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Guangzhe姚明,硕士研究生马文娟与数位合著者,Xuhua黄气,世纪佳缘沈,Yanxu Chang惠子欧阳,他6月, ”识别和原材料的质量评价细辛物种使用显微镜,DNA条码技术,气相色谱-光谱法”,分析方法在化学杂志》上, 卷。2020年, 文章的ID2690238, 12 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/2690238
识别和原材料的质量评价细辛物种使用显微镜,DNA条码技术,气相色谱-光谱法
Guangzhe么,1,2 硕士研究生马文娟与数位合著者,2 Xuhua黄,2 气贾,2 世纪佳缘沈,2 Yanxu常
,2
惠子欧阳,1,2
和
6月他2
1第一个教学医院天津中医药大学300193年天津,中国
2天津现代中药国家重点实验室,天津中医药大学Tianjin.301617,中国
文摘
细辛(马兜铃科)是一种常见的草药用来缓解表面症状。一些挥发性成分细辛具有毒性作用可能会引起不良反应,如头痛、一般紧张,无意识,呼吸麻痹。因此,细辛通常是处理以减少毒性和副作用等。中包含的生物活性成分不同细辛草本植物显著不同;这可能归因于他们的分歧的物种变异,起源,或处理方法。在这项研究中,16批细辛收集草药,他们的物种被确定使用DNA条码技术,这是一个方法区分植物物种,加上显微镜。气相色谱分析-质谱法(gc - ms)方法建立了同时测定10个化合物对原材料的内容进行评估细辛草本植物。多变量分析被应用于比较不同批次的草药gc - ms数据的基础上。DNA条码技术确定了草药是来自四个来源,从不同的起源和草药显示不同的微观特性。结果表明,大多数样本显然与物种类型的集群分成不同组。所有原材料样品被偏最小二乘判别分析分类(PLS-DA)基于10化合物分析。研究结果表明,黄樟油精和丁香酚项目中一个变量的重要性(VIP) > 1是独一无二的化合物,可用于区分细辛物种。黄樟油精、丁香酚和2 6 6-trimethylcyclohepta-2, 4-dien-1-one被确定为重要的成分,可以用来区分的原材料细辛样本。这些结果表明,物种的组成和加工方法显示重要的影响细辛草本植物。
1。介绍
根据中国药典(2015年版),细辛草药源于植物的干燥根和根状茎的家庭马兜铃科,其中包括细辛heterotropoidesFr。施密特var。mandshuricum(箴言)。Kitag。细辛sieboldii进行筛选。var。seoulense纳街,细辛sieboldii进行筛选(1]。细辛最大Hemsl。作为中国一些地区的代用品治疗各种疾病(2]。使用草药专论的首次报道神农本草纲目(神农Bencaojing)编制在东汉(公元25 - 220年)(3]。一般来说,丁香酚,黄樟油精等挥发组分(草蒿脑、桉树脑和α松油醇等)被认为是主要的生物活性成分细辛草本植物(4]。研究表明,细辛显示杀菌性能,也可以用于治疗咳嗽、呼吸困难、头痛、风湿关节痛,鼻窦炎,牙痛1,5- - - - - -7]。
药用植物的质量取决于遗传和环境因素;甚至同一物种的植物可以有不同的化学成分和功能如果他们不同的地理起源的8]。细辛种植在中国不同的地区,包括辽宁、山西、吉林,这使得这种草药使用传统方法的识别具有挑战性的(9]。基于特征、显微鉴别和理化鉴别是常见的方法用于识别成分的中药(中药)10,11]。然而,很难描述来自多个来源的药材,特别是当药物粉末的形式。DNA条码技术,一个简单的操作系统,可以准确、快速的识别原始植物,细胞,组织,煮出的产品,和药材粉有良好的准确性和可重复性高的好处(12- - - - - -16]。
在中医理论中,处理(plain-frying或炒,直到布朗,蒸、炖,或用酒炒)有必要促进疗效和/或减少中药的副作用减少有毒成分的水平(17- - - - - -19]。处理过程中可能发生化学反应的中药,如水解反应、氧化反应、置换反应、异构化反应,分解反应。例如,在处理半夏ternata用生姜水,生姜中的姜辣素发挥拮抗对刺激的毒性的影响半夏有毒的针状结晶(20.]。研究表明,原材料的成分细辛草药截然不同的(21]。质谱和PLS-DA可以提供一个全面、多元的描述中药的化学成分。然而,很少有研究报道这些方法的多组分分析细辛或化学成分的比较不同原材料之间的草药。因此,需要一个可靠的和全面的分析方法来确定同时几个组件,从而使原材料样品的质量评价细辛。
在我们的研究中,显微技术和DNA条码技术应用于识别的特点和物种中包含16批细辛草本植物。十挥发组分,即(1 r) - (+) -alpha-pinene (−)β蒎烯,(+)-car-3-ene、桉树脑(−)冰片、黄樟油精,草蒿脑,α松油醇、丁香酚和2 6 6-trimethylcyclohepta-2, 4-dien-1-one,同时评估使用气相色谱分析-质谱法(gc - ms),和原材料的组件细辛PLS-DA收集来自不同领域进行了分析。这项研究提供了一个新的观点的遗传基础和分类细辛。与此同时,它强调了处理对挥发性成分的含量的影响,这些信息将有助于评价和原材料的分化细辛草本植物。
2。材料和方法
2.1。化学物质
参考标准(1 r) - (+) -alpha-pinene, (+) -car-3-ene,桉树脑(−)β蒎烯(−)冰片、2、6、6-trimethylcyclohepta-2, 4-dien-1-one,α松油醇,甲基胡椒酚、黄樟油精和丁香酚买来Desite生物技术有限公司有限公司提供的正己烷是Kangkede科技有限公司有限公司获得了甘油从天津Fengchuan化学试剂有限公司,有限公司水合氯醛是购自天津Kemiou化学试剂有限公司,有限公司提供的植物基因组DNA工具包是Tiangen生物科技(北京)有限公司,有限公司去离子水制备使用Milli-Q水净化系统。
2.2。植物材料
细辛草药从16个地区收集来自不同省份的中国和被小君教授他的天津现代中药的国家重点实验室。细辛沉积在中医药图书馆、天津中医药大学、中国天津。的起源样本如表所示1。
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2.3。显微鉴定细辛
的物种细辛根据根被确定外观和微观特性。检查后没有。4筛,每个干样例使用电动砂轮机磨成粉。样本被放置在幻灯片和渗透两次1 - 3滴水合氯醛,然后用稀释甘油和盖玻片。的图片细辛粉末样品在光学显微镜下观察下10倍放大用数码相机拍摄。
2.4。DNA条码技术分析
大约30毫克的干粉末从每个样本(根和根状茎)准确称重和液态氮冷冻前接受进一步研磨。总基因组DNA被隔离的材料使用植物基因组DNA工具包DP305 (TIANGEN),根据制造商的指示,并存储在−20°C。
使用的引物扩增DNA ITS2地区的5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′(向前)和5′-TCCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(反向)22,23]。在25 - PCR扩增了μL反应管2μL DNA模板(10μ12.5米),μL 2×Gflex PCR缓冲(豆类),0.5μ0.5 L的底漆,μL橡胶草Gflex DNA聚合酶(1.25户/μL,豆类)和9μL ddH2o . PCR程序由一个初始变性步骤1分钟的98°C,紧随其后的是40周期在98°C的变性10年代,退火56.5°C 15年代和68°C伸长了30年代,最终扩展步骤5分钟的68°C。放大产品被发现在2%琼脂糖凝胶。
PCR产品排序基于Sanger测序技术由测序公司(Gitech解决方案有限公司)。获得的序列搜索使用爆炸对基因库数据库来确定每个样本的种类(24,25]。
2.5。量化采用气相
2.5.1。处理的方法细辛
原始的细辛样本切成段,在一个金属锅炒120 - 140°C中火焰,约15分钟或直到样品的外观变成棕色的颜色,与烧焦的斑点。
2.5.2。准备样品
细辛样品(根和根状茎)晒干,磨成粉。原材料的粉细辛样品准确重(50.0 g),受到hydrodistillation 6 h 100伏特的精油萃取器。精油是收集后冷却到室温。获得的精油是存储在制冷在4°C。一个5μL样品挥发油(原材料或加工)是准确测量和正己烷溶解在50毫升。
十个参考标准:(1 r) - (+) -alpha-pinene, (+) -car-3-ene,桉树脑,α松油醇,(−)β蒎烯(−)冰片、2、6、6-trimethylcyclohepta-2, 4-dien-1-one,草蒿脑,黄樟油精,和丁香酚溶解在正己烷的最终浓度1毫克/毫升股票的解决方案,分别。工作获得的标准解决方案进一步稀释上述股票的解决方案在适量。
2.5.3。气相色谱和质谱条件
自动化分析进行了gc - ms qp - 2010在日本岛津公司Ultrasystem配有AOC-20i autosampler。DB-17毛细管柱色谱进行分离(30米×0.25毫米×0.25µm膜厚度)。列温度程序如下:3分钟40°C, 6°C /分钟到106°C, 3°C /分钟到142.6°C, 1分钟142.6°C, 6°C /分钟到180°C,最后4°C /分钟到200°C。高纯氦作为载气的流量1.3 mL / min。分裂注入被设定为50的分流比:1,注射温度为250°C。
优化检测器女士的条件如下:电离源温度、230°C;电离能,70电动汽车;界面温度、250°C;完整的扫描范围,m / z30 - 600;每扫描和扫描速度,0.30秒。女士的数据在电子轰击收购模式。化合物被确定的标准物质和NIST08质量光谱库。组件是由外部量化标准曲线法(7,26]。
2.5.4。gc - ms方法验证
的试验测试化合物的线性最小二乘线性回归评估的analyte-to-standard峰面积比(y)与规范化标准浓度(x)。下限的量化为每个样本(LLOQ)定义基于生成的浓度峰值信噪比的值(年代/N10)。精度的方法评估了盘中,interday可变性。标准偏差计算的测量精度。重复性检查,六个复制同一批次样品的提取和分析。评估分析物的稳定性、样品的解决方案被储存在室温下,然后分析了复制注射(0,2、4、8、12、24小时。标准偏差被用来评估稳定。经济复苏是评估通过添加已知的样本数量的10个标准解决方案,而这些被用来进一步研究该方法的准确性。恢复使用以下公式计算:恢复(%)=(原始金额数量发现−)/数量飙升×100%。
2.6。统计分析
之间的差异细辛PLS-DA样本进行了分析。这种方法建立了回归矩阵之间的关系,以便得到更好的回归预测结果。当监督模式识别方法,样本数据分为训练集和验证集。使用训练集分类模型获得,而预测的准确性验证使用验证集。在本研究中,gc - ms方法应用于分析细辛样品包括原材料的批次细辛样本。共有10个挥发性化合物被用来评估上述样品的差异。使用SIMCA-P 14.1软件进行统计分析。统计模型的适应性评价R2X,R2Y,问2。
3所示。结果与讨论
在表皮上截然不同的显微特征观察,油细胞,淀粉颗粒,血管,和分泌细胞。的显微外观和特性细辛如图1。细辛heterotropoidesFr。施密特var。mandshuricum(箴言)。Kitag。根细长,表面细胞是矩形的,有点波浪,和梯状血管和相对松散的油细胞和少量的石细胞和大量的淀粉颗粒。细辛sieboldii进行筛选。长期以来根,表面细胞是矩形的,和梯状血管,少量的石细胞,大量的淀粉颗粒。细辛sieboldii进行筛选。var。seoulenseNakai长期以来,纤维根和丰富的淀粉颗粒。细辛最大Hemsl。水平的根状茎,它有丰富的淀粉颗粒,但是,在我们的观察,没有石细胞。结果表明,石细胞的存在与否可以作为区分的特色细辛heterotropoidesFr。施密特var。mandshuricum(箴言)。Kitag。和细辛sieboldii进行筛选。从细辛最大Hemsl。和细辛sieboldii进行筛选。var。seoulense纳街。表中提供的细节1。
(一)
(b)
(c)
(d)
在获得paired-end测序的结果,我们使用新创函数的CLC基因组工作台paired-end测序拼接。paired-end读取被并入Geneious v8.0.4。一致性序列,ITSx v1.1是用来切断ITS2序列和修改退化基地(当有劣质序列和高质量的核苷酸序列在同一个网站,我们更喜欢高质量的核苷酸序列)(27]。序列比对,给出补充材料(可用在这里),是通过调整不同产品的序列使用MAFFT v7 (28]。
序列比对是与基因库数据库相比,使用基本的局部比对搜索工具(爆炸)确定每个样本中包含的物种(29日]。结果表明,细辛草药包括来自四个物种细辛heterotropoides Fr。施密特var. mandshuricum(格言)。Kitag。细辛sieboldii进行筛选。细辛sieboldii进行筛选。Var。seoulense纳街,细辛最大Hemsl(表2)。我们也用序列比对构造neighbor-joining (NJ)由新泽西工具系统树MEGA-X分子进化遗传分析软件(参见图2)。结果表明,细辛样品从四个物种形成一个稳定的分支。化合物的类型相似的密切相关的物种。的树枝细辛sieboldii进行筛选。是分散的,可能是相关样本的数量。ITS2序列的比较分析,我们发现大量的转换和颠换和插入/删除现象发生在ITS2序列,和位点的信息丰富,可用于分子识别的样本。
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线性校正曲线的峰值区(y)与浓度(x)绘制了10挥发性化合物。回归系数(r210个化合物)> 0.994,表明良好的线性内一个相对广泛的浓度。对于精度,相对标准偏差(RSD)为10的内容特征组件从6.1%至1.8不等。在测试的可重复性,所有目标分析物RSD值从8.9%至2.3不等。结果表明,该方法精确和可重复的。稳定,测量标准偏差,范围在2.2 - -6.6%,表明样本稳定24 h。每个分析物的回收率从113.3%至89.2不等。这些结果表明,样品制备的效率是可以接受的。全扫描监测分析物的色谱图所示3。验证数据表所示3被认为是令人满意的后续分析的样本。
(一)
(b)
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的验证方法应用于分析16批次的原材料细辛样本。十生物活性化合物细辛使用外部标准量化方法基于各自的校正曲线。原材料中10个化合物的内容细辛样品表中列出4。有差异的内容分析物之间的原材料样品。如图4,有明显差异的总内容10组件。例如,10个成分的总内容处理细辛降低与原料相比细辛。
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注释:1、宇;2、延边;3、抚顺;4,昭通;5,桂林;6,神农架;7,Xinbin;8。铁西店;9。 Dingxi; 10, Changzhi; 11, Bijie; 12, Benxi; 13, Panjin; 14, Chifeng; 15, Qinling; 16, Yulin. |
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大多数样本显然集群分成不同组对应于他们的物种类型(见图5)。的样本细辛heterotropoidesFr。施密特var。mandshuricum(箴言)。Kitag。和细辛sieboldii进行筛选。相对分散,但细辛最大Hemsl。样本更紧密地聚集在一起。相比之下,细辛最大Hemsl。,细辛sieboldii进行筛选。和细辛sieboldii进行筛选。var。seoulense纳街是位于靠近细辛heterotropoidesFr。施密特var。mandshuricum(箴言)。Kitag。相应的分数情节结合VIP值筛选化合物,即黄樟油精和丁香酚的分化不同细辛样本。重要的变量选择使用标准贵宾> 1(见图6)。PLS-DA证明内容变化的结果差异可能是由于不同物种的存在细辛样本。
气相的结果被PLS-DA进一步分析。一个三维(3 d)评分的情节PLS-DA进行测量原材料之间的差异细辛(见图7)。生细辛样本集中在一个相对离散较大的地区,这是截然不同的样品处理。处理过的样品在一个小区域,这表明处理过的样品更加稳定比原始样本。成分与大型装载值可以作为标记,造成明显的分类样本。在目前的研究中,潜在的生物活性成分如黄樟油精,丁香酚,2,6日6-trimethylcyclohepta-2, 4-dien-1-one VIP > 1是确定为化合物,可以用来区分原始和处理细辛样品(见图8)。结果表明,化学成分细辛样品处理后改变。上述组件造成极大的样本分类和可能的物质基础变化草处理有关的临床疗效。
4所示。结论
在这项研究中,我们进行了性格和显微鉴定细辛从不同的物种。显微镜的观察细辛粉末样品表明,出现在各种不同的各种各样的功能细辛样本。有许多相同的细胞结构在所有样本,一个微分特性不能区分不同物种。分子识别技术被用来确定上面的样品,和四种细辛显然是确定从16批细辛样本。这样的分子识别技术弥补了缺乏个性和显微鉴别。
此外,gc - ms方法的开发和验证10活性成分的同时测定细辛样品,16批的内容细辛样本调查的方法,证实了分子识别的结果。根据10个有效成分的量化数据,PLS-DA歧视和预测进行了分析细辛样品的不同种类和处理方法。结果表明,生细辛16个地区不同来源的样品可以明显分为四个subclusters PLS-DA,验证了结果的分子识别。两个挥发油(黄樟油精和丁香酚)和VIP > 1,基于PLS-DA,关键化合物可以帮助区分不同物种。此外,PLS-DA模型表明,原材料细辛分别集中在两个不同的领域。黄樟油精、丁香酚和2 6 6-trimethylcyclohepta-2, 4-dien-1-one重要指数成分来区分细辛样品不同的处理方法。上面的方法,结合显微鉴别、DNA条码技术,气相,建立了原始的识别细辛及其加工产品,提供质量评价的基础和物种的差异细辛。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81673824)和中国国家重大科技项目(2018 zx01031301)。
补充材料
对齐的细辛序列来自16个地区。(补充材料)
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