JAMC 分析方法在化学杂志》上 2090 - 8873 2090 - 8865 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/9846731 9846731 研究文章 固定的NTPDase-1 鲁兹锥体和发展在线Label-Free化验 http://orcid.org/0000 - 0001 - 7503 - 4078 Calil 费利佩•安图内斯 1 秘鲁首都利马 朱莉安娜玛丽亚 1 de Oliveira 亚瑟•恩里克•Cavalcante 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 1101 - 6895 Mariotini-Moura 克丽丝汀 2、3 3 http://orcid.org/0000 - 0001 - 6122 - 1710 Fietto 朱莉安娜Lopes兰格 2、3 3 http://orcid.org/0000 - 0001 - 6239 - 6651 卡多佐 卡门·卢西亚 1 Ozkan 扶桑。 1 Departamento de Quimica Grupo de Cromatografia de Bioafinidade e Produtos Naturais Faculdade de所说Ciencias e Letras de小溪Preto 圣保罗 14040 - 901年小溪Preto SP 巴西 usp.br 2 Departamento de Bioquimica e Biologia分子 大学联邦de Vicosa 36570 - 000年Vicosa 毫克 巴西 ufv.br 3 西班牙de Biotecnologia Estrutural e Quimica药用em Doencas Infecciosas (INBEQMeDI) 圣卡洛斯 SP 巴西 2016年 14 12 2016年 2016年 27 04 2016年 31日 10 2016年 2016年 版权©2016费利佩•安图内斯Calil et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

使用IMERs(固定化酶反应器)作为高性能色谱固定相耦合系统是一个有趣的新配体的筛选方法。此外,IMERs提供许多优势技术,采用酶在溶液中。这种酶三磷酸核苷diphosphohydrolase (NTPDase-1) 鲁兹锥体作为病原体感染的主持人,这是一个很好的目标在寻找抑制剂。本文的固定NTPDase-1给予警察(酶固定化毛细管反应堆)。一种液相色谱方法开发和验证监测冷藏工人活动。这些生物反应器的应用研究的条件,和优秀的结果。成功的固定化酶,催化活性检测证明的 TcNTPDase-1-ICER色谱系统。动力学研究衬底ATP K 米 0.317±0.044更易 · l−1,它仍然高亲和力而提出的解决方案。除此之外,32天的冷藏工人稳定,足够的时间来调查的样本可能的抑制剂,其中尤其是复合苏拉明,抑制酶活性在100年的51% µ摩尔 · l−1,它是按照数据酶在溶液中。

 Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗 2013/01710-1 2008/04371-5 慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府 Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越 1。介绍

被忽略的疾病)组成的一组疾病引起的传染病和寄生虫。被忽略的如恰加斯病,昏睡病,利什曼病、血吸虫病,其中,主要是影响贫困人口,威胁着全球超过十亿人的生命,包括近十亿儿童( 1]。恰加斯病,也被称为美洲锥虫病,是一种潜在的威胁生命的疾病由原生动物寄生虫引起的 鲁兹锥体。这种病主要发生在拉丁美洲,其传播人类发生的地方通过锥蝽臭虫的粪便,称为“接吻bug”或其他名称根据地理区域。其他传播方式包括输血、先天性传播、器官移植。根据世界卫生组织(世卫组织),恰加斯病影响六至八百万人;大约每年12000人死亡这一疾病的结果。大约有6500万人感染的危险,每年有200000新病例出现。

自1909年第一个恰加斯病的临床描述,测试了治疗;但是,没有安全有效的药物被发现。当前可用的药物功效较低在慢性阶段的疾病和引起严重的副作用 2]。

核苷三磷酸diphosphohydrolases或apyrases CD39 / GDa1家庭(NTPDase EC 3.6.1.5)属于群水解酶。这些酶发生在一些生物体,包括 刚地弓形虫( 3), t . cruzi( 4), t . evansi( 5), 阴道毛滴虫( 6),而 婴儿利什曼虫( 7]。NTPDase从寄生虫可以水解细胞外三核苷二磷酸,从而影响宿主的免疫反应( 8- - - - - - 10]。到目前为止,只有一个NTPDase被描述 t . cruziNTPDase-1,这个物种的毒力因子有关。抑制NTPDase-1部分酶抑制剂或anti-NTPDase-1抗体水平的降低 t . cruzi附着力、减少感染宿主细胞和减弱毒性实验感染( 4, 11, 12]。这些酶的特定特性是存在五apyrase守恒的地区(ACR),它由短段amino-containing残留酶的功能是必要的( 9]。这个特性使得NTPDase-1目标发展的另一种在线检测,以发现新的选择性配体。

ATP转换放大器或ADP艾滋病动力学研究和调查小分子的酶活性的影响 TcNTPDase-1。这个反应可能成为一个重要的工具在药物发现屏幕配体。

提出了几个化验监测ATP-hydrolyzing ATP-dependent酶类的活性,包括荧光的和ADP形成的量热检测,ATP消费( 13),或无机磷酸盐(π)发布 14由耦合酶),离线液相色谱(LC)分析 15, 16]。根据孔雀石绿的比色测定试剂(毫克) 17)允许量化π发布的酶和是最经常使用的方法。然而,这种分析是一种间接的过程,有一些相关的缺点:一些目标化合物和MG相似的吸收波长;缓冲区中π污染可能导致错误的结果;和使用高底物浓度是不可能实现的。

Bioaffinity色谱法是一种最通用的和有前途的替代常规化验。交互发生在bioaffinity列像发生在许多生物系统的相互作用。高特异性的相互作用提供了高选择性[ 18]。固定化酶在色谱支持有几个优点在自由酶的使用的解决方案。例如,基于固定化酶技术(i)需要小样本容量和减少了样品处理,防止污染;(2)为酶提供了增加寿命和稳定性由于较大的温度控制;(3)允许更广泛的有机溶剂的使用和pH值没有催化活性的重大损失;(iv)使简单的酶和反应产物的分离 19, 20.)和(v)使酶重用可行。

许多酶从寄生虫基本被忽略被验证为目标在抑制的研究中,指出了潜在的药理应用酶。例如,gGAPDH酶 t . cruzi( 21)和人( 22)被固定到一个熔融石英毛细管和作为一个工具来筛选抑制剂;人类的酶进行了研究评价特异性。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP) 曼氏裂体吸虫(血吸虫病) 23)和人( 24)已经固定化,可以作为一个替代通常的耦合分析的选择性筛选配体( 25]。其他作者( 26)固定化寄生虫本身;例如,寄生虫 锥虫属brucei(昏睡病)和 利什曼虫主要(利什曼病)被固定到一个thermoreversible凝胶,他们可以用来评估目标酶的抑制。

这项工作报告一个新的方法来评估NTPDase-1的活性和抑制 t . cruzi。label-free化验的方法包括使用一个固定毛细管酶反应器的基础上 TcNTPDase-1 ( TcNTPDase-1-ICER)耦合到高效液相色谱系统,使酶的研究包括动力学分析和配体的识别。据我们所知,这是第一次 TcNTPDase-1共价固定到毛细管和atp酶活动已经成功地使用由一个在线监控方法 TcNTPDase-1-ICER。

 2。材料和方法 2.1。试剂和化学物质

这种酶 TcNTPDase-1 (EC 3.6.1.5,从 t . cruzi)表达和纯化报道其他地方( 11][描述的修改已经 12]。其基质腺苷5′三磷酸di(三)盐水合物(ATP)、腺苷5′二磷酸钠盐(ADP)、5′腺苷一磷酸二钠盐(AMP),三磷酸鸟苷5′三羟甲基氨基甲烷盐液(三磷酸鸟苷)和鸟苷5′二磷酸三羟甲基氨基甲烷盐液 酿酒酵母(GDP)买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。缓冲组件和使用的所有化学品在表达和纯化,固定,从σ和色谱过程是,默克(达姆施塔特,德国),在穿越(Geel、比利时)。水用在所有的准备工作都从MILLI-Q获得®系统(微孔®,圣保罗,巴西)。熔融石英毛细管(0.375毫米×0.1毫米身份证)收购从Polymicro技术(美国凤凰城,AZ)。所有缓冲的解决方案都是透过0.45 μm尼龙微孔膜过滤和脱气前使用高效液相色谱实验。

冻干样品纯化酶解决方案。简而言之,样本用移液器吸取到一个玻璃小瓶,与液态氮冷冻。然后,他们被放在一个FTS LyoStar冷冻干燥机(石头岭,纽约)。最初的温度设置为−1°C,和示例举行这个温度大约1 h之前冷却到−35°C。干燥室压力下进行70毫托4 h。冻干酶是存储在一个冰箱−20°C。在使用之前,这种酶是重、量化和resuspended固定缓冲区组成50更易与L−1消息灵通的pH值8.0和0.3摩尔·L−1。

 2.2。装置

酶固定化是通过使用一个11 +先进的单注射器泵和双rs - 232从哈佛装置(美国Holliston)。 TcNTPDase-1-ICER是放置在一个日本岛津公司高效液相色谱系统(日本岛津公司,日本京都)组成的两个信用证20广告泵。的一个泵包含一个低压梯度FCV-20ALvalve,紫外可见检测器(SPD-M20AV), autosampler设备(SIL-20A),和一个六端口和三方切换Valco samplevalve (Supelco,圣路易斯,密苏里州,美国)。数据获得在日本岛津公司CBM-20A系统界面的电脑;2.1 Shimadzu-LC解决方案解决方案(LC)软件(日本岛津公司,日本京都)使用。标仪系统(Elisa)读者Versa Max-Molecular设备(美国硅谷,CA)使用。

 2.3。缓冲区

缓冲一个:Tris-HEPES (2-Amino-2 -(羟甲基)propane-1 3-diol-4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸)50更易·L−1包含3更易·L, pH值8.0−1MgCl2(氯化镁),116更易·L−1氯化钠(食盐)和5.4更易·L−1氯化钾(氯化钾)。 缓冲B:Tris-HEPES(250更易·L−1,pH值8.0)包含15更易·L−1MgCl2580更易·L−1氯化钠,27更易·L−1氯化钾。 缓冲C:50更易·L−1KH2阿宝4(磷酸氢钾)包含80更易·L−1NH4Cl(氯化铵)和3更易·L−1《旅(硫酸氢四丁铵),pH值4.7。 缓冲D:50更易·L−1KH2阿宝4,pH值7.4。 缓冲E:玫瑰50更易·L−1包含300更易·L, pH值8.0−1生理盐水。

 2.4。Tc活动的自由<斜体> < /斜体> NTPDase-1

化验进行微型板块在96年好。标仪系统(Elisa读者)被用来测量吸光度。评价蛋白质磷酸酶活动,孔雀石绿的比色测定采用( 27]。

磷酸π(免费)校准曲线是由增加150 μL缓冲和10 μL标准KH2阿宝41.5 mg·毫升−1第一,80年 μL缓冲区在其他富国,紧随其后的是连续稀释。

酶活性是评价通过添加16 μL(缓冲B, 3 μL核苷酸25更易·L−1(ATP、ADP GDP或三磷酸鸟苷),0.5 μ克酶,和足够的水来完成80 μL,紧随其后的是潜伏在37°C 10分钟。

校准曲线和酶反应,80 μ0.2 L盐酸的摩尔·L−1添加(在第二种情况下,停止反应)。接下来,40 μL比色试剂(钼酸铵86更易·L−1/孔雀石绿0.2% 1:3)补充道。混合物在室温下孵化了10分钟在650 nm和阅读。分析一式三份。

 2.5。固定的Tc <斜体> < /斜体> NTPDase-1

resuspending酶解制备的纯化和/或冻干酶固定缓冲区的最后一个0.03 mg·毫升的浓度−1 TcNTPDase-1-ICER准备使用协议,描述了固定化的酶glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) [ 21, 22)和乙酰胆碱酯酶(疼痛) 28]。总之,使用注射泵流量130 μL·敏−1毛细管(100 μm I。D×0.375毫米×30厘米)和2.0毫升的清洗2摩尔·L−1盐酸溶液,紧随其后的是1.0毫升蒸馏水。这个过程去除杂质毛细管和它允许访问的内表面硅醇组( 29日]。之后,毛细干在95°C 1小时。然后1.0毫升3-aminopropyltrietoxysilane (10% v / v)解决方案在水中通过毛细管,随后在烤箱干95°C。毛细管是储存在室温下过夜。

戊二醛溶液1% (v / v) 缓冲D(2.0毫升)是通过aminopropylsilica (APS)毛细管,为了消除戊二醛过剩,从而避免聚合;毛细管是冲洗 缓冲D(0.5毫升)。固定化酶是由通过0.5毫升 TcNTPDase-1·毫升(0.03毫克−1) 缓冲E通过毛细管,三次。不使用时, TcNTPDase-1-ICER一直在4°C的两端毛细管沉浸在缓冲a固定收益率评估使用方法之前所描述的布拉德福德( 30.];这种酶解前后测定固定化的过程。

 2.6。色谱条件

TcNTPDase-1-ICER条件与缓冲流量为0.03毫升·分钟−1和25°C;二维法的第一个维度。然后, TcNTPDase-1-ICER被耦合到Phenomenex Luna C18(100Å250×4.6毫米,5 μ米)的流量分析柱1.0毫升·敏−1与缓冲条件C:甲醇(84:16 v / v) ( 15, 31日]。进行紫外检测 λ通过三方取样阀切换= 254 nm,形成二维系统。酶促反应发生在第一个维度( TcNTPDase-1-ICER),底物和酶产品的分析分离(AMP, ADP和ATP、职责)发生在第二个维度(C18分析柱)。

 2.7。方法的验证

使用适当的解决方案,ADP、AMP校准曲线是由策划对分析物浓度的峰面积。两个样品都准备一式三份,以下浓度:700年,500年,400年,300年,200年,100年,50岁和25岁 μ摩尔·L−1。整除(10 μL)注入空毛细管(30.00厘米)耦合的二维系统。内部和interday方法的精密度和准确度得到通过分析质量控制样品在三个不同浓度:12.5,6.25,3.125 μ摩尔·L−1。5个样品的浓度和分析nonconsecutive三天就做好了准备。验收标准量化的极限是,三个样品的精度应低于20%的变化。检测极限的计算通过信噪比3。指出建立的参数(巴西国家卫生监管机构)分析方法( 32, 33),选择性、线性、重复性精度、准确性、量化(定量限)的限制,检测极限(LOD)进行评估

 2.8。动力学的研究 2.8.1发布。试验在Tc <斜体> < /斜体> NTPDase-1-ICER

的网上活动 Tc使用验证NTPDase-1化验了 TcNTPDase-1-ICER二维方法。ATP浓度的股票的解决方案准备0.5,1,10更易·L−1。进行动力学研究,10 μL不同浓度的底物ATP(从0.025到7更易·L−1)准备从原液和注射一式三份。非线性回归分析与软件版本11.0σ情节是用来确定 K 米 值。

 2.9。抑制作用的研究 2.9.1。分析自由Tc <斜体> < /斜体> NTPDase-1

两种化合物的抑制活性,氯化钆(GdCl3)和苏拉明钠盐,走向自由 TcNTPDase-1评估。在96年进行了分析通过添加16 -好的微型板块 μL(缓冲B, 3 μL (ATP 25更易·L−1,0.5 μ克的酶,1 μL抑制剂样本100 μ摩尔·L−180年,和足够的水完成 μL在每个。盘子被孵化在37°C 10分钟。接下来,80年 μ0.2 L盐酸的摩尔·L−1(停止反应)和40 μL(比色试剂(钼酸铵86更易·L−1孔雀石绿0.2% 1:3)被添加到井,混合物在室温下孵化了10分钟在650 nm和阅读。分析一式三份。抑制计算基于活动的减少。

 2.9.2。试验在Tc <斜体> < /斜体> NTPDase-1-ICER

对目标化合物的抑制活性 TcNTPDase-1-ICER调查。为此,10 μ包含1更易·L L的样本−1ATP和100 μ摩尔·L−1评估化合物被注入发达 Tc在室温下NTPDase-1-ICER系统。的抑制百分比计算通过比较酶活性没有记录在目标化合物的存在。这个公式 % 我 = 1 0 0 - - - - - - ( C 我 / C 0 × 1 0 0 ) ,在那里 C 我 是产物浓度获得分析化合物的存在和吗 C 0 的产物浓度计算没有评估化合物,是就业。此外,对核苷酸的分离分析化合物的效果评估(控制化合物);它确保酶活性可以测量在这些化合物的存在。

 3所示。结果与讨论 3.1。固定

固定化酶表面上组间发生的过程和反应性组织的支持。在这项研究中,我们使用由希夫碱形成共价固定用戊二醛作为定位器;这是一种常见的技术,被应用到不同的支持 34]。这项技术是基于成功的固定化酶在熔融石英毛细管报道我们的研究小组( 21, 28]。熔融石英毛细管NTPDase-1固定选择的支持。之前报道被用来构造条件 TcNTPDase-1-ICER。

石英毛细管活性与醛团体使发生固定化氨基端组(pKa 7.5)和赖氨酸残基(pKa 10.5)。确保固定的 TcNTPDase-1 通过席夫碱之间形成氨基端氨基醛到支持,我们使用pH值8.0 ( 缓冲E)。在这些条件下赖氨酸残基的氨基质子化了的和没有绑定到醛(图 1)。这个过程提供了选择性固定和最小化酶的构象变化的结构( 35]。此外,用于固定的缓冲区( 缓冲E选择)是基于自由酶的研究解决方案;这里我们尝试模仿这些条件保护目标酶的催化性质( 12]。

代表通过希夫碱形成的固定化酶。毛细管支持被激活3-aminopropyltrietoxysilane(摘要)和戊二醛,随后n端氨基醛酶绑定的支持。

原理图的二维系统和开关阀的位置。位置B:列调节;位置:耦合的列。在二维色谱条件优化系统(图 1),Phenomenex Luna C18(100Å250×4.6毫米,5 μ米)和缓冲区分析柱条件C:甲醇(84:16 v / v)的流量1.0毫升⋅分钟−1和紫外检测 λ = 2 5 4 纳米导致ATP的最佳分析分离,ADP、AMP(图 2)。表 1总结所有的优化条件。

色谱条件中使用 TcNTPDase-1-ICER二维方法。

泵 时间(分钟) 阀位 事件
一个 0.0 - -0.3 1 酶促反应 TcNTPDase-1-ICER
B 0.0 - -0.5 1 分析柱条件
一个 0.31 - -8.0 2 分析物转移到分析的列
一个 8.01 - -20.0 1 TcNTPDase-1-ICER调节
B 8.01 - -20.0 1 第二维度分析分析物的分离

泵的流量:0.03毫升⋅分钟−1洗脱液:缓冲a泵B:流量:1.0毫升⋅分钟−1洗脱液:缓冲C:甲醇(84:16;v / v)。

固定收益率是衡量布拉德福德法( 30.];固定化后酶解过程评估和任何大量的残余酶被观察到。这些结果可以表明,固定收益率是100%。毛细管上的成功固定化酶,酶活性保留。

 3.2。< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M9 " > < mml: mi > T < / mml: mi > < mml: mi > c < / mml: mi > < / mml:数学> < / inline-formula > NTPDase-1-ICER二维方法

生物反应器是不能单独的衬底(ATP)产品(ADP、AMP)。因此,使用权力平等主义的核苷酸是由离子对色谱分离洗脱第二维度。离子对色谱法(IPC)可以被看作是反相色谱(RPC)的修改。唯一的区别在IPC条件的流动相的离子对试剂(《),然后与电离核苷酸在一个平衡的过程 36]。流动相组成和流量的基础上进行了优化文学色谱方法分离5′三磷酸及其反相高效液相色谱法在多孔静止阶段(C18) [ 15, 31日]。这种方法应该提供高选择性和分辨率值。离子对色谱分离对pH值的变化敏感,和缓冲从第一个第二个维度,所以优化耦合时间是必要的。因为第二维的流动相没有接触 TcNTPDase-1-ICER,可以使用有机修饰符在权力平等主义的离子对色谱分离安全。

图 3证据三个核苷酸的分离具有良好的分离因素( α 1 - - - - - - 2 = 1 。 10 和 α 2 - - - - - - 3 = 1 。 1 6 )和14分钟,保留时间15.5分钟,AMP(1)和18分钟,ADP(2)和ATP (3)。乐队被注入的标准确定的解决方案在相同的色谱条件下的保留时间和比较。这个条件被用来验证色谱测定方法和筛选抑制剂。

代表色谱分离的ATP (3), ADP (2), AMP(1)由Phenomenex Luna C18(100Å250×4.6毫米,5 μ米)的流量分析柱1.0毫升⋅分钟−1,洗脱液的缓冲C:甲醇(84:16 v / v)和紫外检测 λ= 254海里。色谱条件的二维表中描述的方法 1。

 3.3。验证的色谱测定方法

量化产品,采用相应的色谱带的面积,和校准曲线外推。方法验证和校准曲线构造了ADP、AMP。注入浓度和峰面积之间的关系是线性的: y = 7 7 4 8 x - - - - - - 9 3 3 9 , r 2 = 0 。 9 9 9 2 1 ADP和 y = 7 7 5 1 x - - - - - - 6 3 0 8 4 , r 2 = 0 。 9 9 9 7 9 AMP。支持信息S1和S2 (SI)的数据(在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2016/9846731)包含关于这个问题的更多细节。盘中精度被表示为变异系数(CV %);CV值小于或等于15%的人接受。精度确定的比率百分比平均值之间提供的验证方法和添加浓度的参考价值。准确性,偏差小于或等于15%的人接受。变异系数(CV)提供内部和interday可变性的简历从12.1%至0.22不等精度值从97.3到106.5% ADP和从0.21到3.02%精度值从98.7到107.4% AMP,量化的极限是12.5 μ摩尔·L−1准确率达到了83.5% (RSD = 1.99%)和25 μ摩尔·L−1准确率达到了106.8% (RSD = 2.02%) ADP、AMP。方法的检测极限计算10 μ摩尔·L−1和15 μ摩尔·L−1分别对ADP、AMP信号/噪声比等于3。支持信息(SI)表S1和S2包含额外的细节。方法的选择性是由空白样品之前和之后的每一个序列的分析。评估的值参数满足的需求分析方法。

 3.4。的催化活性和稳定性测定Tc <斜体> < /斜体> NTPDase-1-ICER

监测酶活性,增加产品的乐队ADP、AMP衬底ATP在哪里使用(或国内生产总值和GMP三磷酸鸟苷作为衬底)比较的方法进行验证 TcNTPDase-1-ICER。获得的色谱和色谱乐队乐队比较空毛细管色谱系统耦合时,10 μL的ATP 1更易·L−1注入。见图 4,乐队保留时间为15.5分钟(ADP)相应增加,这证实了固定化酶的活动。

(-)代表色谱分离的ATP(2)和ADP卢娜C18分析柱(1)。(- - -)代表色谱固定化酶的活动 TcNTPDase-1-ICER。在线的水解ATP (10 μ1.0 L更易⋅L−1ADP)。分离得到一个月亮C18分析柱耦合 TcNTPDase-1-ICER max = 254海里。实验条件如表所示 1。

需要考虑的一个非常有趣的一点是酶的稳定 TcNTPDase-1-ICER。酶保留86%的初始活动长达32天,但它降低了。尽管32天不是很长一段时间,这是足以执行各种研究和评估抑制的动力学机制。这个系统的好处是可能重用的酶,它代表储蓄与消费的新酶解决方案。固定化酶还允许分析再现性,因为它使用同一批次的酶重复。存储使用冻干方法进行酶的固定化后还在解决方案和评估。酶活性没有变化。图中描述的活动 3都记录了 TcNTPDase-1-ICER由冻干 TcNTPDase-1和 TcNTPDase-1 resuspended在固定缓冲区。的最大储存稳定性冻干酶是180天。

尽管ATP和ADP NTPDases被描述为底物,这些酶可以水解不同核苷酸以及UTP或三磷酸鸟苷( 12]。固定化过程会影响催化网站或它可能导致目标酶的构象变化的结构。这里的活动不同的核苷酸酶是评估:ATP、ADP、三磷酸鸟苷,国内生产总值( 12]。结果表明,固定化后酶的特异性改变,相同的特异性的解决方案:GDP >三磷酸鸟苷> ADP > ATP。化验都是通过评估每个核苷酸的酶活性分别进行产品色谱峰面积的增加体现了在图 3。ATP是下面描述的其他测试的核苷酸选择因为它显示良好的活性和分离和远比其他人更便宜。

 3.5。< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M16 " > < mml: mrow > < mml: msub > < mml: mrow > < mml: mi > K < / mml: mi > < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml: mi > M < / mml: mi > < / mml: mrow > < / mml: msub > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula >决心为Tc <斜体> < /斜体> NTPDase-1

动力学参数 K 米 允许测定酶和底物之间的亲和力。 K 米 对应的浓度底物的反应速率等于最大催化速度的一半。之间的亲和力 TcNTPDase-1-ICER和衬底ATP测定并与文献结果的酶在溶液中( 12]。

在这个实验中,增加ATP浓度(0.025 - 7更易·L−1)使用。的 K 米 值 0 。 3 1 7 ± 0 。 0 4 4 更易·L−1。图 5代表了Michaelis-Menten夸张。

Michaelis-Menten夸张( K 米 ) TcNTPDase-1-ICER。

在低浓度的底物,反应速率是直接与底物的浓度成正比。进步提高底物的浓度产生较小的反应速率增加。因此,夸张形象同意Michaelis-Menten方程。的 K 米 固定化酶价值发现是3.3倍 K 米 价值报告酶在溶液中0.317和0.096 K 米 分别为( 12]。这是预期的,因为几个因素可以影响固定化酶;例如,酶分子的构象变化由于活性部位的三级结构的改变;立体效果,可以使酶的活性部位无法访问;或扩散传质效果源自抗基质的扩散和反应产物与酶的催化部位,分别为( 31日]。值得注意的是,在溶液中酶是在静态条件下,而在该方法下一个流系统。然而,维持酶活性和选择性 TcNTPDase-1-ICER,这应该使该方法筛选抑制剂的使用。

 3.6。抑制作用的研究

抑制进行了研究 TcNTPDase-1-ICER评估应用固定化酶的抑制剂的筛选。获得的结果为 TcNTPDase-1-ICER与抑制试验的结果进行了比较 TcNTPDase-1在解决方案。两个已知NTPDase化合物已测试;苏拉明和氯化钆测试。苏拉明曾被证实能抑制重组 TcNTPDase-1。钆可以抑制体内ectonucleotidase活动 t . cruzi,但不能抑制重组 TcNTPDase-1 [ 11]。

1的ATP浓度更易·L−1(±3.15倍 K 米 值)用于这项工作确保饱和度和初始速度条件( v 0 )的固定化酶。已知浓度的苏拉明的存在降低了乐队的水解底物区域。更具体地说,Sumarin显示,51%的抑制。我们的数据同意从抑制测试结果进行酶解- 69%苏拉明的存在。同时,氯化钆没有抑制酶,如预期。图 6说明了降低产品的吸收带ADP(15.5分钟)在100年的存在 μ摩尔·L−1苏拉明。

色谱减少活动的代表 TcNTPDase-1-ICER 100年的存在 μ摩尔⋅L−1苏拉明(-)。代表色谱在缺乏苏拉明(——)。色谱条件如表所示 1。

 4所示。结论

表达和纯化方法是有效的和生产的纯化酶的活动在一个优化重折叠缓冲区;在溶液中稳定持续了90天。此外,整除的纯化酶之前提交给低压冻干法保留了酶活性后,直接再悬浮在固定缓冲区以及固定到熔融石英毛细管。 TcNTPDase-1是成功的,这种酶的活性和稳定性被二维评估 TcNTPDase-1-ICER方法。约32天的冷藏工人稳定,足以调查几个样品可能的抑制剂。它被证明是一种有效的工具来评估酶活性和动力学参数,允许未来重要的研究涉及ligand-protein交互。该方法自动化;分析需要少量的样本。此外,该设备是已知的敏感 TcNTPDase-1抑制剂苏拉明。基于测试与候选人进行酶的抑制剂,该方法是一种很有前途的工具使用的选择性抑制剂的研究 TcNTPDase-1和代表另外一个策略来执行动态酶特性的研究。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

这项工作是由圣保罗州的资助研究基金会(FAPESP-2013/01710-1 2008/04371-5)和国家技术和科学发展委员会(CNPq)。卡门·卢西亚卡多佐和费利佩·安图内斯Calil承认协调发展的更高层次(披肩)CNPq,研究和MSc和奖学金。

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