克氏锥虫ntpase -1的固定化及在线无标记检测方法的建立 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

摘要

使用IMERs(固定化酶反应器)作为固定相耦合到高效色谱系统是一个有趣的方法来筛选新的配体。此外，与在溶液中使用酶相比，IMERs提供了许多优势。核苷三磷酸二磷酸水解酶(ntpase -1)鲁兹锥体作为病原体感染的促进剂，是寻找抑制剂的好靶点。本文采用ICERs(固定化毛细管酶反应器)对ntpase -1进行固定化。建立并验证了一种液相色谱法来监测ICER活性。对这些生物反应器的应用条件进行了研究，取得了良好的效果。该酶被成功地固定化了，并被检测到催化活性TC.NTPDase-1-ICER色谱系统。对底物ATP进行了动力学研究0.317±0.044 mmoll⁻¹，与溶液相比仍具有较高的亲和力。此外，ICER的稳定时间为32天，足够的时间来调查可能的抑制剂样品，特别是化合物苏拉明，抑制51%的酶活性在100μ.摩尔l⁻¹，这与溶液中酶的数据相符。

1.介绍

被忽视的热带病是由传染病和寄生虫引起的一类疾病。南美锥虫病、昏睡病、利什曼病和血吸虫病等热带传染病主要影响最贫困人口，威胁着全世界10多亿人的生命，其中包括5亿儿童[1］．恰加斯病，也被称为美洲锥虫病，是一种由原生动物寄生虫引起的潜在威胁生命的疾病鲁兹锥体．该病主要发生在拉丁美洲，在那里它通过锥蝽臭虫的粪便传播给人类，锥蝽臭虫被称为“接吻臭虫”，或根据地理区域而命名的其他名字。其他传播方式包括输血、先天性传播和器官移植。根据世界卫生组织(世卫组织)的资料，恰加斯病影响了600万至800万人;每年约有12,000人死于这种疾病。大约有6500万人面临感染风险，每年有20万新病例出现。

自1909年首次对恰加斯病进行临床描述以来，已经测试了几种治疗方法;然而，目前还没有发现安全有效的药物。目前可用的药物在疾病的慢性阶段疗效较低，并造成严重的副作用[2］．

来自CD39/GDa1家族的核苷三磷酸二磷酸水解酶或淀粉酶(NTPDase, EC 3.6.1.5)属于水解酶组。这些酶存在于几种生物体中，包括刚地弓形虫［3.]，t . cruzi［4]，t . evansi［5]，阴道毛滴虫［6]，和婴儿利什曼虫［7］．来自寄生虫的NTPDase可水解细胞外核苷三磷酸和二磷酸，从而影响宿主的免疫反应[8- - - - - -10.］．到目前为止，只描述了一种NTPDaset . cruzintpase -1与本种毒力因子有关。部分酶抑制剂或抗ntpase -1抗体对ntpase -1的抑制降低了ntpase -1的水平t . cruzi粘附，降低宿主细胞感染，减弱实验感染的毒力[4，11.，12.］．这些酶的一个特殊特征是存在5个apyrase保守区(ACR)，它由一小段含氨基的残基组成，这些残基对酶的功能至关重要[9］．这一特性使ntpase -1成为在线检测的一个目标，试图发现新的选择性配体。

ATP转换为AMP或ADP艾滋病动力学研究和调查小分子对酶活性的影响TC.NTPDase-1。该反应将成为药物发现过程中筛选配体的重要手段。

已经提出了几种测定以监测ATP依赖性酶的ATP水解活性，包括荧光和量热检测ADP地层，ATP消耗[13.，或无机磷酸盐(Pi)释放[14.通过偶联酶和离线液相色谱分析[15.，16.］．基于孔雀石绿色试剂（Mg）的比色测定[17.]允许对酶释放的Pi进行定量，是最常用的方法。然而，该分析方法是一个间接的过程，有一些相关的缺点:一些目标化合物和MG有相似的波长吸收;缓冲液中的Pi污染可能导致错误的结果;使用高底物浓度是不可行的。

生物亲和层析是一种最通用和最有前途的替代传统的分析方法。在生物亲和柱中发生的相互作用类似于在许多生物系统中发生的相互作用。这些相互作用的高特异性提供了高选择性[18.］．将酶固定在色谱载体上比在溶液中使用游离酶有几个优点。例如，基于固定化酶的技术(i)需要小样本量和减少样品处理，从而防止污染;(ii)由于温度控制更大，使酶的寿命和稳定性增加;(iii)允许使用范围更广的有机溶剂和pH值，而不显著损失催化活性;(iv)使酶和反应产物易于分离[19.，20.(五)使酶的再利用成为可能。

在抑制研究中，许多来自寄生虫的酶已被证实为靶点，这为酶的潜在药理应用指明了方向。例如gGAPDH酶t . cruzi［21.人类[22.]被固定在熔融石英毛细管上，用作筛选抑制剂的工具;对人酶进行研究以评价其特异性。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)曼氏裂体吸虫(血吸虫病)23.人类[24.已被固定化，可作为通常偶联分析选择性筛选配体的替代方法[25.］．其他作者(26.]固定寄生虫本身;例如，寄生虫锥虫属brucei(昏睡病)和利什曼虫主要(利什曼病)被固定在热可逆凝胶上，它们可以用来评估靶酶的抑制作用。

这项工作报告了一种评估NTPDase-1的活动和抑制的新方法t . cruzi．该方法包括一种无标记的测定，其使用基于的固定化毛细血管酶反应器TC.ntpdase-1（TC.ntpase -1- icer)与高效液相色谱系统耦合，可用于酶学研究，包括动力学分析和配体鉴定。据我们所知，这是第一次TC.NTPDase-1已将共价固定在毛细管上，并且通过在线方法成功监测ATP酶活性TC.NTPDase-1-ICER。

2.材料和方法

2.1。试剂和化学品

酶TC.NTPDase-1（EC 3.6.1.5，来自t . cruzi)表达及纯化，如其他地方报道[11.[已描述的修改[12.］．其底物为腺苷5 ' -三磷酸二(三)盐水合物(ATP)、腺苷5 ' -二磷酸钠盐(ADP)、腺苷5 ' -一磷酸二钠盐(AMP)、鸟苷5 ' -三磷酸三盐(GTP)和鸟苷5 ' -二磷酸三盐酿酒酵母酿酒酵母(GDP)购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。缓冲液成分和表达、纯化、固定和色谱过程中使用的所有化学物质均来自Sigma、Merck(德国达姆施塔特)和Acros(比利时Geel)。所有制剂中使用的水都来自于milliq®系统(Millipore®，São Paulo，巴西)。熔融石英毛细管(0.375 mm × 0.1 mm I.D)来自Polymicro Technologies公司(Phoenix, AZ, USA)。所有缓冲液通过0.45过滤μM膜过滤器的尼龙Millipore和在HPLC实验中使用前脱气。

将纯化的酶溶液样品冻干。简单地说，这些样本被移液到一个玻璃小瓶中，用液氮冷冻。然后，将它们放入FTS LyoStar冻干机(Stone Ridge, NY)中。初始温度设置为−1°C，样品在此温度下保存约1 h后冷却至−35°C。干燥在70mtorr的腔室压力下进行4小时。冻干后的酶保存在−20°C的冰箱中。使用前，将酶称重、定量，并重悬于50 mmol L的固定化缓冲液中⁻¹Hepes ph 8.0和0.3mol·L⁻¹．

2.2。仪器

使用哈佛仪器(Holliston, USA)的11 Plus先进单注射器泵和双RS-232固定酶。TC.ntpase -1- icer被放置在岛津高效液相色谱系统(岛津，京都，日本)，由两个LC 20AD泵组成。其中一个泵包含一个用于低压梯度的FCV-20ALvalve、一个UV-Vis检测器(SPD-M20AV)、自动取样器设备(SIL-20A)和一个六端口三路开关Valco取样阀(Supelco, St. Louis, MO, USA)。数据是通过岛津CBM-20A系统与计算机接口获取的;使用Shimadzu-LC Solutions (LC Solution 2.1)软件(Shimadzu，京都，日本)。采用Versa Max-Molecular Device (Silicon Valley, CA, USA)的酶标仪(Elisa)。

２.３.缓冲区

缓冲一个: Tris-HEPES(2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇-4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸⁻¹， pH 8.0，含3 mmol·L⁻¹MgCl₂(氯化镁)，116 mmol·L⁻¹NaCl，（氯化钠）和5.4mmol·L⁻¹氯化钾(氯化钾)。缓冲B: Tris-HEPES (250 mmol·L⁻¹pH 8.0)，含15 mmol·L⁻¹MgCl₂580更易·L⁻¹NaCl和27 mmol·L⁻¹KCL。缓冲C: 50更易·L⁻¹KH₂宝₄(磷酸二氢钾)，含80 mmol·L⁻¹NH₄氯(氯化铵)和3 mmol·L⁻¹TBHS(四丁基硫酸氢铵)，pH 4.7。缓冲D: 50更易·L⁻¹KH₂宝₄, pH值7.4。缓冲E: HEPES 50 mmol·L⁻¹，pH 8.0包含300mmol·L⁻¹NACL。

２.４.活动的自由TC.NTPDase-1

测定在96孔微孔板中进行。采用酶标仪(Elisa)测定吸光度。为评价蛋白磷酸酶活性，采用孔雀石绿比色法[27.］．

通过添加150构建Pi(游离磷酸盐)标定曲线μL (A和10μ标准KH的L₂宝₄1.5 mg·ml⁻¹在第一井和80 μL的缓冲液，然后进行连续稀释。

通过添加16评价酶活性μL (B)等于3μ核苷酸25 mmol·L⁻¹（ATP，ADP，GDP或GTP），0.5 μg酶，足够的水完成80 μL，其次在37℃下孵育10分钟。

对于校准曲线和酶反应，80 μL HCl 0.2 mol·L⁻¹(在第二种情况下，是为了停止反应)。接下来,40μ比色剂(钼酸铵86 mmol·L⁻¹/孔雀石绿色0.2％1：3）加入。将混合物在室温下温育10分钟并在650nm处读数。分析一式三份进行。

2．5．固定的TC.NTPDase-1

将纯化后的酶和/或冻干后的酶重悬于固定化缓冲液中，最终浓度为0.03 mg·mL⁻¹TC.通过使用已经用于固定酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的方案来制备NTPDase-1-ICER的制备方法[21.，22.乙酰胆碱酯酶（疼痛）[28.］．总之，在流速下使用注射泵130 μL·敏⁻¹，毛细血管μ用2.0毫升2mol·L清洗m i.d×0.375mm×30cm）⁻¹盐酸溶液，然后1.0 mL蒸馏水。该程序去除毛细管内表面的杂质，使硅醇基团进入毛细管[29.］．然后在95°C下干燥1小时。将1.0 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(10% v/v)溶液在水中通过毛细管，在95℃烘箱中烘干。毛细管在室温下保存过夜。

戊二醛溶液1% (v/v)缓冲D(2.0 mL)通过氨基丙基二氧化硅(APS)毛细管，以去除过量戊二醛，避免聚合;用缓冲D（0.5毫升）。通过通过0.5ml来进行酶固定化TC.NTPDase-1（0.03 mg·ml⁻¹)缓冲E通过毛细血管，三次。不使用时，TC.ntpase -1- icer保持在4℃，毛细管两端浸泡在缓冲液a中。固定化率使用Bradford先前描述的方法评估[30.];为此，固定过程前后测量酶溶液。

2.6。色谱条件

TC.ntpase -1- icer经Buffer A处理，流速为0.03 mL·min⁻¹和25°C;采用二维方法的第一维。然后,TC.ntpase -1- icer与Phenomenex Luna C18 (100 Å 250 × 4.6 mm, 5μM）分析柱以1.0ml·min的流速⁻¹缓冲液C: MeOH (84: 16 v/v) [15.，31.］．紫外线检测在λ= 254nm通过三通开关样本阀，形成二维系统。酶反应发生在第一维度（TC.ntpase -1- icer)，底物和酶产物(分别为AMP、ADP和ATP)在第2维(C18分析柱)进行分析分离。

2.7。方法的验证

通过使用适当的解决方案，通过绘制抗峰面积以防止分析物浓度来构建ADP和AMP校准曲线。在以下浓度下一式三份制备两个样品：700,500,400,300,200,100,50和25 μMol·L.⁻¹．等分试样（10. μl）注射到偶联的空毛细管（30.00cm）中。通过在三种不同浓度下分析质量控制样品来获得该方法的内部和间间精度和准确性：12.5,6.25和3.125 μMol·L.⁻¹．制备各种浓度的五个样品并在三天内分析。定量限制的验收标准是三个样品的精度应低于50％的变化。通过采取信噪比来计算检测极限.Anvisa（巴西国家卫生监管机构）为生物分析方法建立的参数[32.，33.[评估选择性，线性，可重复性，定量精度，准确度，量化限制（LOQ）和检测极限（LOD）

2.8。动力学研究

2.8.1。试验在TC.NTPDase-1-ICER

的网上活动TC.ntpase -1用验证过的方法测定TC.NTPDase-1-ICER二维方法。ATP储备溶液以0.5,1和10mmol·L的浓度制备⁻¹．执行动力学研究，10 μ不同浓度的底物ATP (0.025 ~ 7 mmol·L)⁻¹）由储备溶液制备并以三份注入。使用Sigma Plot软件版本11.0的非线性回归分析用于确定价值观。

2.9。抑制研究

2.9.1。试验在自由TC.NTPDase-1

两种化合物，氯化钆(gadolinium chloride, GdCl .)的抑制活性_3.)和苏拉明钠盐，朝向免费TC.NTPDase-1评估。在96孔微孔板中加入16μL (B)等于3μATP 25 mmol·L⁻¹，0.5 μg酶，1 μL抑制剂样品100μMol·L.⁻¹和足够的水来完成80个μ每个井里都有L。然后在37°C孵育10分钟。接下来,80年μL HCl 0.2 mol·L⁻¹(停止反应)和40μC的比色剂（钼酸铵86mmol）⁻¹加入孔雀石绿0.2% 1:3)，室温孵育10 min，在650 nm读取。分析进行了三个重复。抑制是根据活性的降低来计算的。

2.9.2。试验在TC.NTPDase-1-ICER

对目标化合物的抑制活性TC.研究了NTPDase-1-ICER。到这个结束，10 μl含有1mmol·L的样品⁻¹ATP和100μMol·L.⁻¹将评价的化合物注射到研制的药物中TC.NTPDase-1-ICER系统在室温下。通过比较在不存在和靶化合物存在下记录的酶活性来计算抑制百分比。公式,在那里产品浓度是在分析的化合物和存在的情况下获得的吗为在没有评价化合物的情况下计算的产品浓度，被采用。进一步评价分析化合物对核苷酸分离的影响(对照化合物);它确保了酶的活性可以在这些化合物存在的情况下被测量。

3.结果与讨论

３．１．固定

在酶表面和反应性基团之间发生固定化过程，得到载体的反应基团。在这项研究中，我们使用Schiff的碱基形成共价固定使用戊二醛作为垫片;它是一种应用于不同支持的常用技术[34.］．这项技术是基于我们研究小组报道的成功将酶固定在熔融石英毛细管上[21.，28.］．熔融石英毛细管是选择用于NTPDase-1固定化的载体。先前报告的条件用于构建TC.NTPDase-1-ICER。

用醛基激活二氧化硅毛细管管使能够与N-末端基团（PKA 7.5）和赖氨酸残基（PKA 10.5）发生固定。确保固定的TC.NTPDase-1通过n端氨基与醛在载体上形成席夫碱，我们用pH 8.0 (缓冲E)。在这些条件下，赖氨酸残基的氨基被质子化，无法与醛结合(图)1)。这一过程提供了选择性固定化和最小化酶结构构象变化[35.］．此外，用于固定的缓冲液(缓冲E）基于溶液中游离酶的研究选择;在这里，我们尝试模仿这些靶酶的催化性质的保护条件[12.］．

图2

二维系统原理图及开关阀门位置。位置B:立柱调理;位置A:耦合柱。在色谱条件优化的二维体系(图1），Phenomenex Luna C18（100Å250×4.6 mm，5 μm）分析柱用缓冲液C：MeOH（84：16V / v），流速为1.0ml⋅min⁻¹及紫外线探测nm导致ATP、ADP和AMP的最佳分析分离(图2)。表格1总结了所有的优化条件。


泵	时间(分钟)	阀位	事件

一个	0.0 - -0.3	1	酶促反应TC.NTPDase-1-ICER
B	0.0 - -0.5	1	分析柱调理
一个	0.31-8.0.	2	分析物转移到分析柱
一个	8.01 - -20.0	1	TC.NTPDase-1-ICER调理
B	8.01 - -20.0	1	第二维层中分析物的分析分离

泵A:流量:0.03 mL⋅min⁻¹，洗脱液：缓冲A.泵B：流量：1.0ml⋅min⁻¹，洗脱液:缓冲液C:甲醇(84:16;v / v)。

采用Bradford法测定固定化率[30.];固定化过程后的酶解被评价，任何显著量的残余酶被观察。这些结果表明固定化率为100%。该酶被成功地固定在毛细管上，其酶活性得以保留。

3．2．NTPDase-1-ICER二维方法

生物反应器不能分离底物(ATP)和产物(ADP和AMP)。因此，核苷酸是通过离子对色谱在第2维使用等度洗脱分离的。离子对色谱(IPC)可以看作是反相色谱(RPC)的一种改进。IPC条件的唯一不同是在流动相中加入离子对试剂(TBHS)，然后在平衡过程中与电离的核苷酸相互作用[36.］．在文献分析的基础上，优化了流动相组成和流速，采用高效液相色谱法在多孔固定相(C18)上分离5 ' -三磷酸盐及其反相[15.，31.］．该方法应具有较高的选择性和分辨率。离子对色谱分离对pH变化敏感，且缓冲液A从第1维转移到第2维，因此需要优化耦合时间。因为第二维的流动相没有接触TC.NTPDase-1-ICER，可以安全地使用有机改性剂在等离子对色谱分离期间。

数字3.3个核苷酸分离的证据，分离因子良好(和)， AMP(1)、ADP(2)和ATP(3)的保留时间分别为14 min、15.5 min和18 min。在相同的色谱条件下，用标准溶液进样，比较保留时间，鉴别出条带。该条件用于验证色谱方法，筛选抑制剂。

3.3。色谱法验证

为了量化产品，采用各色谱带的面积，并推断校准曲线。该方法被验证，为ADP和AMP构建了校准曲线。注射浓度与峰面积之间的关系是线性的：，，为ADP和，，适用于amp。支持信息（SI）数字S1和S2（在线提供的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9846731.）包含有关此问题的更多详细信息。盘中精度表示为变异系数（CV％）;接受小于或等于15％的CV值。精度被确定为通过验证方法提供的平均值与添加浓度的参考值之间的比率百分比。对于准确性，接受小于或等于15％的偏差。变异系数（CV）提供了内部和中间变异性CV的型号为0.22-12.1％，精度值范围为ADP的97.3％至106.5％，精度值为0.21至3.02％，准确值为AMP的98.7至107.4％．量化限制为12.5 μMol·L.⁻¹（RSD = 1.99％，精度为83.5％）和25 μMol·L.⁻¹(RSD = 2.02%，准确度106.8%)。方法的检出限为10μMol·L.⁻¹和15μMol·L.⁻¹对于信噪比为3的ADP和AMP，支持信息(SI)表S1和S2包含额外的详细信息。该方法的选择性通过对每个序列前后的空白样品进行分析来保证。评价参数值满足生物分析方法的要求。

3.4。测定催化活性和稳定性TC.NTPDase-1-ICER

为了监测酶活性，通过验证的方法比较使用酶ADP和AMP的带状ADP和AMP的增加，其中使用底物ATP（或者GDP和GPP作为底物的GMP）进行比较TC.NTPDase-1-ICER。将色谱带与当空毛细血管耦合到色谱系统和10时获得的色谱带进行了比较 μL of ATP 1MMOL·L⁻¹被注射进去了。如图所示4，保留时间为15.5 min(对应ADP)的条带增加，证实了固定化酶的活性。

一个很有趣的问题是酶的稳定性TC.NTPDase-1-ICER。酶保留了86％的初始活性，最多32天，但其后降低了。虽然32天并不长时间，但进行各种研究足以评价抑制动力学机制。该系统的巨大优点是重用酶的可能性，该酶与溶液中新鲜酶的消耗相比，这相比，该酶在溶液中的消耗相比。固定化的酶也允许分析再现性，因为它采用相同的酶重复时间。在溶液和固定后，还评估冻干形式中酶的储存。酶活性没有改变。图中描述的活动3.都记录了TC.ntpase -1- icer由冻干构建TC.NTPDase-1和TC.ntpase -1重悬在固定缓冲液中。冻干酶的最大贮存稳定性为180天。

虽然ATP和ADP已经被描述为NTPDases的底物，这些酶可以水解不同的核苷酸以及UTP或GTP [12.］．固定化过程可以影响催化位点或引起目标酶结构的构象变化。这里对不同核苷酸的酶活性进行了评估:ATP、ADP、GTP和GDP [12.］．结果表明，固定后酶的特异性保持不变，与溶液中的特异性相同：GDP> GTP> ADP> ATP。通过将酶活性评估通过如图所示的产品色谱峰面积的增加，通过评价单独监测的每个核苷酸的酶活性来完成所有测定3.．三磷酸腺苷(ATP)被选作下面所述的其他试验的核苷酸，因为它表现出良好的活性和分离性，而且它比其他的便宜得多。

3.5。决心为TC.NTPDase-1

动力学参数可以确定酶和底物之间的结合亲和力。对应于衬底的浓度，其中反应速率等于最大催化速度的一半。与之间的结合亲和力TC.确定NTPDase-1-ICER和底物ATP并与溶液中酶获得的文献结果进行比较[12.］．

在该实验中，增加ATP浓度（0.025至7mmol·L）⁻¹)使用。的价值是更易·L⁻¹．数字5代表迈克利斯霉菌胃。

底物浓度较低时，反应速率与底物浓度成正比。随着底物浓度的逐渐增加，反应速率的增加幅度较小。因此，夸张的轮廓与米凯利斯-曼腾方程一致。的发现固定化酶的价值比高于3.3倍溶液中酶的价值0.317和0.096分别为(12.］．这是预料之中的，因为几个因素可以影响固定化酶;例如，酶分子由于活性位点三级结构的变化而发生构象变化;空间效应，可以使酶的活性部位难以接近;或分别由底物和反应产物向酶催化位点和从酶催化位点的抗性扩散而产生的扩散传质效应[31.］．值得注意的是，酶在溶液中是在静态条件下，而在拟议的方法中，它们是在流动系统下。然而，酶活性和选择性保持在TC.ntpase -1- icer，这应该能够使用所提议的方法来筛选抑制剂。

3.6。抑制研究

进行抑制研究TC.评价固定化酶在抑制剂筛选中的应用。得到的结果TC.将ntpase -1- icer与抑制试验结果进行比较TC.NTPDase-1在解决方案。两种已知的NTPDase化合物已经经过测试;测定苏拉明和氯化钆。苏拉明此前已被证明能抑制重组蛋白TC.NTPDase-1。钆可以抑制体内异核苷酸酶活性t . cruzi，但不能抑制重组TC.ntpdase-1 [11.］．

1mmol·L的ATP浓度⁻¹(±3.15倍在本工作中使用的值确保了初始速度的饱和度和条件（）固定化的酶。已知浓度的苏拉司素的存在降低了水解基质的带状区域。更具体地，Sumarin显示抑制的51％。我们的数据与酶在溶液中对酶进行的抑制试验的结果同意 - 在Suramin存在下69％。此外，氯化钆不抑制酶，如预期的那样。数字6说明了产物ADP (15.5 min)在100的存在下吸收带的减少μMol·L.⁻¹苏拉明。

4。结论

采用高效的表达和纯化方法，在优化的复折叠缓冲液中获得了具有活性的酶;在溶液中稳定性可达90天。此外，纯化酶的等量之前提交冻干后保留酶活性后，直接再悬浮在固定缓冲液和固定在熔融石英毛细管。TC.ntpase -1是成功的，并通过二维评价该酶的活性和稳定性TC.NTPDase-1-ICER方法。转换器稳定约32天，足以研究几种可能的可能抑制剂样品。它被证明是评估酶活性和动力学参数的有效工具，允许未来的重要研究涉及配体 - 蛋白质相互作用。该方法是自动化的;分析需要少量样品。另外，该设备对已知的敏感性敏感TC.NTPDase-1抑制剂Suramin。基于用酶的候选抑制剂进行的测试，该方法是用于研究选择性抑制剂的有前途的工具TC.NTPDase-1表示对酶表征进行动力学研究的替代策略。

相互竞争的利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作得到了圣保罗州研究基金会(fapsp -2013/01710-1, 2008/04371-5)和国家技术和科学发展委员会(CNPq)的资助。Carmen Lucia Cardoso和Felipe Antunes call感谢高级协调发展(CAPES)、CNPq和FAPESP的研究和硕士奖学金。

补充材料

图S1。ADP校准曲线。图S2。AMP校准曲线。表S1。ADP定量的日内精密度(n = 5)和方法准确度。表S2。AMP定量的日内精密度(n = 5)和方法准确度。

补充材料

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化学分析方法杂志