化学分析方法杂志
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化学分析方法杂志/2020/文章

研究文章|开放获取

体积 2020 |文章的ID 5165631 | 14 页面 | https://doi.org/10.1155/2020/5165631

UPLC/ESI-Q-TOF质谱法鉴定、分析益智颗粒和食蟹猴血浆中成分及其对PC12细胞的保护作用

Erwei郝那1那2那3. 剑锋秦那1那2 魏魏那1那2 Jianhua苗那3. 燕谢那1那2 翔龙锅那1那2 Hangxuan吴那1那2 金陵谢那1那2 Xiaosu风扇那4. 杜主任张平那1那2那3. 仙桃侯那1那2那3. 和 两地邓1那2那3.

1广西中医药大学广西中药药效研究重点实验室，广西南宁530200

2广西中医药大学农业残留功能成分研究协同创新中心，广西南宁530200

3.邮政编码工作站，广西医药植物机构，南宁530023

4.广西大学农学院实验中心，广西南宁530005

学术编辑器:卢卡·戈拉
收到了 2019年12月17日
公认 20月28日
发表 09年4月20日

摘要

益智颗粒是一种含有六种中药成分的保健食品。在大鼠实验中，它能改善记忆障碍。在这里，我们描述了第一个快速和灵敏的超高效液相色谱/电喷雾电离四极杆飞行时间质谱(UPLC/ESI-Q-TOF MS)分析血浆中YZG的方法。我们将此技术用于食蟹猴血浆的研究。通过比较对照品的保留时间、质谱(MS)、质谱/质谱(MS/MS)数据，共检测到70种化合物。共鉴定出63种，其中皂苷60种，黄酮2种，甲酯1种。血浆中总皂苷33种，黄酮1种，甲酯1种。其次，为研究YZG的治疗特性，以A致PC12细胞损伤评价部分吸收成分的神经保护作用β25 - 35模型。结果表明，9种化合物均能保护PC12细胞免受Aβ25 - 35细胞生存能力(%)为111.00±8.12 (G-Rb1), 102.20±4.22 (G-Rb2), 100.34±6.47 (G-Rd), 102.83±2.10 (G-Re), 101.68±7.64 (NG-Fa), 101.19±7.83 (NG-R1), 102.53±0.55 (NG-R2), 106.88±4.95 (gypenoside)和103.95±4.11 (gypenoside XLIX),分别与对照组(87.51±6.59)。这些结果可以揭示YZG的真实药效学基础，为后续研究提供理论基础。也可为阿尔茨海默病的研究提供一些参考。

1.介绍

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的慢性进行性神经退行性疾病，可导致记忆障碍、精神分裂症、行为人格退化、残疾和过早死亡[1-3.］.中国65岁及以上人群AD患病率为3.21% [4.，目前中国有700多万人患有AD [5.］.老年痴呆症不仅是一个严重的老年人健康问题，也是一个严重的社会问题。这是全球关注的问题。因此，开发预防和治疗AD的新药至关重要。淀粉样蛋白假说是AD发病的主要模式，并指导潜在治疗方法的发展。所有AD患者均为进行性β- -Myloid沉积，然后是脑区中围绕神经炎和神经神经病理学的脑区，服务于记忆和认知[6.］.

中药（TCM）在治疗中国疾病中起着至关重要的作用。这是新药开发的重要来源。中草药的许多组分如人参皂苷Re（G-Re）[7.]，g-rg3 [8.]，黄芩苷，G-RB1 [9.], G-Rg1 [10]和G-Rf [11研究表明对治疗AD有积极作用。YZG是由6种中药组成的保健食品，包括人参c.a最大经济产量,田七(博克)陈凤华，绞股蓝皂(研究)。牧野,eBimedium brevicornu.格言。oxyphylla成分miq。，和桑属阿尔巴L.它被CFDA批准为健康食品，2012年12月发布了2个中国专利。

我们最近在动物实验中发现YZG可以改善记忆屏障，并且YZG可以保护PC12免受A蛋白的损伤β25 - 35[12-15];然而，其有效成分尚不清楚[16］.中药虽然含有多种成分，但只有部分成分能被血液吸收，发挥生物活性。因此，血浆中发现的成分可能是最活跃的。

食蟹猴是非人类灵长类动物，在遗传学和病理生理学上与人类相似;因此，它们是一个有用的临床前模型[17那18］.因此，我们采用该模型对中药进行评价。

TCMS通过多个组件发挥其效果。分析化学成分是了解TCMS治疗性质的关键步骤。超细液相色谱 - 质谱（UPLC-MS）方法已成为分析TCMS化学成分的主要工具，因为它提供高速，可测量的质量范围，分辨率高比率，以及同时定性分析的能力也广泛应用于分析在活的有机体内代谢物。例如，UPLC-QTOF-MS技术用于识别大鼠生物样品中吸收的成分及其代谢产物[19]，并在随后的研究中，使用ESI/APCI多模电离源进行LC-MS分析，以便在单次运行中鉴定皂苷苷和皂苷苷元[20.］.在其他研究中，基于LC-DAD-MS和UPLC-DAD-QTOF-MS方法，也进行了草药的化学成分、代谢和药动学研究[21那22］.因此，我们建立了用于分析YZG的化学成分的UPLC / ESI-Q-TOF MS方法和Cynomolgus猴子等离子体中的吸收成分。此外，所诱导的AD细胞模型β-淀粉样蛋白用于检测吸收成分对神经细胞的保护作用。本研究的实验设计和工作流程如图所示1．


图1
本研究的实验设计和工作流程。

2.材料和方法

2．1.化学品，试剂和样品

uplc级乙腈购自默克公司(德国达姆施塔特)。甲酸购自Sigma-Aldrich (Mo, USA)。亮氨酸脑啡肽来自Waters公司(Milford, MA, USA)。蒸馏水取自华臣氏食品饮料(中国广州)。

PC12细胞购自江苏科创生物技术有限公司(南京，中国)。人参皂苷Rb1，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb3，人参皂苷Rc，人参皂苷Rd，人参皂苷Re，人参皂苷Rf，人参皂苷Rg1，三七皂苷R1, 20(S.)三七皂苷R2、三七皂苷Fa、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX购自成都Must生物科技有限公司。20 (S.)、人参皂苷Rb2、加兰他明HBr、小檗碱购自中国北京国家食品药品监督管理局。化合物的结构如图所示2．Dulbecco的改良Eagle Medium（DMEM）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自江苏威根生物科技公司（南京）。胎儿牛血清（FBS），胰蛋白酶和二甲基亚甲醚（DMSO）购自Gibco（Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，Ma，USA）。淀粉片β-protein fragment 25-35购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。YZG由广西万寿堂药业有限公司生产，用水配制成悬浮剂。

(一)
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图2
yzg可能有效化合物的化学结构。
２.２.动物和治疗

六只健康雄性食蟹猴(猕猴属筋膜；7岁，7.0±1.0 kg)，来自广西食蟹药材应用工程技术研究中心(广西省)。所有实验均按照中华人民共和国国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》进行。实验动物方案经广西中医药大学动物伦理委员会批准，所有程序均按相关规定和指南执行。

每只猴子被安置在一个悬挂的不锈钢笼子中，并在标准的12小时光照/12小时黑暗周期下进行维护，并免费获得水。动物室保持在24-26°C，相对湿度50%-70%。实验前，每天三次给猴子喂食经认证的灵长类动物颗粒饲料。按照标准做法，定期补充水果的营养。

２.３.血浆样品制备

除水外，六只食蟹猴猴子禁食12小时。每只猴子以79.6g / kg体重的剂量口服给予yzg。通过肠道饲喂剂量在给药后通过静脉穿刺2小时收集2毫升血液。然后在4℃下以3000rpm / min将血液在3000rpm / min离心10分钟。将甲醇（3mL）放入等离子体中并涡旋1分钟，然后在4℃下以12000rpm / min离心10分钟。通过固相萃取纯化上清液。将纯化的液体在45℃下在氮气下干燥。残留物溶解在100 μ.取70%甲醇，12000 rpm/min, 4℃离心10min;上清液作为血浆样本。

２.４.仪器和条件
2.4.1。色谱分析

分离过程由水域Acquity UPLC I-Class系统（Waters Corporation，Milford，Ma，USA）进行，具有MassLynx V4.1的受控软件。流动相由溶剂A（HCOOH：H2o = 0.1: 100，v / v）和溶剂B（CH3.CN);梯度洗脱程序为:0-1 min, 10%B;1 - 14分钟,10% - -100% b;和14-17分钟，100% B，流速0.3 mL/min。样品溶液进色谱系统的体积为1μ.L，并在40℃下进行所有分离。

2.4.2。女士的条件

质谱分析采用Xevo G2-XS飞行时间质谱仪，结合ACQUITY UPLC i级系统(Waters Corporation, Milford, MA, USA)。ESI-MS/MS实验在MS中进行E.在负模式下获取碎片的模式。MS条件优化如下:采集质量范围为100 ~ 1500 Da，扫描时间为0.5 s;毛细管电压2.0 kV;采样锥电压为50.0 V;源温度为100℃;脱溶温度为350℃;锥气流量50.0 L/Hr;脱溶气流量700.0 l/Hr。连续收集数据，在采集过程中使用外参(LockSpray)校正质量，其中0.2 ng/mL的leucine脑啡肽溶液以20的流速注入μ.L / min通过锁定PRAY界面在554.2615DA（[M-H]）处产生参考离子−）.质心模式收集的所有数据均使用MassLynx V4.1软件(Waters Corporation, Milford, MA, USA)获取。

2．5．主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

使用MassLynx V4.1软件中的marklynx Application Manager对所有血样进行UPLC-TOF MS、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)原始数据峰检测。峰检测质量窗为0.05，保留时间窗为0.2，强度阈值为50。采用Pareto方法作为PCA和OPLS-DA的数据标准化方法。然后，我们从OPLS-DA的s图中选取满足以下条件的信号:X设在> 0.001和y-axis >0.8作为标记。

2.6。吸收成分的鉴定

我们将标记的保留时间和质量数据与药草数据进行了比较，并选择了与匹配的数据。与此同时，我们在等离子体样品的质谱数据中搜索了药草中的原始成分。然后，我们分析了这些数据的二级质谱信息，并基于片段离子提供的信息识别它们的化学结构。

2.7。细胞培养和MTS比色法测定

PC12细胞在DMEM(江苏科创生物技术股份有限公司;中国南京)补充10%胎牛血清，在37°C下添加5% CO2．将对数生长期的PC12细胞接种于384孔板(3 × 10)4.37℃孵育24小时。接下来,100年μ.将空白培养基的L加入正常对照组;100年μ.L培养基含30μ.米一个β25 - 35加入模型对照组;100年μ.L培养基含30μ.米一个β25 - 35和250年μ.g/mL YZG提取液加入YZG组。氢溴酸加兰他明组100μ.L培养基含30μ.米一个β25 - 35和30μ.克/毫升氢溴酸加兰他敏。盐酸小檗碱组100μ.L培养基含30μ.米一个β25 - 35和12.5μ.克/毫升盐酸小檗碱。其他组用Aβ25 - 35部分被吸收的成分分别给100μ.L培养基含30μ.米一个β25 - 35和25μ.g / mL组件。各组均孵育48 h。各组DMSO体积分数均不高于0.5%，每组设置3个重复孔。随后,10μ.每孔加入L MTS (1.90 mg/mL)， 37℃孵育24 h。在480 nm处用分光光度计(多模平板阅读器EnVisionXcite;PerkinElme公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)。细胞活力测定公式如下:细胞活力(%)= [OD 480nm(药物)/OD 480nm(对照)]× 100%。OD表示光密度。

2.8。统计分析

所有数据均以至少三次独立实验的平均值±标准误差表示。采用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad software, Inc.， La Jolla, CA, USA)进行数据分析。统计学意义也通过双向方差分析确定。

3.结果

3．1.UPLC/ESI-Q-TOF质谱条件的优化

通过优化色谱柱类型、温度和流动相，对YZG组分进行了分离。ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm, 1.7μ.M，Waters Corporation，USA）被选为实验。它提供了良好的分辨率。为了最小化峰宽和最大化信号强度，研究了包括乙腈和甲醇，几种水性缓冲液，流速和柱温的有机溶剂。最后，获得了最佳分离条件。优化MS条件以最大化响应：毛细管电压，毛细管温度，碰撞能和气流。在负电离模式中，所有YZG分析物（提取物和血浆）显示出高灵敏度。

3.2。UPLC / ESI-Q-TOF MS分析YZG样品和猴子猴等离子的成分

YZG样品的总离子电流如图所示3.．采用UPLC/ESI-Q-TOF质谱技术检测到YZG中70个峰;通过保留时间、质谱(MS)和质谱/质谱(MS/MS)数据与文献进行比较，鉴定出63个化合物。经鉴定的化合物见表1．

(一)
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(b)
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(c)
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图3
YZG的TIC色谱图(a)，食蟹猴口服YZG后的血浆样品(b)，阴性模式下的空白血浆(c)。
不。 Rt 公式 [M + HCOO]−（m/Z.） [m-h]−（m/Z.） 片段离子（m/Z.） CMP 复合名称 参考
1 3.42 C42H72O.15 861.4843 815.4784 653.4254, 491.2235, 463.0880 √ Notoginsenoside米 [23]
2 3.62 C27H30.O.16 609.1816 300.0555 √ 芦丁 [24]
3. 3.72 C8.H8.O.5. 183.0308 124.0211 √ 没食子酸甲基酯 [25]
4. 4.22 C48H82O.19 1007.5439 961.5380 997.5126, 799.4825, 637.4305, 475.1966 √ Notoginsenoside R3 / R6/20-O-Glucoginsenoside射频 [23]
5. 4.28 C40H70O.8. 723.5082 677.5007 740.4865, 475.1963, 417.1550, 284.0329 未知的
6. 4.47 C43H83O.12 836.5914 790.5905 853.5441 未知的
7. 4.55 C48H82O.19 1007.5439 961.5406 997.5145, 799.4846, 637.4318, 475.3790 √ Notoginsenoside R3 / R6/20-O-Glucoginsenoside射频 [23]
8. 4.57 C32H38O.15 707.2444 661.2957 1323.5775, 724.2191, 499.1783 Baohuoside一 ∆
9. 4.61 C47H80O.18 977.5385 931.5317 799.4850, 637.4321, 475.3785 √ Notoginsenoside R1 [26]
10 4.81 C48H82O.18 991.5449 945.5477 799.4883, 637.4339, 619.4214, 475.3792 √ 人参皂苷是 [27]
11 4.85 C42H72O.14 845.4936 799.4833 637.4339, 475.3792 √ 人参皂苷Rg1 [27]
12 5.24 C39H50O.20. 883.2853 837.2800 675.2280, 529.2005, 513.1791, 367.1183 Epimedin A1 ∆
13 5.29 C15H10O.7. 301.0683 273.0429、245.0488、229.0532、179.0065、151.0179、121.0346 槲皮素 ∆
14 5．31 C38H48O.19 807.2960 645.2173, 513.1818, 366.1090 epimedin b. ∆
15 5.38 C38H50O.19 867.2896 821.2642 659.2647、513.1761、366.1201、351.0912、323.0849、151.0094、106.6611 epimedin c. ∆
16 5.40 C38H50O.19 867.3390 821.2833 659.2668, 366.1226 epimedin A. ∆
17 5.53 C27H30.O.10 513.1833 367.1188、351.0876、323.0917、151.0109、145.0312 同分异构体(47） ∆
18 5.53 C33H40O.15 721.2323 675.2302 529.1712, 513.1846, 367.1266 icariin. ∆
19 5.64 C48H82O.19 1007.5430 961.5372 799.4822, 637.3738 √ Notoginsenoside N / R6 [28]
20. 5.67 C54H92O.23 1153.6027 1107.5963 945.5418、799.4827、637.4309、475.1394、 人参皂苷Re8 [29]
21 5.90 C59HOne hundred.O.27 1285.6840 1239.6516 1107.5920、945.5372、783.4835、621.4189、459.3343 √ Notoginsenoside足总 ∆
22 6.09 C42H72O.14 845.4875 799.4935 637.4294, 619.5074, 475.3772 √ 人参皂苷射频 [28]
23 6.11 C54H92O.23 1153.6823 1107.6227 945.5391、783.4855、621.4235、459.3650 √ 人参皂苷Rb1 [30.]
24 6.21 C52H86O.21 1091.5645 1045.7167 913.5291、751.4626、605.4065、473.3609、 √ Gypenoside XLIX ∆
25 6.26 C53H90O.22 1123.5693 1077.6210 945.5375,783.4875 √ 人参皂苷Rc [30.]
26 6.28 C41H70O.13 815.4929 769.4709 637.4373, 619.4420, 475.3855 √ 20（s） - 诺替辛甙R2 ∆
27 6.33 C41H70O.13 815.4812. 769.4928 637.4339, 475.3815 √ Notoginsenoside R2 / F3 / F5 [28]
28 6.40 C63H106O.30. 1341.5354 1209.6248,1077.5825,945.5411,783.4882,621.4359,459.3843 √ Notoginsenoside问 [28]
29 6.41 C48H76O.19 955.4913 793.4395, 569.3852 √ 人参皂甙RRO [31]
30. 6.42 C53H90O.22 1123.5911 1077.5951 945.5395、783.4940、621.4150、459.3434 √ 人参皂苷而已 [28]
31 6.44 C53H90O.22 1123.5911 1077.5911 945.5429, 783.4907, 459.3839 √ 人参皂苷Rb3 [28]
32 6.46 C42H72O.13 829.5134 783.5062 637.4319,619.4190,475.3806 √ 20（s） - 喹啉基RG2 [30.]
33 6.50 C41H70O.13 815.4929 769.4709 637.4373, 619.4420, 475.3855 20 (R) -Notoginsenoside R2 ∆
34 6.56 C36H62O.9. 683.4399 637.4317 475.3788 20 (S)人参皂苷Rh1/20 (R)人参皂苷Rh1 [28]
35 6.56 C42H72O.13 829.4958 783.4899 637.4317, 475.3788 √ 20（r）-ginsenoside RG2 [30.]
36 6.59 C56H94O.24 1195.6116 1149.6077 1107.5959、945.5424、783.4896、637.4297、475.3786 √ Yesanchinoside F [32]
37 6.85 C48H82O.18 991.5511 945.5786 783.4921, 621.4363, 459.3667 √ 人参皂苷Rd [28]
38 6.98 C51HOne hundred.O.30. 1237.6125 1191.6177 1029.5610, 915.5285, 637.4301, 475.3689 未知的
39 7.21 C52H86O.21 943.5059. 897.5676 765.4807、751.4272、681.4173、619.3864、487.3429 √ Gypenoside一 ∆
40 7.26 C55H92O.23 1165.6019 1119.5986 783.4898, 621.4372, 459.3844 √ 人参皂苷平日 [28]
41 7.44 C27H30.O.11 575.3054 529.1713 1105.6187, 1059.6130, 367.1176 Icariside我
42 7.49 C47H80O.17 961.5392 915.5334 783.4893, 621.4371 三七皂苷铁/绞股蓝皂苷I/长春花皂苷R16/R17 [28]
43 7.61 C60H116O.36 1457.7361 1411.7128 1265.6560、1133.6172、987.5623、841.4951、475.3750 未知的
44 7.62 C48H82O.18 991.5460 945.5498 799.4841, 637.4338, 619.4188, 475.3750 未知的
45 7.63 C51H86O.21 1033.6028 987.5575 945.5498, 927.5349, 841.4951 √ 伪影甙RC1. [28]
46 7.81 C55H92O.23 1165.6125 1119.6310 1077.5851、1059.5736、945.5401、927.5275、765.4456、621.3965、459.2525 √ 人参皂苷Rs1 [28]
47 7.82 C27H30.O.10 513.1867 366.1149、351.0916、323.0886、151.0092、132.0236 Baohuoside我 ∆
48 7.82 C50H98O.29 1207.6355 1161.6063 1175.6207, 1161.6063 未知的
49 7.85 C41H70O.14 831.4783 785.4698 653.4258 Notoginsenoside rw2 [33]
50 7.89 C54H86O.24 1163.6464 1117.6188 1057.5961,971.5587,929.5478 Hemsloside G2 /人参皂苷ROA [34]
51 8.05 C42H70O.12 811.4849 765.4782 619.4163,457.2605 人参皂苷Rg6 ∆
52 8.14 C52H104O.30. 1253.6549 1207.6088 1207.6088, 1075.5676, 943.5283 未知的
53 8.16 C42H72O.13 829.4985 783.4911 637.4318, 475.3790 √ 人参皂苷Fc [28]
54 8.17 C51H86O.21 1033.5596. 987.5541 945.5425 927.5313、783.4911、765.4796、621.4370、459.3835 √ Quinquenoside三世 [28]
55 8.18 C42H72O.14 845.4895 799.4831 637.4308, 619.4199, 475.3775 同分异构体（22） [28]
56 8.42 C48H82O.16 959.5573 913.5543 767.4940, 621.4166, 475.3465, 146.9997 Gynosaponin二世 [35]
57 8.50 C56H94O.24 1149.6082 1107.7029、945.5416、927.5334、783.4859、765.3539、621.4349、459.3838 √ Quinquenoside R1 [28]
58 8.72 C42H72O.13 829.4963 783.4920 767.4591, 621.4376, 459.3846 √ 20（s） - 新皂苷Rg3 [23]
59 8.77 C42H72O.13 829.4974 783.4915 765.4796, 621.4368, 459.3842 √ 同分异构体(58） [23]
60 8.86 C42H72O.13 829.5020 783.4990 621.4348,459.3762,161.0500 √ 20（r）-ginsenoside RG3 [23]
61 9.39 C36H62O.9. 683.4375 637.4319 475.3790 20 (S)人参皂苷Rh1/20 (R)人参皂苷Rh1 [28]
62 9.54 C47H80O.18 977.4802 931.5010 799.4818、769.4988、751.4977、637.3975 同分异构体(9） [28]
63 9.59 C49H80O.18 1001.5699 955.5613 913.5525, 767.4947 gylongiposide I. [36]
64 9.60 C47H80O.17 961.5573 915.5556 783.4860,621.4335,459.3809 三七皂苷铁/绞股蓝皂苷I/长春花皂苷R16/R17 [28]
65 10.22 C42H70O.12 811.4861 765.4803 619.4220, 603.4269, 457.2275 人参皂苷Rg6 [28]
66 10.26 C42H72O.13 829.4875 783.4943 621.4368, 459.3837 √ 人参皂苷F2 [28]
67 10.36 C42H70O.12 811.4857 765.4805 619.4229,603.4269,457.2340 人参皂苷F4 [28]
68 10.38 C42H70O.12 811.4849 765.4792 603.3373 人参皂苷Rg5 [28]
69 10.40 C42H70O.12 811.4850 765.4794 603.3384, 483.2727 人参皂苷Rk1 [28]
70 15.05 C47H80O.17 961.6223 915.5983 978.5970, 783.5145, 621.3875, 459.3448 √ 三七皂苷铁/绞股蓝皂苷I/长春花皂苷R16/R17 [28]
缩略语:Rt，保留时间;CMP:食蟹猴血浆;Ref。引用。√:复合检测; ：化合物没有检测到。同分异构体(N°．）:括号内的数字表示同分异构体对应的峰值;∆:数据与标准物质一致。
表1
UPLC-ESI-Q-TOF-MS鉴定YZG的成分。

采用MassLynx (V4.1)软件中的marklynx模块对药物血浆和空白血浆的质谱数据进行比较，以鉴定血浆成分。

图中显示了药物等离子体和坯料等离子体的UPLC / ESI-Q-TOF MS数据的PCA分数4.．从得分图表可以看出,药物血浆和空白血浆的分数差距显著彼此的第一主成分得分显示显著差异的两组数据,表明两组重要的化学成分的差异。


图4
药物血浆与空白血浆的主成分分析(PCA)得分图。

药物血浆和空白血浆UPLC/ESI-Q-TOF质谱数据的OPLS-DA S图(S-plot)如图所示5.．s图中的每个点代表一个数据信号，横坐标代表贡献程度，纵坐标代表可信度，坐标轴正方向代表药物组强于空白组的信号。s图中选择的信号符合以下条件:X> 0.001和y> 0.8。


图5
利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对药物血浆和空白血浆进行s图分析。

共发现化合物36个，结构鉴定见表1）.血浆中部分吸收成分的MS/MS谱图及碎裂途径如图所示6.-9.．


图6
三七皂苷R1的LC-MS谱和裂解途径。

图7
人参皂苷Rb1的LC-MS谱和裂解途径。

图8
绞股蓝苷XLIX的LC-MS谱和裂解途径。

图9
绞股蓝苷A的LC-MS谱和裂解途径。

峰9 (Rt 4.61 min)产生[M-H]−离子在m/Z.931.5317和[M + HCOO]−离子在m/Z.977.5385表示分子式为C47H80O18。其MS/MS数据显示在m/Z.799.4850和637.4321如图所示6.．这表明先失去一个木糖基，再失去一个糖基。该化合物的质量破碎行为提示为三七皂苷R1，经与文献比较证实[26］.

峰23 (RT 6.11 min)产生[M-H]-离子在m / z说明分子式为C54H92O.23．MS / MS数据m / z945.5431(图7.）表明失去了一种糖苷基团和m / z783.4896提示另一个糖苷组丢失。此外，MS/MS数据还显示了另外两个糖苷基团的缺失，如图所示m / z621.4235和m / z459.3650,分别。该化合物的质量碎片行为表明，与文献报道的数据比较，该化合物可能是人参皂苷Rb1。

峰24 (Rt 6.21 min)产生显著的[M-H]−离子在m/Z.1045.7167和[M + HCOO]−离子在m/Z.1091.5645。分子式（c52H86O.21）可以通过元素组成推导。形成的特征碎片在m/Z.分别为913.5291、751.4626、605.4065、473.3609，与标准化合物基本一致。由此确定峰24为绞车皂苷XLIX，其碎裂途径如图所示8.．

峰39 (RT 7.21 min)产生[M-H]−离子在m / z897.5676和[M + HCOO]−离子在m / z943.5059，分子式为C46H74O.17.形成的特征碎片在m / z765.4807、751.4272、681.4173、619.3864和487.3429。的片段m / z765.4807和751.4272分别表示损失了一个木糖基和一个鼠李糖基;特征碎片在m / z681.4173表示两者的损失。峰39的碎裂途径如图所示9.．

３．３．吸收成分的药理作用

阿尔茨海默病的病理特点主要包括老年斑(SP)的沉积形成β淀粉样蛋白(β)，以及神经元中tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结、中性纤维缠结(NFTs)和神经元丢失[17］.A过量沉积β可诱导氧化应激;导致自由基过度积聚;导致生物大分子脂类、蛋白质、DNA和RNA的过氧化损伤[37];并导致神经元凋亡[38］.因此,一个β-诱导的氧化应激在AD发病机制中起重要作用[38那39］.神经炎症也是AD的病理特征之一[40是A的重要中介β- 除了氧化应激外，诱导AD病理学的神经元死亡和另一种基本因素[41］.越来越多的证据表明β诱导的炎症反应是a的重要组成部分β神经毒性(42］.PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞的克隆细胞系。它们是神经源性的，具有典型的神经内分泌细胞特征。它们被广泛应用于神经元分化、离子通道、受体和递质分泌的研究。它们也是研究神经毒性最常见的细胞系之一，非常有用在体外细胞模型(43］.因此，活性分片Aβ23-35诱导PC12细胞建立神经元损伤模型。

用a治疗后β25 - 35,模型对照组中的PC12细胞显然受损 - 模型对照组的细胞活力明显减少（与空白对照组相比， ）.与模型对照组比较，阳性对照药物加兰他明和小檗碱对A .毒素对PC12细胞的损伤有明显的保护作用β25 - 35（ ）.人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、三七皂苷Fa、三七皂苷R1、三七皂苷R2、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX对A损伤PC12细胞有明显的保护作用β25 - 35（ ）如图所示10．表格1表明，36种yzg化合物在肉豆蔻猴等离子体中被吸收;然而，这些化合物中只有14种用于药理学实验进入神经保护作用。将另一种吸收的猴子血浆中的吸收化合物分离或购买了神经保护作用的药效筛选。图中的活动组件10将在斑马鱼或小鼠模型中进一步验证。


图10
筛选对aβ25 - 35。样品如下:1、空白对照组;2、模型对照组;3, YZG组;4、氢溴酸加兰他明组;5、盐酸小檗碱组;6、人参皂苷Rb1组;7、人参皂苷Rb2组;8、人参皂苷Rb3组;9、人参皂苷Rc基团; 10, ginsenoside Rd group; 11, ginsenoside Re group; 12, ginsenoside Rf group; 13, ginsenoside Rg1 group; 14, ginsenoside Rg2 group; 15, notoginsenoside Fa group; 16, notoginsenoside R1 group; 17, notoginsenoside R2 group; 18, gypenoside A group; and 19, gypenoside XLIX group.

4.讨论

YZG是一种含有六种TCMS的健康食品。我们最近表明，yzg动物实验中的内存屏障和yzg可以保护PC12免受蛋白A引起的损伤β25 - 35[12-15］.还报道了这六种草药的相关效果。人参皂苷可以减少淀粉样蛋白的形成β蛋白质(β通过抑制)β- - -γ.抑制乙酰胆碱酯酶活性，诱导神经毒性，减少活性氧的产生和神经炎症反应β[44那45］.田七可以调节AD相关环状rna的表达，达到治疗AD的效果[46］.绞股蓝皂苷能显著改善lps诱导的脑功能障碍大鼠的学习和记忆能力[47］.淫羊藿苷通过PI3K/Akt通路阻止淀粉样蛋白β诱导的PC-12细胞凋亡[48并通过BDNF/TrkB/Akt通路改善突触可塑性[49］.Oxyphylla成分能改善空间记忆表现和下调表达吗β-分泌酶和Aβ1-42在脑组织中[50］.根本吠桑属阿尔巴，以及它的分离化合物，已显示出强大的AChE-， BChE-和bace1抑制活性[51］.然而，YZG的活性成分尚不清楚。

虽然中药含有复杂的化学成分，但只有可以吸收到血液中的化合物可以产生效果。中药主要施用口服，其活性物质必须通过血液运输到作用靶标以产生效果。因此，给药后血清中包含的组分是中药的直接作用物质在活的有机体内．食蟹猴是非人类灵长类动物，在遗传学和病理生理学上与人类相似;因此，它们是一个有用的临床前模型[17那18］.因此，我们使用此模型来评估YZG。并且血清药物化学方法用于分析和鉴定口服含量在Cynomolgus猴中γ中含有血清中所含的组分。

在该研究中，使用UPLC / ESI-Q-TOF MS法从YZG确定总共63种化合物;他们中的大多数都是saponins来自人参和田七，说明YZG具有药用作用的主要成分为皂苷。然后，我们对食蟹猴口服YZG后血清中的原型成分进行分析鉴定，发现35个原型成分。并分析了几种代表性组分的解理规律。这表明这些化合物可能是YZG的活性成分。为了研究这些化合物是否真的有效，我们用体外实验来验证，并购买了14种市售化合物进行细胞实验;结果表明，其中9种具有显著的药理活性，在一定程度上证明了血液吸收的成分确实是YZG的活性成分，为我们以后的实验提供了基础。但是，由于其他被吸收的成分难以获得，所以我们在本研究中没有对所有被吸收的成分进行验证，这是本实验的不足之处，后续研究将会找到解决这个问题的方法。

5.结论

建立了一种快速，敏感，方便的UPLC / ESI-Q-TOF MS方法，用于同时定性分析紫杉g和血浆中的吸收成分的分析。在yzg中检测到七十种化合物，并鉴定出63种化合物，包括60个皂苷，2黄酮和1个甲酯。在活的有机体内研究发现食蟹猴血浆中含有33种皂苷、1种黄酮和1种甲酯。PC12细胞损伤模型采用Aβ25-35评价吸收成分的神经保护作用。结果表明:人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、三七皂苷Fa、三七皂苷R1、三七皂苷R2、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX等9个化合物具有保护作用。这些活性成分大部分是皂苷。

缩写

YZG: 演变中颗粒
中医: 中国传统医学
UPLC / ESI-Q-TOF女士: 超高效液相色谱/电喷雾电离四极杆飞行时间质谱
广告: 阿尔茨海默病
主成分分析: 主成分分析
OPLS-DA： 正交偏最小二乘判别分析
DMSO： 二甲基亚砜
SP: 老年斑
一种β： β淀粉样蛋白
非功能性测试: 神经原纤维缠结。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

郝二伟、秦剑峰、魏巍对这部作品都有贡献。

致谢

广西科技发展计划项目(no . GKG1355004-11, no . 15-140-31, no . 17-259-20, no . 2017AD19024, no . AD17195025)资助作者感谢LetPub (http://www.letpub.com.）在编写本手稿期间的语言援助。

参考文献

  1. G. J. Demakis，《阿尔茨海默病的残疾:原因、后果和经济考虑》，美国卫生与公众服务管理局杂志，第30卷，第2期3，页292 - 305,2007。视图:谷歌学者
  2. P. Gillespie, E. O 'Shea, J. Cullinan等，“爱尔兰老年痴呆症和轻度认知障碍的依赖性和功能对护理成本的影响”，国际老年精神病学杂志第28卷第2期3, pp. 256-264, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
  3. S. Freude, M. M. Hettich, C. Schumann et al.，“神经元IGF-1抗性降低Aβ在阿尔茨海默病的模型中，积累并防止过早死亡。”美国实验生物学学会联合会杂志，第23卷，第2期。10, pp. 3315-3324, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
  4. 贾婧，王芳，魏超等，“中国城乡老年痴呆患病率研究”，阿尔茨海默氏症和老年痴呆症，第10卷，第5期。1, pp. 1 - 9, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
  5. 贾婧，魏聪，陈淑珍等，“中国老年痴呆症的成本与全球成本的重新评估”，阿尔茨海默氏症和老年痴呆症第14卷第2期4, pp. 483-491, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
  6. D. J. Selkoe和J. Hardy，《25岁老年痴呆症的淀粉样蛋白假说》EMBO分子医学，第8卷，第2期6, pp. 595-608, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
  7. J. Li, Y. Liu, W. Li等，“人参皂苷re在阿尔茨海默病小鼠模型中的作用的代谢分析，”大脑研究行为， 2018年第337卷，第160页。视图:出版商的网站|谷歌学者
  8. R. Aalinkeel, H. L. Kutscher, a . Singh等人，“生物可降解聚(乳酸-羟基乙酸)-人参皂苷rg3纳米制剂的神经保护作用:阿尔茨海默病的潜在纳米疗法?”药物靶向杂志第26卷第2期2, pp. 1-28, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
  9. 黄芩苷和人参皂苷rb1对阿尔茨海默病模型大鼠神经干细胞增殖和分化的影响大脑研究， 2018年，第1678卷，第187-194页。视图:出版商的网站|谷歌学者
  10. “人参皂苷rg1和谷穗对阿尔茨海默病神经元细胞凋亡的影响及机制研究”，神经化学研究号，第43卷。8, pp. 1529-1538, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
  11. 叶红，傅敏，王玉涛等，“人参皂苷rf对淀粉样蛋白的神经保护作用β- 体外和体内的神经毒性，“阿尔茨海默病杂志号，第64卷。2，第1-14页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
  12. 杜志成、邓建国，《复方焦古兰益智颗粒改善小鼠记忆的作用》，中国实验方剂杂志第18卷第2期15, pp. 250-253, 2012。视图:谷歌学者
  13. 杜志成，郝恩伟，黄强等，“复方胶古兰益智颗粒的急性和亚慢性毒理学研究”，当代医学生理学第18卷第2期19，pp。1-3,2012。视图:谷歌学者
  14. 杜志成、邓建国，《复方焦骨兰颗粒改善人体记忆的临床观察》，中国实验方剂杂志第18卷第2期12，页262-265,2012。视图:谷歌学者
  15. 郝恩伟，邓建刚，杜志成等，“复方益智颗粒对甲胎鼠致pc12细胞损伤模型的神经保护作用研究β- （25-35），“世界中医，卷。11，不。11，pp。2227-2230，2016。视图:谷歌学者
  16. 杨晓伟，“基于体内代谢和处置过程的中药有效活性成分发现策略”，中国中药杂志，第32卷，第2期第5页，2007年。视图:谷歌学者
  17. Z. T. Yang，A. M. Liu，F. Liu等，“人类，鱼糜甘油猴和大鼠等离子体中辛伐他汀的物种相关稳定性差异”中华现代应用药学杂志第26卷第2期4，页261-264,2009。视图:谷歌学者
  18. E.buse，“在猴猴猴中的免疫系统的发展：人类靶向毒理学的适当模型？”Immunotoxicology杂志，第2卷，第2期4，页211-216,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
  19. Y.-N。唐,y。庞,X.-C。他等人，“口服薯蓣皂苷后大鼠生物样品代谢物的超高效液相色谱- qtof - ms鉴定:比较研究”，民族药物学杂志， vol. 165, pp. 127-140, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
  20. 肯尼迪。冯,Y.-N。唐鸿吉，唐志刚。肖磊，易涛，“生物转化薯蓣属培通过大鼠肠道微氯和Diosgenin的心脏保护作用，“氧化医学与细胞寿命，卷。2017年，第4176518,19页，9页，2017年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  21. 易涛，朱玲，杨宁。Tang et al.，“基于UPLC-DAD-QTOF-MS的中草药代谢和药动学研究的综合策略:藏药“雪莲”(光学laniceps)，个案研究，”民族药物学杂志，第153卷，第153期3, pp. 701-713, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
  22. 易涛，陈海波，郑志志。赵,Z.-H。江,S.-Q。Cai, T.-M。“传统藏药植物主要成分的比较分析光学laniceps和S. MEDUSA.LC-DAD-MS。”色层法，第70卷，第2期5-6，第957-962页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
  23. p . Liu H.-S。Yu L.-J。“超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速分析三七粉末化学指纹图谱的方法”，中国天然药物杂志，卷。13，不。6，pp。471-480,2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
  24. E.M.Sánchez-Salcedo，M. Tassotti，D.Del Rio，F.Hernández，J.J.Martínez和P. Mena，“（Poly）酚醛指纹和白色的化学计量分析”桑属阿尔巴L.）和黑色（桑属黑质通过非靶向UHPLC-MS方法检测桑叶，食品化学， vol. 212, pp. 250-255, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
  25. S.-S.李，吴，d .d.尹，C.-Y.冯，z.-a。刘和L.0.。王，“中医中植物化学变异亩丹PI牡丹（牡丹），”植物化学，第146卷，第16-24页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
  26. 刘海英，徐玉青，欧阳涛等，“HPLC-Q-TOF-MS法鉴定益气复麦注射液中皂苷的含量”，中国实验方剂杂志，卷。24，不。5，pp.7-12，2018。视图:谷歌学者
  27. 杨玲，苗玉英，尹慧娟等，“人参皂苷的鉴定人参quinquefoliusLC-ESI-MS分析N”,中国传统和草药号，第41卷。12页，1942-1947,2010。视图:谷歌学者
  28. 徐福林，张秋英，蒋黎等，“植物化学成分的研究人参蒸馏乙醇提取物的UHPLC-Q-TOF/MS分析中药研究与临床药理学，第4卷，第4期。26, pp. 529-534, 2015。视图:谷歌学者
  29. w·徐黄永发。“人参药用真菌物质中两种新的达马烷型三萜皂苷”，天然产物的研究第31卷第1期10, pp. 1107-1112, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
  30. J.-Y。湾,C.-Z。王振柳等，“液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定人血浆、尿液和粪便样品中西洋参皂苷及其代谢物”，色谱学报B， vol. 1015-1016, pp. 62-73, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
  31. Jing Z.， Qin Z. X.， Bing P. et al.，“人参皂苷的裂解途径panaxnotoginseng使用电喷雾电离四极杆/飞行时间质谱仪，”中国质谱学报第38卷第2期1, pp. 97-108, 2017。视图:谷歌学者
  32. 邹凯，朱s.， C. Tohda, fnm Cai, K. Komatsu，“人参达马烷型三萜皂苷的研究”，天然产物杂志，卷。65，不。3，PP。346-351,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
  33. Y.陈，Z. Zhao，H. Chen，T. Yi，M. Qin和Z.梁，“商业亚洲和美国人参的化学分化与质量评价，基于UHPLC-QTOF / MS / MS代谢组种方法，“植物化学的分析第26卷第2期2, pp. 145-160, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
  34. Hui S.， Chang L.， A. H. Zhang et al.，“基于超高效液相色谱耦合电喷雾电离/四极杆飞行时间质量的集成mse数据采集模式策略快速发现和全球表征开心散中的多种成分”，分析方法，第7卷，第5期1, pp. 279-286, 2014。视图:谷歌学者
  35. J.-Q。刘,张炳扬。王,J.-C。Chen等人，“六种新的三萜苷绞股蓝皂”,Helvetica Chimica学报，卷。92，没有。12，pp。2737-2745,2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
  36. 冯英，胡丽华，“蕉荚兰的化学成分研究(绞股蓝皂),“ACS系列研讨会，卷。925，pp。170-184,2006。视图:谷歌学者
  37. 吕志明，“β -淀粉样蛋白代谢与阿尔茨海默病相关基因的研究进展”，中国国际神经科和神经外科杂志第34卷第3期6，页527-530,2007。视图:谷歌学者
  38. K. Youn，S. Lee，W.-S.jeong，c.t.何，君，“柯尔加尔的保护作用β25-35诱导的神经毒性:NF-的抑制κ..B信号通路。”医药食品杂志第19卷第2期10, pp. 901-911, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
  39. R. Sultana, P. Mecocci, F. Mangialasche, R. Cecchetti, M. Baglioni，和D. A. Butterfield，“从阿尔茨海默病患者的淋巴细胞中分离出的线粒体中蛋白质和脂质氧化损伤的增加:深入了解了氧化应激在阿尔茨海默病中的作用，并对这种痴呆症的潜在生物标志物进行了初步调查。”阿尔茨海默病杂志，卷。24，不。1，pp.77-84，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
  40. M. Hüll, M. Berger, J. Bauer等人，“阿尔茨海默病的炎症机制”，欧洲精神病学和临床神经科学档案第二百四十六卷3，页124-128,1994。视图:谷歌学者
  41. P. MCGEER和E.CCGER，“脑炎症反应系统：对阿尔茨海默氏症和其他神经退行性疾病的治疗影响，”大脑研究评论第21卷第2期2，页195-218,1995。视图:出版商的网站|谷歌学者
  42. G. Esposito, D. De Filippis, M. C. Maiuri, D. De Stefano, R. Carnuccio，和T. Iuvone，“大麻二酚抑制诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达和一氧化氮的产生β-淀粉样蛋白通过p38 MAP激酶和NF-刺激PC12神经元κ..B参与，“神经学字母，第399期。1-2，页91-95,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
  43. A. Nordberg，“阿尔茨海默病中胆碱酯酶抑制剂神经保护作用的机制”阿尔茨海默病和相关疾病，第20卷，第2期。1, p. S12, 2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
  44. 周宏儒。金,S.-W。荣格,S.-Y。金等人，“人参作为阿尔茨海默病的辅助治疗”，人参研究杂志，第42卷，第2期4, pp. 401-411, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
  45. M. Razgonova, V. Veselov, A. Zakharenko等，“人参成分与阿尔茨海默病的发病机制(综述)”，分子医学报告， vol. 19, pp. 2975-2998, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
  46. J.-L.黄，Z.-h。徐，S.-M。杨等人，“鉴定Alzheimer疾病的差异表达曲线在Panax Noginseng Saponins治疗的阿尔茨海默病小鼠模型中，”计算和结构生物技术杂志，第16卷，第523-531页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
  47. B. Lee, I. Shim, H. Lee和D.-H。“绞股蓝皂苷可以减轻脂多糖诱导的神经炎症和类似焦虑的老鼠行为，”动物细胞和系统第22卷第2期5, pp. 305-316, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
  48. D. Zhang, Z. Wang, C. Sheng等，“Icariin通过pi3k/akt通路抑制淀粉样β诱导的pc-12细胞凋亡，”基于证据的互补和替代医学， 2015年第1期，文章编号235265,9页，2015年。视图:出版商的网站|谷歌学者
  49. Sheng c.x.， Xu P. P.， K. X. Zhou, D. Deng, C. Zhang, Z. Wang，“Icariin减轻A .神经突触和认知缺陷β1 - 42诱发的阿尔茨海默病大鼠模型生物医学研究的国际， vol. 2017, Article ID 7464872, 12页，2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
  50. 何b.s.，徐凤仙，闫天祥等，“玉菊素的来源oxyphylla成分进行筛选。就缓解了β1-42诱发小鼠学习和记忆障碍欧洲药理学杂志，第842卷，第365-372页，2018。视图:谷歌学者
  51. E. B. Kuk, A. R. Jo, S. I. Oh等人，“从根树皮中提取的化合物抗阿尔茨海默病活性桑属阿尔巴L。”药物研究档案，卷。40，不。3，pp。338-349,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者

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