JAMC 分析方法在化学杂志》上 2090 - 8873 2090 - 8865 Hindawi 10.1155 / 2020/8811522 8811522 研究文章 发展UPLC-MS / MS方法量化的vs - 5584和老鼠在药代动力学研究中的应用 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9759 - 3380 周 Chunling 1 李 Xiaoxin 1 他 航 1 刘 天柱山 1 田 Jinmiao 1 江 美华 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 1462 - 5055 方 莉娜 2 时 克里希纳K。 1 辽宁研究所药物控制 辽宁检验 考试和认证中心 沈阳110035 中国 2 药学院 沈阳医学院 沈阳110034 中国 symc.edu.cn 2020年 17 12 2020年 2020年 21 9 2020年 4 11 2020年 5 12 2020年 17 12 2020年 2020年 版权©2020 Chunling周et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

vs - 5584是一种小分子化合物显示等效活动对mTOR类我PI3K亚型和证明临床活动在不同肿瘤细胞系和异种移植肿瘤模型中,和理性的结合vs - 5584和其他目标疗法在肿瘤取得承诺的结果。在目前的研究中,我们建立和验证了一个简单的和敏感UPLC-MS / MS法测定血浆样品的vs - 5584。vs - 5584分离通过Acquity UPLC本·C18柱,流动相乙腈和0.2%甲酸水(40:60)。显示的校准曲线的线性范围为1.0 -1000 ng / mL,满意的精度(−13.6% <再保险% < 8.8%)和精密(CV %,低于9.2%)。然后验证方法应用到老鼠体内药代动力学研究。后管理10毫克/公斤,vs - 5584吸收迅速,达到浓度峰值为473.2±72.0 ng / mL后20分钟。量化的方法允许建立大鼠血浆的vs - 5584细节,可以利用成功描述vs - 5584的药动学特征。

 沈阳医学院的科学技术基金项目 20191035 辽宁省自然科学基金 20180550126 中国博士后科学基金会 2017年m621162 1。介绍

磷酸肌醇的活动增加3-kinase (PI3K) /哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)信号通路与增长,增加有关生存和增殖在许多人类癌症( 1]。因此,PI3K / mTOR信号通路是一个重要的治疗目标诱导肿瘤细胞死亡( 2]。的抑制mTOR / PI3K / AKT途径被认为是治疗肿瘤的治疗方法( 3- - - - - - 5]。

vs - 5584是一种小分子抑制剂显示等效活动对mTOR和所有四个类我PI3K亚型( 6]。它可以渗透细胞,包括生物、NCl-N87 HuH7, Colo205,和mda - mb - 231,调节信号通路下游的PI3K / mTOR通路( 7]。vs - 5584显示抑制黑色素瘤细胞的生存和增殖(A375 - 2058,和SK-MEL-3),诱导caspase-dependent凋亡细胞死亡 在体外,进一步抑制A375黑色素瘤裸鼠异种移植增长后口服( 8]。治疗vs - 5584抑制人类骨肉瘤细胞(U2OS和mg - 63)增长诱导g1期通过抑制PI3K / mTOR逮捕和MAPK信号通路下调HIF-1 α和VEGF表达( 9]。另一个研究表明,vs - 5584在多发性骨髓瘤细胞株高细胞毒性,引起患者细胞凋亡与良好的治疗指数( 10]。除了抗癌活性,vs - 5584抑制血栓形成也报道了 在体外和 在活的有机体内( 11]。

此外,rational vs - 5584和其他靶向治疗取得了可喜的成果 12- - - - - - 15]。在胰腺导管腺癌的临床异种移植模型,联合治疗的ERK抑制剂SCH772984增加了肿瘤抑制率仅80% vs - 5584治疗(28%)( 14]。此外,由于优惠针对癌症干细胞(二者)[ 16, 17),vs - 5584抑制有顺铂耐药性CSC增长和延迟停止顺铂治疗后肿瘤再生在异种移植模型的小细胞肺癌 16]。

尽管无数的发现支持vs - 5584的临床开发,没有具体的分析方法vs - 5584的检测报告,并没有进行药代动力学研究。质/女士广泛用于检测小分子在生物矩阵( 18, 19),我们建立和验证了一个简单的和敏感ultraperformance液相色谱-光谱法(UPLC-MS / MS)测定方法的量化vs - 5584在大鼠血浆水平。口服后的药动学特征的vs - 5584成年男性的雄性SD大鼠(SD)中也被调查。

 2。材料和方法 2.1。材料和试剂

成年雄性SD大鼠提供由辽宁昌盛生物技术有限公司有限公司(中国本溪,)。vs - 5584(> 98.3%)和buparlisib(内部标准,> 98.5%)AZBIOCHEM生物技术有限公司提供的有限公司(上海,中国)。HPLC-grade乙腈、甲醇和甲酸得到费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。UPLC分析获得娃哈哈的纯净水有限公司(杭州)。vs - 5584和buparlisib的化学结构显示在图中 1。

光谱化学结构、前兆和产品。vs - 5584 (a)和(b) Buparlisib,。

 2.2。仪器和UPLC-MS / MS条件

美国的Acquity UPLC系统(水),配备了UPLC二元溶剂经理,一个autosampler和柱温箱,是用于色谱分析。vs - 5584和分离从干扰内源性化合物通过Acquity UPLC本·C18(2.1×100毫米,1.7 μ米粒子直径、水域,美国)列在25°C,组成的流动相乙腈和水(40:60)0.2%的甲酸流量为0.20毫升/分钟。

的质谱检测分析物进行一个水域TQ-S质谱仪(水域,美国)。MS-optimized参数列出如下:氮作为反溶剂气体流量为800 L /小时,反溶剂温度设定在500°C,和毛细管电压为2.5伏特。MRM的转换 m / z354.78⟶312.73 vs 366.65 - 5584和410.64⟶监控在积极的电喷雾离子(ESI+)条件。锥优化电压vs - 5584和40 V,和碰撞能量vs - 5584 V和24 V, 32,分别。这两个分析物停留时间为0.025。

 2.3。股票的解决方案,校准标准和质量控制样品

股票的解决方案的vs - 5584和溶解在甲醇获得浓度为1.0 mg / mL,分别。原液的vs - 5584甲醇生成工作进一步稀释溶液的浓度范围5.0 -5000 ng / mL。然后,10 μL相应的工作解决方案添加到50 μL无毒鼠等离子体生成校准标准的vs - 5584(1.0, 2.5, 10、50、250、500和1000 ng / mL)。质量控制(QC)样本准备LLOQ,低,中,高浓度(1.0,2.0,200和800 ng / mL)分别以同样的方式。正在解决方案准备在乙腈浓度40 ng / mL。

 2.4。样品处理

等离子体被蛋白质纯化样品用乙腈沉淀。简单地说,50 μL与300年增加了大鼠血浆 μL(工作的解决方案。这个混合物是涡前1分钟在900×g离心5分钟在4°C。过滤后,1 μ介绍了L的上层清液UPLC-MS / MS仪器进行分析。

 2.5。方法验证

所有验证过程进行了美国FDA的指导方针。

选择性是评估通过比较空白血浆样本6个人老鼠的飙升下限样品定量(LLOQ)。

校准曲线被绘制峰面积比获得vs - 5584和反对vs - 5584的浓度。1 / X2利用加权最小二乘线性回归方法,” X“代表vs - 5584的浓度。校准器应该小于±15%的名义浓度,除了在校准器的LLOQ应±20%。

延滞的准确性的影响样品浓度被注入空白样品评估定量上限后(ULOQ)。LLOQ的延滞不应超过20%。

QC样品在LLOQ,低、中、高浓度六个复制和评估在三个独立运行评估准确度和精密度。低、中、高质量控制样品,准确性(相对误差(RE %))和精密(变异系数(CV %)应小于±15%,在验收标准增加了LLOQ±20%。

提取复苏和基体效应的vs - 5584在六个不同的样品进行评估四个质量控制水平。复苏的峰面积的比值计算提取样本的空白与vs - 5584 postextraction飙升。矩阵表达的影响是空白的比例飙升vs - 5584 postextraction的相应数量的vs - 5584准备在乙腈:水(300:50, v / v)。

稳定性研究在各种不同的条件下进行。准确度和精密度在上述条件下应该在±15%。

 2.6。药代动力学的应用

SD大鼠的SPF级(男,215 - 235 g)都保存在一个专用房间。适应5天后,六大鼠口服治疗vs - 5584(10毫克/公斤)来评估药动学特征。管理vs - 5584首次在DMSO溶液溶解,添加peg - 400,并进一步稀释水获得浓度为1.0毫克/毫升(包含5% DMSO溶液的混合溶剂,20% peg - 400和75%水)。从亚轨道静脉血样采集5、10、20、30日和45分钟和1,2,4,6,8,10,12 h后剂量。等离子体使离心后获得血液样本800 g×5分钟和存储−25°C到分析。所有药代动力学参数计算基于noncompartmental模型与凤凰WinNonlin软件(版本8.0)。

 3所示。结果与讨论 3.1。方法优化

得到一个良好的质量响应,vs - 5584和被直接注入到质谱仪注射泵,分别。更好的积极反应实现电离模式vs - 5584和含氮化合物。离子 米/ z354.78 vs - 5584和410.64的检测是前体[M + H]+和一个 米/ z312.73 vs - 5584和366.65的是被定义为产品的离子,这些离子是最丰富的产品的2分别扫描光谱。此外,电离的 m / z354.78→312.73 vs - 5584和410.64→366.65是稳定,重现性好。MRM的反应是与先前的报道是一致的 18, 19]。

获得合适的保留时间和检测灵敏度高,流动相体系确定乙腈、甲醇、和比例的酸水。有机相的流动相乙腈,达到平滑基线的通道。然后,选择乙腈40%,35%和30%相比,流动相乙腈,导致总运行时间为3.0分钟。随后,乙腈和水的混合物含有0.2%甲酸(40:60)0.20毫升/分钟的流量被选为流动相系统。

为了简化样品处理,治疗前血浆蛋白被沉淀。乙腈和甲醇作为提取溶剂进行了测试。满意的复苏是获得两个溶剂,但乙腈稀释剂是峰的形状。

 3.2。方法验证 3.2.1之上。选择性

空白样品是免费的内源性干扰物质保留时间的vs - 5584(2.32分钟),是(1.45分钟),表明足够的该方法的选择性。代表MRM色谱空白血浆,vs - 5584,图中给出的是在大鼠血浆 2。

代表色谱:(a)空白血浆样本;(b)空白血浆样本中掺入vs - 5584 (LLOQ);和(c)大鼠给药后血浆样本收集0.5 h。

 3.2.2。线性、LLOQ和移行

在大鼠血浆,校准曲线的vs - 5584具有良好线性范围的1.0 -1000 ng / mL(典型的方程: y= 0.03554 x+ 0.00632, r= 0.9977)。LLOQ决心是1.0 ng / mL。

ULOQ注入后,没有明显的色谱峰保留时间的空白样本中,检测出vs - 5584和;因此,在此方法中,没有发现结转。

 3.2.3。准确度和精密度

如表所示 1的准确性vs - 5584在三个独立的运行范围从−9.5%至7.0%为低,中,高质量,在LLOQ−13.6%。vs - 5584的盘中、interday精度LLOQ不到9.2%,和其他质量浓度4.8% - 5.9%的水平。

精密度、准确度、基体效应和复苏的vs - 5584进行分析大鼠血浆( n= 6)。

飙升的浓度(ng / mL) 盘中精密简历(%) Interday精密简历(%) 准确性(RE %) 平均数±标准差矩阵效果(%) 恢复(%,平均±标准差)
1.0 9.2 8.0 −13.6 93.3±6.9 92.4±5.5
2。0 5.9 7.0 −9.5 105.3±6.2 92.0±4.4
200年 4.8 7.0 8.8 94.1±1.8 89.4±3.9
800年 5.5 5.3 8.2 98.8±1.9 90.8±3.9
是 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 90.3±9.8 89.3±3.8
3.2.4。复苏和基体效应

复苏的vs - 5584和比例上升在大鼠血浆被发现要大于89.3%。表 1显示了平均获得的基体效应四个QC的vs - 5584水平。这些数据表明,没有可衡量的基体效应干扰的vs - 5584检测大鼠血浆。

 3.2.5。稳定性

表 2总结了vs - 5584在低的稳定性数据,存储后介质和高质量控制水平。vs - 5584稳定在−25°C 30天,在室温下12 h和三个冻融循环后大鼠血浆。处理过的样品完好无损在4°C的autosampler 12 h。

稳定的大鼠血浆vs - 5584 ( n= 3)。

条件 vs - 5584
上升(ng / mL) 再保险(%) 简历(%)
30天在−25°C 2。0 9.4 8.7
200年 −12.2 12.5
800年 −5.7 5.0
三个冻融循环 2。0 −6.5 6.6
200年 −6.5 5.6
800年 7.4 5.9
在室温下12 h 2。0 −7.0 8.2
200年 10.7 7.7
800年 9.2 5.8
4°C autosampler 12 h在加工样品 2。0 −8.7 5.4
200年 10.4 8.7
800年 9.9 4.8
3.3。药代动力学的应用

既定的方法首次成功应用研究的药代动力学行为vs - 5584后大鼠口服10毫克/公斤。时间的等离子体vs - 5584浓度如图 3。vs - 5584吸收迅速,达到一个峰值浓度为473.2±72.0 ng / mL药品管理局后20分钟。vs - 5584展出biexponential处置。vs - 5584迅速腐烂的血浆浓度2.0 h政府和慢慢消除 t1/23.28±1.37 h的晚期阶段。AUC0⟶12h,AUC0⟶∞被发现是865.2±192.1,928.8±228.0 h ng / mL,分别。 Vz/ F和CL / F被发现是54.1±29.6 L /公斤和11.3±2.5 L / h /公斤,分别。

意味着血浆浓度时间剖面的vs - 5584 ( n= 6)。

 4所示。结论

据我们所知,我们首次建立和验证了一个简单的和敏感UPLC-MS / MS法测定大鼠血浆的vs - 5584。建立分析方法被成功地应用于描述的药动学特征vs - 5584在大鼠口服后。建立的方法适用于未来的临床前和临床研究药代动力学等研究和药物之间的相互作用的研究。此外,建立的方法可以用作参考开发高通量生物测定和治疗监测的vs - 5584在人类血浆。

 数据可用性

这些发现是相关的所有数据包括在手稿中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项研究是为科技基金资助项目的沈阳医学院(20191035);辽宁省自然科学基金(20180550126);和中国博士后科学基金会(2017 m621162)。

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