VS-5584超高效液相色谱-质谱法的建立及其在大鼠体内药动学研究中的应用

摘要

VS-5584是一种小分子化合物，对mTOR和所有I类PI3K亚型均具有相同的活性，并在多种肿瘤细胞系和异种移植瘤模型中表现出临床前活性，合理结合VS-5584和其他靶向治疗在肿瘤学领域取得了良好的效果。本研究建立并验证了一种简便、灵敏的UPLC-MS/MS检测血浆样品中VS-5584的方法。VS-5584采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱分离，流动相为乙腈和0.2%甲酸水溶液(40:60)。在1.0-1000 ng/mL范围内线性良好，准确度(−13.6% < RE% < 8.8%)和精密度(CV%，小于9.2%)令人满意。将验证后的方法应用于大鼠的药代动力学研究。给药10 mg/kg后，VS-5584吸收迅速，20 min后达到峰值473.2±72.0 ng/mL。建立的方法可对VS-5584在大鼠血浆中的含量进行详细定量，可成功描述VS-5584的药动学特征。

1.介绍

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)信号通路活性的增加与许多人类癌症的生长、生存和增殖的增加有关[1］．因此，PI3K/mTOR信号通路是诱导癌细胞死亡的重要治疗靶点[2］．抑制PI3K/AKT/mTOR通路被认为是肿瘤治疗的一种治疗方法[3.- - - - - -5］．

VS-5584是一种小分子抑制剂，对mTOR和所有四种I类PI3K异构体具有相同的活性[6］．它可以渗透PC3、NCl-N87、HuH7、Colo205、MDA-MB-231等细胞，调节PI3K/mTOR信号通路下游的信号通路[7］．VS-5584可抑制黑色素瘤细胞(A-2058、A375和SK-MEL-3)的存活和增殖，诱导caspase依赖的凋亡细胞死亡在体外，并进一步抑制A375黑素瘤裸鼠口服后异种生长[8］．VS-5584通过抑制PI3K/mTOR和MAPK信号通路下调HIF-1，诱导g1期阻滞，从而抑制人骨肉瘤细胞(U2OS和MG-63)的生长α及VEGF的表达[9］．另一项研究表明VS-5584在多发性骨髓瘤细胞系中具有高度的细胞毒性，并以良好的治疗指标触发患者细胞凋亡[10］．除具有抗癌活性外，VS-5584还具有抑制血栓形成的作用在体外和在活的有机体内［11］．

此外，VS-5584和其他靶向治疗的合理组合也显示出了良好的效果[12- - - - - -15］．在一个临床前的胰腺导管腺癌异种移植模型中，与VS-5584单独治疗(28%)相比，与ERK抑制剂SCH772984联合治疗的肿瘤抑制率提高到80% [14］．此外，由于癌症干细胞(CSCs)的优先靶向性[16，17， VS-5584在小细胞肺癌异种移植模型中抑制顺铂耐药CSC生长和停止顺铂治疗后延迟肿瘤再生[16］．

虽然许多研究结果支持VS-5584的临床发展，但没有详细的VS-5584检测分析方法的报道，也没有进行药代动力学研究。LC-MS/MS被广泛应用于生物基质中小分子的检测[18，19]，建立并验证了一种简便、灵敏的超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)测定大鼠血浆中VS-5584水平的方法。同时，对成年雄性SD大鼠口服VS-5584后的药代动力学进行了研究。

2.材料和方法

２.１.材料和试剂

成年雄性SD大鼠由辽宁长生生物科技有限公司提供。VS-5584(>98.3%)和buparisib(>98.5%，内标，IS)由AZBIOCHEM生物技术有限公司(中国上海)提供。hplc级乙腈、甲醇和甲酸从Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)获得。用于超高效液相色谱分析的纯净水从娃哈哈股份有限公司(中国杭州)获得。VS-5584和buparisib的化学结构如图所示1．

２.２.仪器和UPLC-MS/MS条件

采用Acquity UPLC系统(Waters, USA)进行色谱分析，该系统配备了UPLC二元溶剂管理器、自动进样器和柱箱。通过Acquity UPLC BEH C分离出干扰物VS-5584和IS₁₈(2.1 × 100 mm, 1.7μ以乙腈和0.2%甲酸水溶液(40:60)为流动相，流速为0.20 mL/min。

分析物的质谱检测采用Waters TQ-S质谱仪(Waters，美国)进行。ms优化参数如下:以氮气为脱溶气体，流量为800 L/Hr，脱溶温度为500℃，毛细管电压为2.5 kV。的MRM转换m / z在电喷雾离子(ESI)检测下，VS-5584和IS的检测结果分别为354.78⟶312.73和410.64⟶366.65⁺)条件。优化后的VS-5584和IS的锥形电压为40 V, VS-5584和IS的碰撞能量分别为24 V和32 V。两种分析物的停留时间均为0.025 s。

２.３.库存解决方案，校准标准，和质量控制样品

将VS-5584原液和IS原液溶于甲醇中，浓度分别为1.0 mg/mL。将VS-5584原液在甲醇中进一步稀释，生成浓度范围为5.0-5000 ng/mL的工作溶液。然后,10μ将相应工作溶液的L加到50μL制备VS-5584(1.0、2.5、10、50、250、500、1000 ng/mL)定标液。质量控制(QC)样品分别在低、中、高浓度(1.0、2.0、200和800 ng/mL)下进行制备，方法相同。在乙腈中制备浓度为40 ng/mL的IS工作溶液。

２.４.样品处理

血浆样品用乙腈沉淀蛋白纯化。简单地说,50μL加300μL (IS)是工作解。搅拌1 min, 4℃900 × g离心5 min。过滤后,1μL的上清液引入UPLC-MS/MS仪器进行分析。

2．5．方法验证

所有验证程序均按照美国FDA指南执行。

在定量下限(LLOQ)下，通过比较来自6只大鼠的空白血浆样品和添加的样品来评估选择性。

通过绘制VS-5584和IS与VS-5584浓度的峰面积比得到校准曲线。1 /X²采用加权最小二乘线性回归方法，其中X代表VS-5584的浓度。校准器应小于标称浓度的±15%，但在下限时校准器应为±20%。

通过在定量上限(ULOQ)后注入空白样品，评估残留对样品浓度准确度的影响。结转金额不应超过限额的20%。

经过三次独立运行，评估了6个重复的LLOQ、低、中、高浓度QC样品的准确性和精密度。对于低、中、高QC样品，准确度(相对误差(RE%))和精密度(变异系数(CV%))应小于±15%，而LLOQ的接受标准应提高到±20%。

评价了VS-5584在6个不同样品中4个QC水平的萃取回收率和基质效应。回收率由萃取后样品的峰面积与VS-5584加标空白样品的峰面积之比计算。基质效应用萃取后添加VS-5584的空白与乙腈:水制备的相应量的VS-5584 (300: 50，v / v）.

在各种不同的条件下进行了稳定性研究。上述条件下的精度和精密度应在±15%以内。

2.6。药代动力学的应用

SPF级SD大鼠(雄性，215-235 g)饲养于温控室内。适应5天后，6只大鼠口服VS-5584 (10 mg/kg)以评估其药动学特征。给药时，先将VS-5584溶于DMSO中，加入PEG-400，再用水稀释至浓度为1.0 mg/mL(混合溶剂含5% DMSO, 20% PEG-400, 75%水)。分别于给药后5、10、20、30、45 min和1、2、4、6、8、10、12 h从眶下静脉采血。血液标本800 × g离心5分钟后获得血浆，在−25°C下保存至分析。所有药动学参数均采用Phoenix WinNonlin软件(8.0版)基于非室型模型计算。

3.结果与讨论

３.１.方法优化

为了获得良好的质量响应，分别用注射器泵将VS-5584和IS直接注入质谱。由于VS-5584和IS是含氮化合物，因此在正电离模式下获得了更好的响应。离子米/zVS-5584和IS分别检测出354.78和410.64为前体[M + H]⁺和一个米/zVS-5584的312.73和IS的366.65被定义为产物离子，因为它们是质谱中最丰富的产物离子²分别扫描光谱。此外，电离m / zVS-5584为354.78→312.73,IS为410.64→366.65。IS的MRM反应与以前的报告一致[18，19］．

为获得合适的保留时间和较高的检测灵敏度，对流动相体系在乙腈、甲醇和水中酸的比例进行了测定。乙腈作为流动相中的有机相，在IS通道中实现了更平滑的基线。然后，选择40%乙腈，而流动相中选择35%和30%乙腈，总运行时间为3.0 min。随后，以乙腈和含0.2%甲酸(40:60)的水的混合物为流动相体系，流速为0.20 mL/min。

为了简化样品处理，在处理前先沉淀血浆蛋白。以乙腈和甲醇为提取溶剂。在两种溶剂中均获得了满意的回收率，但乙腈产生的IS峰形状更薄。

３．２．方法验证

3.2.1之上。选择性

空白样品在VS-5584 (2.32 min)和IS (1.45 min)保留时间内无内源性干扰物质，表明该方法具有足够的选择性。图中为空白血浆、VS-5584和大鼠血浆中IS的代表性MRM色谱图2．

3.2.2。线性，LLOQ和结转

在大鼠血浆中，VS-5584的标定曲线在1.0-1000 ng/mL范围内呈良好的线性关系(典型方程:y= 0.03554x+ 0.00632,r= 0.9977)。定量限为1.0 ng/mL。

进样后，在VS-5584和IS的保留时间内，空白样品中未检出明显的色谱峰;因此，在这种方法中没有发现结转。

3.2.3。准确度和精密度

如表所示1对于低、中、高qc, VS-5584的准确率在−9.5% ~ 7.0%之间，而对于LLOQ，准确率在−13.6%以内。VS-5584的日内和日间精密度小于9.2%，其他QC浓度水平的精密度为4.8% ~ 5.9%。

3.2.4。恢复与基质效应

VS-5584和IS在大鼠血浆中的加标回收率均大于89.3%。表格1显示了VS-5584的四个QC级别获得的平均矩阵效应。提示基质效应对大鼠血浆VS-5584检测无明显干扰。

3.2.5。稳定性

表格2总结了VS-5584存放后在低、中、高QC水平下的稳定性数据。VS-5584在−25°C下稳定30天，在室温下稳定12小时，在大鼠血浆中经过三次冻融循环后稳定。处理后的样品在4°C自动进样器中保持完整12小时。

3.3。药代动力学的应用

首次成功应用所建立的方法研究了VS-5584口服10mg /kg后在大鼠体内的药动学行为。血浆VS-5584浓度的时间历程如图所示3.．VS-5584吸收迅速，给药20 min后达到峰值473.2±72.0 ng/mL。VS-5584呈双指数分布。VS-5584血浆浓度在给药后2.0 h迅速衰减，在at_1／2为3.28±1.37 h。AUC_0⟶12h, AUC_0⟶∞分别为865.2±192.1和928.8±228.0 h ng/mL。V_z/F和CL/F分别为54.1±29.6 L/kg和11.3±2.5 L/h/kg。

4.结论

据我们所知，我们首次建立并验证了一种简便、灵敏的UPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中VS-5584的含量。应用所建立的分析方法，成功地描述了VS-5584口服给药后的大鼠药动学特征。所建立的方法适用于今后的药代动力学研究和药物相互作用研究等临床前和临床研究。此外，该方法可作为高通量生物测定方法的建立和对人血浆中VS-5584的治疗性监测的参考。

数据可用性

与这些发现相关的所有数据都包含在手稿中。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究由沈阳医学院科技基金项目(20191035)资助;辽宁省自然科学基金(20180550126);中国博士后科学基金(2017M621162)。

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