文摘
25甲醇提取物来自各种罂粟科代表和小檗科植物的家庭(属:罂粟花,Argemone,Eschscholzia,Chelidonium,Glaucium,小檗属植物)是一个优化的方法筛选的生物碱含量适合LC-ESI-Q-TOF-MS分析。从四组十二药物重要异喹啉生物碱,aporphines, benzylisoquinolines, protoberberines, benzophenanthridines,出现在这些传统植物定量确定在每一个研究样本,提供他们的生物碱。Zorbax稳定债券RP-18列和流动相组成的0.1%甲酸和甲酸0.1%乙腈(v / v)是用于0.2毫升/分钟的流量。深刻研究优化女士回应四组异喹啉生物碱(验证毛细管电压、气体流动、喷雾器压力,除油船,和fragmentor电压),结果的重复性,稳定性和线性测量,显示,其中,毛细管电压3000 V, 350°C的气体温度,12 L / min的气体流动,喷雾器的压力35 psig,挡热电压65 V, 30 V碰撞能量最有利的操作参数。
1。介绍
异喹啉生物碱(中国船级社)氮气含次生代谢物来源于两种氨基酸苯丙氨酸和tyrosine-are最大的天然产品。他们都知道著名的药理作用和广阔的应用在现代pharmacotherapeutical策略单一的化合物或从整个植物制剂(1]。中国船级社、吗啡(一种阿片类镇痛药物)2),小檗碱(一种消化系统的兴奋剂,antiprotozoal antinociceptive,神经保护代理)(3),boldine(胆汁生产兴奋剂),可待因(镇痛药和止咳药补救)(4),加兰他敏(竞争可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂用于轻度和中度痴呆)(5),或罂粟碱(antispasmotic代理)应该列为常用药品(2]。
即使中国船级社组成各种各样的化学结构与不同程度的氧化,额外的戒指,和取代基,其基本骨架总是包含一个异喹啉一半或tetrahydroisoquinoline戒指4]。
中国船级社可以分成八组,四是评估提出了研究:protoberberines(占25%的所有中国船级社),aporphines, benzophenanthridines, benzylisoquinolines [4,6]。描述生物碱在本质上是普遍的,虽然他们的植物中最高的内容可以发现,在各种小檗科代表,罂粟科、毛茛科、芸香科、紫堇科、防己科(1,6]。由于显著的药理这些生物碱的重要性,全面验证分析的质谱条件,直接在植物提取物、提出了手稿。值得注意的是,仍然有一些从天然来源,鼓励作者讨论在提取他们的决心和后来的净化各种分离技术(4]。
基于在传统医学的应用和各种中国船级社确认提取,选择了小檗科、罂粟科代表本研究的目的。的重要性和使用属于属的植物物种罂粟花有着非常悠久的历史追溯到大约3000年前,当它已经服用鸦片的形式(包含一个复杂的生物碱)作为缓解疼痛的药物。此外,不同物种的罂粟被用于治疗上呼吸道疾病,咳嗽,声音沙哑和促进粘液的驱逐7]。伏牛花物种通常管理胆汁生产抗病诱导剂。这些广泛的灌木也具有退热剂,抗炎、止泻剂,王亚南属性(8),存在于各种各样的传统配方和顺势疗法。
即使这些植物已经使用了年龄在传统pharmacotherapeutical策略,还是小说药理应用程序进行了多项研究,揭示他们的选民的新可能的应用,如神经或抗癌活动(5,8]。
根据这些发现,有一种强烈的需要开发新的、更准确,具体,为他们的描述和精确的分析方法。电喷雾质谱(ESI)是一个敏感的分析工具,使单一化合物的决心在一个复杂的矩阵。它被发现提供高精度的数据,提供了一个成功的识别不同的异喹啉(9- - - - - -11]。这个手稿的目的是精心设计的高分辨率质谱仪的操作参数,LC-ESI-Q-TOF-MS,如破碎的能量,气体流动和温度,除油船电压,和喷雾器压力,提供高精度的定性和定量数据的确定中国船级社在植物材料。分析将在四个模型进行alkaloids-the代表不同子组的中国船级社来表示他们的分析行为。由于高知名度和显著的敏感性这一特定类型的质谱仪,优化结果可以应用在不同植物物种的上述植物的家庭。
此外,一些选定的生物碱的测定在优化的分析条件下将从罂粟中提取获得25日和伏牛花物种创建他们chemotaxonomical指纹和鱼最宝贵的一个最丰富的生物碱。
2。材料和方法
2.1。试剂
乙腈、水和甲酸的光谱纯度得到j·t·贝克(中心谷、PA、美国),而得到了提取溶剂从Avantor性能材料(格利维策、波兰)。0.45µm尼龙注射器过滤器(默克公司,达姆施塔特,德国)是用于过滤获得的提取物的浓度。参考化合物从ChromaDex购买Inc .(欧文、钙、美国)。
2.2。植物材料
不同种类的小檗科、罂粟科(表1)被削减(天线部分开花后,地下部分前的九月底霜),干40°C收集后,细粉,和冷冻前研究。每个工厂的样本是由作者根据凭证存储WKK2016M001-WKK2016M025标本编号。
所有罂粟种植在花园里的生药学,卢布林的医科大学。种子被来自世界各地的植物园,生药学的部门合作,对许多年了。植物被作者另外身份验证。的根源小檗属植物寻常的在卢布林在当地的草药商店购买,波兰。的地上部分小檗属植物siberica得到来自蒙古乌兰巴托的面积(从2015年9月),并验证博士Otgonbataar Urjin。小檗属植物cretica来自希腊的克里特岛岛(环境于西元2015年9月),被作者身份验证。物种研究中使用的列表在表1。
2.3。提取
1 g粉植物原料提取的加速溶剂萃取(ASE)装置由Dionex (ASE 100,桑尼维尔,美国)锁定在10毫升不锈钢容器,在下列条件:萃取剂:甲醇;温度:80°C;静态时间:5分钟;周期:1;冲洗量:50%;清洗时间:50年代。压力保持在ca 110巴。提取每个植物物种进行3次。获得的提取物稀释20毫升的体积,和1.5毫升的每个被转移到一个通过尼龙注射器过滤器和高效液相色谱瓶进行质分析。剩余的样本干在真空下50°C至干燥。
2.4。定性和定量提取高分辨率质谱分析
一个LC-ESI-Q-TOF-MS装置由安捷伦科技(美国圣克拉拉的CA)研究中的应用。高效液相色谱的仪器由色谱仪(1260系列),它包含一个脱气器(G1322A),二进制泵(G1312C),一个autosampler (G1329B),一个列烤箱(G1316A), PDA检测器(G1315D)和四极质谱仪(G6530B)和飞行时间分析。
获取高分辨率光谱的生物碱,积极应用电离作用模式。一个梯度的乙腈(B)和水(一个),添加甲酸,小心地调整,以提供足够的分离提取的色谱柱(Zorbax稳定债券RP-18列:150毫米×2.1毫米,dp = 3.5µm): 0分钟- 1%B在一个,10分钟- 40%B在一个,12分钟- 40%B在一个,17分钟- 95%B在一个,20分钟- 1%B在一个,停止时间:30分钟。0.2毫升/分钟流量,5分钟后,10µL注入体积,和m / z范围从40到1000设置方法的细节。分析了在25°C (10)在一个新校准仪器。两个最密集的信号同时分散在MS / MS分析。1的收集谱之后,他们被排除在外的0.3分钟分析收集更多的碎片数据从其他没那么强烈的信号。校准混合物同时给在分析作为内部标准维持高精度的测量。
提供生物碱的定量分析,四个参考compounds-representatives alkaloids-were评估研究的每个类:小檗碱(protoberberine生物碱)、小檗胺对该类生物碱丰富(一个),血根碱(benzophenanthridine类型),和magnoflorine (aporphine生物碱)。所有人都获得Chromadex(欧文、钙、美国)纯度高于95%。校准曲线方程R2值计算为每个参考化合物从6单独注射不同浓度在同一注入体积。
女士参数的优化研究是进行最多元的提取、甲醇提取物小檗属植物siberica基于每个变化的三个独立的注射参数。多数女士参数设置验证:毛细管电压变化从3000年到4000 V, fragmentor能量从75年到175年,天然气的温度从300°C到400°C,干燥气体流从10到12 L / min,喷雾器25至40 psig,除油船从40到70 V,和碰撞能量从10到80 V(表2)。
以下因素包含在验证的最佳评价方法:检测的极限(LOD)表示为信噪比(S / N) * 3(利息)的峰值附近的,量化的极限(定量限)计算的S / N乘以10 [12),线性(线性范围确定),和精度偏差(interday和盘中变化)的决定n= 5峰面积测量记录一次在同一天,另一个时间序列的最后48小时后从第一注入(表3)。
MassHunter B.07.00软件启用的传导分析和获得的光谱数据的管理。
3所示。讨论
3.1。LC-ESI-Q-TOF-MS操作的验证参数
研究的目的是展示行为的四个模型代表不同子组的异喹啉生物碱:BBR,属于protoberberines;合成天然气,benzophenanthridine生物碱;内侧膝状核,一个aporphine生物碱;对该类生物碱丰富和BBM,在各种条件下的大规模光谱分析。与描述的一般优化参数,如稳定性、可重复性,或精度偏差进行测试评估,评估一般质谱仪设置更罕见的科学文献。通常,普遍设置特征为每个应用分析实验室女士还各种次生代谢物的测定,包括生物碱、给女士不准确测量。作者的目的是展示的影响不同的操作参数,如温度,压力,大量的生物碱和电压的分析提取的兴趣。表2显示4生物碱的峰面积百分比差异决定在西伯利亚伏牛花草methanolic提取,应用在不同的光谱条件。为此,最高的峰面积每组被分配100%的强度,和其他人计算相对于前者。峰面积测量的偏差是观察到的这个复杂的矩阵的谱b . siberica提取提供标准的分析条件,大大不同于单一参考化合物注射。因为它提出了表2,大多数选择参数确定仪器的最终响应依赖于样品电离作用效率。
除了毛细管电压,确定所有参数被发现影响注射以类似的方式提取。这项研究表明,对该类alkaloids-delivered丰富berbamine-a代表更好的丰富在毛细管电压越高。这种行为可能是由于二聚的结构、高分子量、分子和更强的能量转换成一个离子。其他生物碱测试显示相反的反应。中心的应用条件,3500 V的能量被选为最有前途的和支持所有组的丰度最高的化合物。剩下的三化合物(BBR,合成天然气,内侧膝状核),毛细管电压低于3000 V的减少并没有带来更好的结果。
同时,其他女士仪器参数显著影响了样品的量化。结果显示在表2,fragmentor电压是重要的注入离子的生成的矩阵。其电压越低,越小数量的离子分析仪检测到的。另一方面,高电压,如175 V仪器入口处,即使提供最高峰值区域,导致更快的碎片已经在源的生物碱,导致光谱女士更加拥挤。考虑以上,150 V的能量被用于以下分析。
令人惊讶的是,航母气体的参数没有任何重大作用在这些生物碱的测定。气体和鞘气体的温度,测试的范围300 - 375°,类似于他们的流动(从10到12 L / min)诱导只有轻微的,无关紧要的偏差。
另一方面,喷雾器压力和漏杓电压被发现大大影响分析。高达平均下降35%所有生物碱的峰面积计算的压力25 psig与35 psig。Aporphines被发现为这个参数的变化最敏感。35到40 psig的应用导致的最高反应装置。小檗胺的峰面积是最耐应用能量。
除油船60和65 V的电压被发现是最有益的,相反40 V,发生边界设置,上面,观察操作灵敏度显著上升。
最后一个参数优化是相对应的CID能源MS / MS光谱的形成。一系列的碰撞能量从10到80 V测试在寻找好这些生物碱的碎片。光谱结果显示明显的差异取决于CID能源应用。已经获得了足够的分裂模式对这些生物碱在30 V,仍然提供分子峰的存在。
低能量的值显示非常弱的碎片,当使用最高,撞成很小的碎片结构识别麻烦。获得列表片段表测试所有的精力了4。
考虑以上的观察,以下分析方法包括生物碱测定的最佳条件是由:毛细管电压3500 V, fragmentor能源从150 V,气体温度从350°C,干燥气体流从12 L / min,从35 psig喷雾器,除油船从65 V, CID从20到30 V和碰撞能量。即使所有描述条件接近,验证了方法参数肯定会提供更好的结果。
一些科学论文显示异喹啉生物碱的测定样品的不同来源,像人类血浆,软体动物,或不同的中药制剂含有多种植物提取物。在研究元et al。13),生物碱的测定是在正面和负面电离作用模式的毛细管电压3000 V,干燥气体温度达到325°C,喷洒350集的气体压力研究延胡索草。施等。14应用毛细电压3000 V, 35 V的碰撞能量,6 V的破碎能量研究大鼠血浆成分。周还et al。15使用一个质器异喹啉的决心。在他们的研究莲莲属化合物,科学家们应用3000 V在300°C毛细管和温度确定成分具有抗炎作用。根据上述讨论优化,先前发表的参数,即使正确,似乎不使用的最大精度光谱仪。
3.2。方法验证
LOD和定量限的值计算为每个生物碱通过一系列样本稀释注射10µL体积的优化参数。前者计算S / N 3: 1,后者的S / N 10: 1根据Saadati et al。12]。
所有测量值的钟表都远低于线性范围匹配生物碱如表示3多样在18岁到47 ng / mL。测量范围内的定量限住61 - 157 ng / mL。所有绘制校准曲线的参考化合物被发现有很好的线性相关系数值高于0.997。在优化方法中,装置的反应小的生物碱浓度高,线性范围内0.1 -250µg /毫升,类似于那些决定在其他设备(10]。盘中的偏差结果interday和精密测量的生物碱是低于5%,证实了高稳定性的方法。
3.3。确定选择提取生物碱的罂粟科和小檗科代表
25获得提取物选择罂粟科(属:罂粟花,Eschscholzia,Chelidonium,Argemone,Glaucium)和小檗科物种(小檗属植物spp)进行定性和定量的成分的优化方法。根据科学文献,以下生物碱从4组中国船级社预计将发生在样品分析:BBR, JTR, STP,合成天然气,格瓦拉,手臂,BBM, OBB和冠心病(数字1和2)[16,17]。他们都是确定的,使用验证方法,作为独立的山峰,依照科学文献,他们分散模式,Metlin数据库,并参考化合物的行为。所有化合物都是量化使用校准曲线(表描述的前身3生物碱)的四个模型。中提供的数据表3。
上市化合物被选择因其显著的药理活性和净化的日益增长的兴趣和活动评估,介绍了研究植物净化的潜在来源。小檗碱作为最广泛的化合物,已经彻底的研究。然而,其余化合物仍然需要更多的关注和准确评估植物化学的概要文件。
BBR中检测出从罂粟科植物物种和小檗科,并可能被视为chemotaxonomic这些家庭的标志。如詹森和Kadereit所述18),这个生物碱是存在于所有Ranunculiflorae-in小檗科,紫堇科、防己科、罂粟科、Ranunculalceae代表。伏牛花的提取物种并没有透露任何合成天然气,切,或冠心病与罂粟花。
BBM OBB伏牛花物种较为丰富,特别是在他们的地下部分,而aporphines传播更多同样代表之间的两个家庭。PLT陪同BBR多数的提取,而STP在场的伏牛花物种进行了研究。根含有更高浓度的样品生产的生物碱;然而,仍然较高的化合物的多样性是在绿色的植物部分。小檗属植物根提取物属于最多样化的,但样本的数量的确定生物碱高。小檗属植物cretica包含最高数量的内侧膝状核(∼7%)(图2),小檗属植物寻常的包含的最高数量BBR (∼5.7%)。罂粟花nudicaule是最丰富的BBR罂粟,Eschscholzia californica包含了最多(4.6%)的JTR STP(3.7%),草,和罂粟花pseudo-orientale的特点是高含量的PLT最高(5.7%)——在所有测试提取物。罂粟被发现包含三分之二的量化benzophenanthridine生物碱:合成天然气(p . caucasicum最高的内容)、切(Argemone开大花的草)。最丰富的化合物在所有测试提取是N-methylcoclaurine-an aporphine中发现p . pillosum在最高浓度的1.5%(表5)。
4所示。结论
评估LC-ESI-Q-TOF-MS方法导致了成功的决心12药物重要异喹啉生物碱25 methanolic提取物罂粟科和小檗科代表,精度高,稳定性和重复性的结果。选择的定量分析生物碱在许多植物提取物显示新的潜在来源的隔离这些药物有价值的分子。
缩写
| 臂: | Armepavine |
| BBM: | 小檗胺 |
| BBR: | 小檗碱 |
| 冠心病: | Chelidonine |
| 格瓦拉: | 白屈菜赤碱 |
| CID: | Collision-induced离解 |
| 中国船级社: | 异喹啉生物碱 |
| JTR: | Jatrorrhizine |
| 内侧膝状核: | Magnoflorine |
| 女士: | 质谱分析 |
| NMC: | N-Methylcoclaurine |
| 新的: | Obaberine |
| PLT: | 非洲防己碱 |
| STP: | Stylopine |
| 抽搐: | 总离子电流。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者是支持的国家研究和发展中心,波兰,项目4号/ POLTUR-1/2016。