1分钟和re-equilibrated 4分钟。

质谱仪是4000 QTRAP系统(AB SCIEX, Les乌里,法国)配备一个电喷雾源在积极运行模式(ESI +)。质谱数据在多反应监测模式。氮是用作喷雾器、窗帘、加热器、气体和碰撞;相关设置喷雾器气体(GS1) 40 psi,加热气体(GS2) 45 psi,窗帘气体(坏蛋)20 psi。离子源是加热到600°C,和ion-spray电压是2000 V。停留时间是固定在80 ms为每个离子转变;碎片形成high-collision-activated下游离气体(12 V)。描述的参数对脱氧土霉素和四环素检测表1。

在方法验证,两个参考标准的解决方案准备water-acetonitrile-TFA-acetic酸混合物(85:15:0.1:0.5,v / v)含强力霉素的浓度低和高质量控制样品和内部标准(是)(1.0µg / mL)注入质/ MS系统在每个分析之前运行。这有助于我们验证系统的性能,建立一个适合性测试程序的常规计算方法的应用程序的许多参数作为被分析物的保留时间,信号/噪声比,不对称因素,决议,理论塔板数。

2.3。工作标准的解决方案,制备校准曲线,和质量控制样品

个股解强力霉素(2.5毫克/毫升),四环素(1.0毫克/毫升)的混合物准备-甲醇(85:15,v / v),然后整除,储存在−80°C。过程验证期间,股票的解决方案在4°C守恒在使用前一个星期,被带到房间温度(见3.4节)。对于每一个化合物,两个独立的股票准备解决方案:一个是用于制备校准器,另一个用于制备质量控制(QC)样本。强力霉素,12标准工作溶液(浓度从5.0到1.0不等µg / mL)得到无准备地通过适当的稀释股票的解决方案和甲醇混合物(85:15,v / v)。股票的解决方案的内部标准四环素在水中稀释20倍达到50浓度µ克/毫升。

名义浓度的校准标准和QC样品准备通过增加10µL到190年工作的解决方案µ无毒的L矩阵。校准曲线由8个校准点覆盖0.25 - -50.0µ克/毫升范围,还包括一个空白的矩阵。QC样品准备的四层浓度的0.25(量化QC样品的下限),0.30(低QC样品),20.0(中等QC样品),35.0µ克/毫升(高质量控制样品)。

2.4。样品制备过程

两个样品制备过程进行了比较。第一个是在一个简单的稀释的样本(50倍)的10µ(50.0 L的内部标准的解决方案µg / mL)和480年µL water-acetonitrile-TFA-acetic酸的混合物(85:15:0.1:0.5,v / v / v / v)为10µ我的样本。分析了离心后25.000×10分钟。第二个过程包括10的吸收µL样品的微量试样设备和2.5 - h在室温下干燥步骤和受光照;设备和样品之间的接触时间是5秒。干燥步骤后,吸附阶段的设备在500年1.5毫升超小型电子管与提取µL water-acetonitrile-TFA-acetic酸的混合物(85:15:0.1:0.5,v / v / v / v)包含内部标准溶液(1.0µg / mL)。管是vortex-mixed在室温下30分钟然后受光照和离心机(25000× )10分钟前分析。

2.5。数据分析

分析物峰地区规范化的内部标准和策划和浓度。峰面积比率之间的关系来定义和名义强力霉素浓度的矩阵,两个不同的模型进行了测试:减重或加权(i)线性回归模型(Y=一个X+b)和(2)二次回归模型(Y=一个X²+ bX+c)中,Y峰面积比和吗X是名义上的分析物的浓度。回归曲线不是被迫通过零。由此产生的方程参数用于确定“back-calculated”浓度。良好的协议添加和back-calculated校准器的浓度是统计评估。残差的正态分布(名义和back-calculated浓度)之间的区别是验证。此外,意思是剩余价值(或平均预测误差)为零(学生的计算和比较t以及);95%置信区间也确定。

2.6。验证过程

分析方法的选择性是由六种不同的分析个人来源相同的生物矩阵和没有飙升分析物和内部标准。矩阵的内源性化合物的保留时间和感兴趣的化合物相比,评价的干扰;没有干扰组件被认为在自由矩阵信号低于20%和5%,分别分析物的量化和内部标准的下限。

线性评价选择方法的校准范围选择分析六个校准曲线,验证了QC样品,由八个校准浓度水平,空白样品,样品和零(加工矩阵)3.5节中描述的模型。

量化的最低限制(LLOQ)被定义为最低浓度,可以准确的确定在80 - 120%,在日常生活中精度≤20%。LLOQ确定分析误差,每个校准曲线的最低标准(n= 6)使用。检测极限评估应用公式(一个+ 3σ_一个)/ b, a和σ_一个对应的平均和标准偏差拦截b对应的平均斜率的六个校准曲线。

我们评估within-run精密度和准确度通过分析六个QC样品在上述四个浓度对校准曲线。我们还执行between-run精密度和准确度研究:四种QC样品分析一天两次,在6个不同的日子。计算的准确性是评价(平均浓度/标称浓度)×100。精度是由百分比相对标准偏差(RSD)。

微量试样的过程中,提取回收率测定六倍的浓度低,中,高质量控制样品(n= 6 /浓度和每批矩阵)。山峰下的区域提取的QC样品相比飙升的样品萃取”来形容绝对萃取后的复苏。

遗留在调查分析物在空白样品注入并保留时间的上限量化为每个校准曲线(ULOQ) (n= 6)。

指导方针后,发生的基体效应研究。六个人不同批次的doxycycline-free矩阵从六个健康志愿者如上所述。试验进行的浓度低,中,高质量控制(n= 3 /浓度和每批矩阵)。

对于简单的稀释过程,analyte-to-internal标准峰面积比值与相应的参考标准的解决方案。微量试样的过程中,工作解决方案取代了甲醇混合物(85:15,v / v)微量试样设备吸收前一步,然后提取与分析物的混合物。

的基体效应进行了计算峰面积比率从重组获得提取(矩阵存在的离子),除以相应的峰面积比率产生的参考解决方案。基体效应值在85%和115%之间时判断接受的相对标准偏差低于15%。

评估股票的稳定性和工作解决方案的分析物和下进行保护(−80°C, 4°C)和工作(台式)条件。同样,稳定保护下的样品进行了评估(−−80°C, 20°C)和工作(在长椅上,4°C,冻结和解冻)条件。最后,处理样品在室温下的稳定性(台)和6°C (autosampler)进行了研究。整体的稳定性测试在两个浓度水平的QC样品:中低,三个复制。

2.7。强力霉素在微量试样设备上的稳定

强力霉素的稳定性研究是由尿液分析QC样品中低浓度(n= 3 /浓度)吸收在设备上对QC样品准备在上述条件下无准备地。干燥步骤后,设备被放在一个不透明的袋子一包干燥剂代理。袋子被关闭和储存在室温下或−80°C。研究的持续时间是12个月。

2.8。分析尿液样本工人在流行地区

这两种不同制备方法被用来量化强力霉素尿液样本中工人在疟疾流行地区和接受CP每天服用100毫克强力霉素每个操作系统管理。液体样本收到了冻结;他们在室温下解冻后,吸收的微量试样设备了与简单的稀释,以比较两个样品处理程序的性能与客观验证微量试样设备的潜在收益。

3所示。结果

3.1。基体效应和选择性

图1显示了典型的色谱从提取获得免费的尿液,飙升LLOQ与否与分析物。这两种方法的选择性是色谱空白矩阵,证明了代表表示,每个峰的兴趣是解决从矩阵内源性化合物;没有发现干扰。此外,没有四环素干扰观察强力霉素保留时间的信号。峰面积比率(重组提取/参考解决方案)的强力霉素分别为1.19和1.12,分别用微量试样设备和简单的稀释(RSD为11.5 -17.7%)。没有观察到的统计差异之间的三个强力霉素的浓度和方法。甚至通过轻微的基体效应(平均109%,RSD为11%,三个浓度),RSD的强力霉素/每级的CQ的比例低于15%。结果被认为可以接受的。

3.2。药物/响应关系

Interday化验测定校正曲线在不同的日子准备(n= 6)。两个方法,二次校准曲线的加权集中了最适合基于统计分析的结果。确定系数总是高于0.996。RSD值斜率分别为10.1%和15.1%的微量试样设备和稀释,分别。每个点的校准曲线,浓度是back-calculated从相应的二次方程参数,计算平均数±标准差。研究的结果发表在表2。浓度从校准曲线,获得了相对标准偏差的平均值不超过11.0%。back-calculated之间的合适浓度的美好和标称浓度统计验证:简单线性回归后,山坡上,拦截在统计学上没有不同的从1到0,分别。残差的分布是zero-centered而不是与浓度有关。此外,学习任务显示偏差没有统计学上不同于零。

3.3。准确度、精密度、提取、恢复、遗留物,量化的下限,检测

精度低于14%,精度从106%到96不等。个人研究的结果发表在表3。这些数据与所需的相关验证标准的极限。

微量试样的绝对意味着复苏方法,确定有六个复制对于每一个质量控制水平,为108.7%(意味着RSD为5.4%)。这不是统计不同浓度的范围进行了研究。内部标准,平均回收率为101.9% (RSD为,7.0%)。

大多数结果略高于100%,它可以解释为总萃取耦合由于低浓度影响吸收溶剂损失在设备上,并没有考虑到在这个计算。

这是遗留的两种方法显示控制,符合验收标准。

量化的目标下限250.0 ng / mL。在这个层次上,信号/噪声比在六个不同的个人矩阵测量范围(7.3;23.6]和[12.3;37.7),分别与微量试样设备和简单的稀释,精度与适当的精度在11.0%以下。

降低检测极限评估在166 ng / mL。

3.4。稳定

稳定的股票的解决方案被证明5天在4°C和12个月−80°C,和工作的解决方案是6小时在室温下稳定。

在重组中提取(即。,in the autosampler at 4°C awaiting analysis), no significant losses occurred after 72 h, for both simple dilution and microsampling device extraction. Precision and accuracy were in the ranges of [0.5; 6.9%] and [91.6; 97.8%], respectively.

期间避光存储和湿度后1、3、6、9和12个月,并与无准备地准备引用相比之下,强力霉素被发现在室温下稳定的1个月的两个浓度进行了研究。准确度和精密度的范围(91.0;114.6%]和[2.5;分别为13.1%)。第一个月后,观察稳定性的丧失。在3月,这个损失的药物为中低浓度高于50%和20%,分别。后的12个月里,这种退化80%和50%以上。但是,没有损失的观察药物浓度两个12个月后−80°C。在整个时期,两个浓度,平均回收率为101.7% (RSD = 6.8%)。

3.5。研究样本的志愿者经历CP

图2显示了量化值获得29个尿标本的志愿者每天服用一剂量口服强力霉素。两种分析方法的结果在统计学上相同的:直线代表浓度的一种方法与另一个,决定系数为0.933,斜率不统计不同于1,拦截不统计不同于0。

随后,微量试样设备的方法进行量化几乎100个样本。LLOQ下没有结果。最低的值都大于1.0µg / mL,在上届政府最低期望值24 h后,证明(i)所有的志愿者的抽样时执行,(2)该方法完全适合这个目的服务。

4所示。讨论和结论

摘要,两个样品处理方法对强力霉素的定量尿,一个通过简单的稀释,另用一个完美的校准微量试样设备,最常见的生物分析法验证根据指导方针。

在疟疾CP在成人中,最低预期每天24小时后过去强力霉素口服药物浓度在5 - 10µ克/毫升范围。量化的下限250.0 ng / mL和强力霉素的血浆半衰期16 h以上,最后一个药物约会可以监控四天回来。设备上的强力霉素的稳定性受光照和湿度已经证明了在室温和12个月31天−80°C。

结果样品收集的工人在强力霉素CP与两种方法类似,表明VAMS^®设备相关的集合的选择。此外,VAMS的好处^®设备,特别是没有冻结,在环境温度下样品的运输,尤其明显。容易使用,这种微量试样设备可以经常使用和扩展到其他应用程序。尽管如此,它仍将是必要的检查从部署地区航运条件不要修改设备上的药物的稳定性。

数据可用性

所有数据用于支持这项研究的发现将从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢马利克博士心滩提供尿液样本工人在流行地区(公共卫生经理,全球医学和职业卫生部门,埃克森美孚)。这项研究受到了法国公共卫生监测研究所(桑特Publique法国,格兰特CNR paludisme)。

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