的识别在活的有机体内代谢物的Dictamnine老鼠使用HPLC-LTQ-Orbitrap质谱分析

文摘

Dictamnine (4-methoxyfuro [2, 3 b]喹诺酮,DIC),芸香料的家庭中的一个常见furoquinoline生物碱,显示不同的生物活性。调查在活的有机体内DIC的代谢途径、代谢DIC的老鼠研究了使用高效液相色谱与电喷雾四极混合线性陷阱orbitrap HPLC-LTQ-Orbitrap质谱仪。九DIC-treated老鼠尿中代谢物,等离子体,和粪便样本,其中两个被确定为新代谢物。迪拜国际资本的主要代谢途径在动物和人类肝脏微粒体被证实在目前的研究中,包括o-demethylation monohydroxylation,N氧化,2,3-olefinic环氧化作用途径。第一次DIC的mono-acetylcysteine共轭(M9)检测DIC-treated鼠标尿液和血浆样本,和4-methoxy-2-oxo-1 2-dihydroquinoline-3-carboxylic酸(M10)和2 - (2,8-dihydroxy-4-methoxyquinolin-3-yl)乙醛(M11公路)被确定为新DIC的代谢物;此外,使用一个在体外人类的孵化模式,furo [2, 3 b] quinolin-4-ol (M1)被证实是微生物脱甲基代谢物DIC。总的来说,目前的研究提供了新的信息在活的有机体内代谢DIC的命运。

1。介绍

Dictamnine (4-methoxyfuro [2, 3 b]喹诺酮,DIC),芸香料的家庭中的一个常见furoquinoline生物碱,显示不同的生物活性,如抗菌、抗菌、vascular-relaxing,抗血小板聚集和降压活动1- - - - - -7]。此外,DIC有力的细胞毒性活动对人类的子宫颈,结肠癌、乳腺癌、肺癌细胞系,主要机制是通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡8,9]。最近,梁等人报道,迪拜国际资本作为抗癌剂逮捕细胞S期的细胞周期和诱导人肺腺癌A549细胞凋亡通过mitochondria-mediated caspase-independent通路(10]。此外,小说DIC的合成和半合成衍生品,作为潜在的抗肿瘤剂,获得了越来越多的关注在药用研究[11]。

我们先前的研究已经表明,迪拜国际资本是一种有前景的候选药物有利的口头药代动力学资料(12,13]。最近,使用在体外微粒体孵化系统中,我们系统地研究了DIC的代谢物在人类和动物肝脏微粒体孵化系统(14),我们发现人类肝微粒体代谢DIC的命运是一样的,在鼠肝微粒体,虽然有一些差异的老鼠相比,狗,猴和肝微粒体。我们阐明o-demethylation monohydroxylation,N氧化,2,3-olefinic环氧化作用通路DIC的主要代谢途径(14]。在另一项研究[15),一个N乙酰半胱氨酸(NAC)共轭来源于活性DIC代谢物,2,3-epoxide DIC,检测大鼠肝微粒体孵化体系,以及DIC-treated鼠尿液样本。

也是非凡的注意,没有报道在活的有机体内DIC的代谢研究人类或老鼠。选择最相关的动物物种进行研究对于研究人员推断的结果是至关重要的研究表现在动物到人类16- - - - - -19]。在预设的研究中,基于前面的结果(14,15),在活的有机体内新陈代谢DIC在老鼠身上进行的研究。一个强大的混合线性四极离子阱orbitrap (LTQ-Orbitrap)质谱计配备了高效液相色谱法(HPLC)系统是用于代谢物的结构说明。

2。材料和方法

2.1。试剂

DIC,纯度高于98%,购买从国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。HPLC-MS-graded乙腈(ACN),(甲醇),甲醇和甲酸得到费舍尔科学(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。纯净水是获得从Milli-Q系统(美国贝德福德微孔)。

2.2。治疗小鼠和样本集合

实验用老鼠进行雄性昆明小鼠(25±2 g)是来自青岛大学实验动物中心(青岛)。所有老鼠都住5每笼与12 h光/暗周期20±2°C的环境温度与相对湿度50±10%。老鼠被允许适应至少1周开始之前的实验。老鼠是- 93 semipurified饮食和被允许随意在研究食物和水。代谢笼被用于老鼠24小时尿液和粪便样本的收集。总之,DIC在DMSO或DMSO填喂法单独老鼠,老鼠的粪便和尿液用代谢笼收集每笼老鼠(5)24 h后DIC管理局(治疗组 ,5毫克/公斤体重)或车辆(对照组, )。老鼠血液样本收集从麻醉小鼠的心脏穿刺2 h后车辆管理局或DIC,整个血液样本在8000×g离心液10分钟4°C孤立等离子体。在分析之前,所有样本存储在−80°C。

2.3。粪便、尿液和血浆的样品制备

代谢的收购,六块的粪便样本(控制和治疗选择和均质1毫升的甲醇/ H₂O /醋酸(90/10/0.1,v / v / v)解决方案3分钟,然后在12000×g离心10分钟4°C。一个整除(200μL)的上层清液和稀释20倍后分析。的尿液和血浆样本deconjugated酶与轻微的修改(如前所述20.,21]。总之,100年μL从每个样本(控制和治疗)孵化了β葡萄糖醛酸酶(250 U)和硫酸酯酶(3 U) 90分钟在水浴37°C。反应就熄了通过添加同等体积的甲醇含1%醋酸和离心机12000 g×10分钟4°C。整除的上层清液储存在前20°C−分析。

2.4。在体外粪便分批发酵试验

三个健康志愿者(平均年龄32.5岁;平均体重69.5公斤;不吸烟者)参与了这项研究,他们都是不超过6个月的研究开始之前,和他们没有采取polyphenol-rich食品超过前两天大便样本集合。粪便样本收集和运输立即处理的厌氧条件,在2 h。在厌氧条件下,50克的新鲜收集粪便样本中均质杀菌兜包袋有100毫升的水含有0.05%蛋白胨。颗粒材料在3000 rpm被离心约2.5分钟,然后凳子的上层清液浆混合35% presterile甘油和存储在使用前−80°C。为在体外发酵实验,人类粪便池泥浆是由直接混合同等体积的凳子泥浆从每个主题。发酵基础培养基包含80年约4%的渐变,和2%的蛋白胨是刚做好的,之前热压处理过的研究。五μL DIC的解决方案在DMSO溶液(5毫克/毫升),5毫升的发酵培养基,和0.5毫升的汇集人类粪便浆混合然后整除3套样品(1.5∼每毫升)来表示0,12和24小时时间点。在厌氧条件下,样本发酵在37°C和收获相应的时间间隔。一旦收获,450μL的上层清液和淬火增加900μL(乙腈(0.2%乙酸)。样本在12000×g离心10分钟,然后整除(200μL)的上层清液被转移到液相色谱瓶进行分析。

2.5。HPLC-LTQ-Orbitrap条件

高效液相色谱法进行高效液相色谱系统由脱气器,四元泵,柱室,一个从Thermo-Finnigan autosampler(美国热电子有限公司)。Phenomenex双子座C18柱(3.0毫米×150毫米;5μm;托兰斯、钙、美国)用于分离柱温度设定在35°C。高效液相色谱条件是我们之前描述的一样14]。简言之,流动相的成分是5%的水和95%甲醇含0.1%甲酸作为流动相,95%的水和5%甲醇含0.1%甲酸作为流动相梯度洗脱程序发起10% B 5分钟,然后从5到10分钟增加到25%,从10到30分钟,60%到100%从30到40分钟,5分钟,然后保持不变。列是平衡与10%的B 5分钟之间运行。流量被设定为0.3毫升/分钟和10µL为每个样品注射。

一个Finnigan LTQ-Orbitrap XL质谱仪加上一个电喷雾电离(ESI)接口(热电子、不来梅、德国)是用于质谱集合。氮被用作鞘和辅助气体30和10个任意单位,分别应用和氦气体碰撞。管透镜和毛细管电压在65 V和250 V,分别。质谱仪将重复循环组成的一个完整的扫描女士MS / MS扫描紧随其后。质谱收集m / z50到500阿姆河正电离模式。Collision-induced离解(CID)女士的能源被设定为35ⁿ分析一组隔离宽度在1.5阿姆河和激活时间设定为30毫秒,分别。使用Xcalibur进行数据采集和分析软件(2.2版本,热电子、圣何塞、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。代谢DIC在老鼠的命运

在目前的研究中,HPLC-LTQ-Obitrap /女士被用来探索DIC的主要代谢物样本。提取离子色谱图共同的代谢物检测DIC-treated老鼠粪便,血浆的,尿样品如图1。从vehicle-treated样品收集的老鼠相比,9个主要代谢产物被观察到。M1-M5和M8被数根据我们先前的研究中,和新确定代谢物(M9-M11)的色谱保留时间顺序编号。通过比较LC / MSⁿ数据和保留时间对我们以前微粒体研究和其他文献[14,22,23),六个代谢物被明确认定为furo [2, 3 b] quinolin-4-ol (M1), 3 - (1, 2-dihydroxyethyl) 4-methoxyquinolin-2 (1 h)——(M2), 3 - (2-hydroxyethyl) 4-methoxyquinolin-2 (1 h)——(M3), 4-methoxyfuro [2, 3 b] quinolin-6-ol (M4) robustine (M5)和4-methoxy-furo [2, 3 b] quinoline-9-oxide (M8)。M9-M11的结构被解释初步阐明他们的精确分子量和特征离子收集来自LC-LTQ-Obitrap /女士。

3.2。识别的M9 (NAC-DIC共轭)

观察M9的质子化了的分子量m / z361.0854 [M + H]⁺和分子式计算C₁₇H₁₇O₅N₂161年代,阿姆河高于[M + H]⁺DIC,表明南汽在迪拜国际资本公司。女士²M9的光谱(图2)显示产品离子特征m / z−232.0431 [M + H C₅H₈没有₃]⁺−200.0708 [M + H C₅H₈没有₃]⁺和162.0219 [M + H−C₅H₈没有₃S]⁺,这表明这种代谢物mono-NAC DIC的加合物。的女士²碎片离子的m / z200.0708对应一个南汽分子的损失和碎片离子的串联质谱(MS³:200.0708/361.0854)相同的DIC,表明DIC的结构保持不变(14,15]。这一结果表明,NAC是呋喃环的共轭。

3.3。代谢物M10和M11公路的识别

两个代谢物,M10和M11公路初步确认根据准确的重量和质量分散模式。M10被确认的质子化了的分子量m / z220.0609 [M + H]⁺计算,其分子式为C₁₁H₁₀没有₄,20岁的阿姆河高于[M + H]⁺DIC。女士ⁿM10(图的谱3)生成特征碎片离子m / z205.0371 [M + H−CH₃]⁺,m / z202.0609 [M + H−H₂O)⁺,m / z176.0712 [M + H−有限公司₂]⁺,m / z161.0475 [M + H−有限公司₂−CH₃]⁺。总之,M10初步确认为dictamnic酸。

M11公路展品分子量217阿姆河由质量离子m / z218.0815 [M + H]⁺,18岁的阿姆河高于[M + H]⁺DIC。计算公式是C₁₂H₁₂没有₃。女士²光谱(图4)的M11公路生成产品离子特征m / z203.0581 [M + H−CH₃]⁺,m / z190.0867 [M + H−有限公司)⁺,m / z−176.0710 [M + H C₂H₂O)⁺,m / z−161.0475 [M + H C₂H₂O−CH₃]⁺,m / z−148.0759 [M + H C₂H₂O−有限公司)⁺支持,M11公路2 - (2-hydroxy-4-methoxyquinolin-3-yl)乙醛。

3.4。新陈代谢DIC的人类的肠道微生物群

研究肠道微生物群的影响在活的有机体内DIC的新陈代谢,DIC孵化了人类粪便池泥浆从三个健康的人。样本收获作为时间的函数,分析说明microbial-derived代谢物的质。图5提取离子色谱图显示了一个代表DIC代谢物与人类粪便池孵化后泥浆。DIC逐步消化,增加时间。与控制样本(从0 h时间点),一个新的高峰,保留时间为20.6分钟,从收集到的样本检测的时间点12 h,和这个峰的峰面积随着时间的增加而增加。这个峰值被确认为furo [2, 3 b] quinolin-4-ol (M1)通过比较其保留时间和串联质谱与那些从DIC-treated老鼠收集尿液和粪便样本。微生物的通路o-demethylation转换起着关键作用的多酚类物质和其他药物吸收后;此外,o-demethylation这些酚类化合物的抗氧化性能影响解放自由羟基,和最近的研究表明,肠道微生物群能够peonidin脱甲基,vanilic酸、花青素、酚类降解产物(24,25]。

4所示。结束语

总之,我们现在的研究表明,DIC,共同furoquinoline生物碱属于芸香料的家庭,可以广泛的老鼠体内的代谢。总共9个老鼠尿中代谢物,血浆的,和粪便样本,其中两个(M10和M11公路)是首次发现。代谢轮廓DIC的老鼠终于阐明(图6)。

此外,我们目前的研究表明,肠道微生物群中间体DIC的o-demethylation,导致DIC的脱甲基代谢物,M1。最后,DIC在小鼠体内的代谢途径,提出了这些数据显著DIC的进一步研究和临床前毒理学和/或允许智能评估在活的有机体内对老鼠进行的生物活性研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

渔洞Fu和洁具邓小平的贡献同样。

确认

我们感激地承认金融支持中国国家自然科学基金(81600684)和山东省自然科学基金(ZR2016HQ16) y邓。

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