文摘

目标。抑制基因βGSK-3连环蛋白和诱导基因β和APC,促进肿瘤细胞凋亡在Wnt通路,通过讨论了绿原酸(注册会计师)。方法。不同的基因是由4 * 44 k鼠标扫描微阵列芯片。三个基因的效果证实了rt - pcr技术与注册会计师剂量的5,10,20毫克/公斤。结果。GSK-3的表达β和APC是调节群20毫克/公斤剂量(),的表达β连环蛋白表达下调是在相同的剂量()。结论。结果推断multimeric蛋白质复杂的β连环蛋白可以增加注册会计师GSK-3调节基因β和APC,抑制自由β连环蛋白在细胞核和TCF连接。所以目标基因的转录表达会减少细胞增殖异常。它可能是一个可以阻止肿瘤的方式增加注册会计师。

1。介绍

绿原酸是咖啡酸的酯和奎尼酸shikimate通路,通常存在于一些植物,如金银花、杜仲、精液Coffea阿拉比卡,和绿茶。绿原酸具有抗菌、抗病毒、清除自由基和抗肿瘤效果(1]。近年来,绿原酸的有效抗癌活性和低毒性被不断证实和吸引人的注意2- - - - - -4]。Kurata et al。5]表明,抑制肿瘤细胞增殖增加剂量增强了绿原酸的影响;他们推测肿瘤细胞增殖的抑制作用可能是通过增强DNA梯和caspase-3的活动以及增加c-Jun的表达式。Gmnado和冯等人表明,体外实验表明,注册会计师的抗癌机制包含抑制细胞生长,调节细胞周期,诱导细胞凋亡通路,如(1)减少ROS表达减少细胞生长/复制信号转导通路的NF -κB、AP-l MAPKs减少癌细胞生存能力,(2)改善的活动NAD (P) H和销售税,(3)抑制十四酰的表达方法波醇乙酸酯(TPA),为了减少c-Jun NH2-terminal激酶,p38激酶,和MAPK kinase-4预防癌症转换,和(4)刺激NF-E2-related因子的表达和销售税的活动受Nrf2下游抗氧化反应级联链接元素(是)来抑制癌细胞的生长(6,7]。绿原酸是一种有效的癌症化学剂,因为其重要的抑制性影响结直肠癌,肝癌,喉8]。摘要生物基因芯片技术用于检测一系列基因序列的变异小鼠乳腺肿瘤细胞与注册会计师动态治疗周期。差异基因筛选利用基因组学分析,也是潜在的目标基因与肿瘤相关疾病根据基因的质量特征。进一步验证测试必须设计,如准确定量PCR技术和免疫印迹技术,来验证潜在目标点的绿原酸在治疗肿瘤。

2。工具和材料

2.1。肿瘤行和动物

EMT-6小鼠乳腺肿瘤行被移植工程重点实验室保存,免疫学、卫生部、四川大学华西医院。雌性BALB / C小鼠,重17 ~ 18 g,和最初从四川大学实验动物中心购买,在普通的小动物饲养房相同的中心,喂养条件符合GB 14925 - 2001 19±3°C的环境温度和湿度55±15%。

2.2。仪器和评议

有限公司₂孵化器(MCO-15AC、三洋、摩根大通(JP)、生物安全柜(美国NUAIREν- 425),电子天平(JY12001、缝匠肌、美国),高速离心机(TGL-16G、上海、中国),PCR(美国ABI ABI - 9700),杂交炉(美国安捷伦G2545A)扫描仪(美国安捷伦G2565BA)分光光度计(ND1000, NanoDrop高压釜)、定量PCR仪(美国Bio-Rad) IQ2-cryogenic高速离心机,标准的96孔板,洁净工作台,苏净集团安泰,ChemiDoc XRS +系统介质(Gibco,中国),小牛血清(Minhai,兰州,中国),0.25%胰蛋白酶(美国Gibco)、抗生素(青霉素和链霉素硫酸盐)两倍(华北)Cy3 NHS酯(很多没有。PA13105),通用电气医疗集团,aaUTP Ambion (AM8436) RNA输入线性放大工具包(很多不低。5184 - 3523),基因表达杂交工具包(很多没有。5188 - 5242),5188 - 5327基因表达清洗缓冲工具包(包括洗缓冲区1和2),稳定和干燥(很多没有解决方案。5185 - 5979),垫片(很多没有。g2534 - 60003 a), 4 * 44 k鼠标微阵列杂交CGAmber(很多没有。G2534A)、安捷伦美国RNeasy迷你工具包(很多没有。74106年),美国试剂盒。试剂盒试剂,表达载体。DEPC、益生元、5 x反应缓冲区,Riblock核糖核酸酶抑制剂,核苷酸,RevertAid M-MulV, 2 * Taq混合novoprotein大师,IQTM SYBR绿色Supermix生物Rad。RevertAid第一链cDNA合成装备,Fermentas,荧光成像仪DNA阶梯,novoprotein,绿原酸注入(CGA,很多没有。 061101, 30 mg), white powder for injection (content of 99.87%), offered by Sichuan Jiuzhang Biological Chemical Technology Development Co. Ltd. Docetaxel for injection (DX, lot no. 10112611, 20 mg), purchased from Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd. IFNα2 b (20110908, 500 IU)购买安徽安科生物(集团)有限公司0.9%生理盐水(NS,很多没有。A060418) (Kelun,四川,中国)。

2.3。样品溶液的制备

使用注册会计师的解决方案,用无菌盐水冷冻干燥粉末溶解于使注册会计师样品溶液的浓度是1,0.5和0.25 mg·毫升⁻¹,分别。

使用DX解决方案,20毫克的DX喷粉与1.5毫升的特殊溶剂稀释。,约8.0毫升的生理盐水被添加原液2 mg·毫升⁻¹。股票的解决方案被稀释样品溶液浓度为0.25 mg·毫升⁻¹在使用前用生理盐水。

使用干扰素α2 b方案,干扰素α2 b与20毫升无菌生理盐水稀释。

3所示。方法

3.1。Balb / c-EMT-6小鼠模型的制备

3.1.1。准备和Subcultivation

的复苏的EMT-6乳腺肿瘤行植入皮下注射入小鼠右前肢。直到获得的肿瘤小鼠肿瘤增长到1厘米××1厘米1厘米。然后取出肿瘤,清洗NS,重,把它切成小块,把它放置在一个均质器。NS(约1:4)添加到均质器,高速匀浆后,得到细胞悬液。0.2毫升的细胞悬液接种皮下注射进小鼠右前肢和是随机的。

3.1.2。实验设计

30名女BABL / C小鼠随机分为6组(),包括生理盐水(负面)集团,注册会计师高剂量组(20毫克公斤⁻¹),注册会计师中组(10 mg·公斤⁻¹排气口),低剂量组(5毫克公斤⁻¹),DX阳性对照组(5毫克公斤⁻¹)和干扰素α2 b阳性对照组(500万U·公斤⁻¹)。

接种后24小时,NS组,注册会计师团体和干扰素α2 b阳性对照组连续皮下注射12天。DX组管理interday 6次。肿瘤被上届政府24小时后,然后重,切成块,在液态氮冷冻,储存在分割包后−70°C。

3.2。检测细胞水平变化的基因与基因芯片

3.2.1之上。总RNA提取

裂解/绑定缓冲了,1毫升/ 0.1 g组织匀浆在冰上防止RNA降解。在匀浆中添加匀浆添加剂(1/10);匀浆漩涡,混合,在冰上10分钟。然后添加苯酚和氯仿混合在同一卷消散,涡30年代,离心机在10000 g在室温下5分钟。绝对乙醇添加到上层清液,然后涡和混合,使他们经历反复净化列,离心机在15秒10000克、放弃了上层清液。增加了350μL我洗,离心机5 s净化列,然后离心机在10000克15年代,丢弃的滤液。增加了10μL DNase我和70年μL缓冲随机数字拨号改为电影,放在了15分钟,然后先后增加了350μL洗1和500μL洗2,离心机5 s,清洗净化列两次。每个清洗必须在10000 g离心15年代和丢弃的滤液。增加了100μL 95°C预热nuclease-free水旋转列,并将自旋列在一个新的集合管第二次清洗。总RNA将使离心后获得最大速度为30年代,然后储存在−70°C。

3.2.2。总RNA的净化

试剂盒RNeasy工具包用于进一步的总RNA的提取及纯化方法。100年μL RNase-free水被添加到溶解的总RNA,然后用350混合μL缓冲RLT和250年μL乙醇。(RLT的准备:14毫升原始RLT可以添加到140年μL (β巯基乙醇)。样品转移到RNeasy列,离心机在10000 g 30 s,废弃的滤液。清洁RNeasy minicolumn与500年的两倍μL缓冲RPE离心机在30年代和2分钟10000克、分别和滤液丢弃。添加40μL核糖核酸酶游离水的列,离心机10000 g 1分钟。重复操作一次;纯化RNA。

3.2.3。总RNA质量检测

质量的总RNA和琼脂糖凝胶电泳可以确定。准备电泳缓冲50 x TAE, DECP和高压釜处理→1%琼脂糖凝胶制备添加后的琼脂糖lx TAE在凝胶电泳缓冲→运行15分钟,然后观察凝胶的凝胶成像仪台→芯片实验室。

3.3。验证特定基因的蛋白表达荧光定量PCR

3.3.1。引物和反应条件

通过01190年软件和引物设计合成了Sangon生物科技(上海)。这四个基因的引物信息见表1。模板的示例cDNA、差异表达基因验证利用实时荧光定量PCR SYBR绿色。q-PCR反应的条件受到94°C 10分钟,其次是40周期在94°C 15和54.5°C 30年代,最后72°C 45 s。GSK-3的表达水平β、APC和β连环蛋白在测试样本检测与GAPDH基因和计算的参考相对定量方法,显示了不同群体的微分表达式与NS组。

3.3.2。RNA提取

isinfecting试剂瓶后,盒子,和手套在紫外线下30分钟,组织均质试剂盒中的试剂。匀浆孵化在15 - 30°C 5分钟,氯仿添加,然后涡为15秒,离心分离的混合物低温15分钟。上层浮在表面的转移到另一个管,添加0.5毫升异丙醇混合在15 - 30°C,孵化10分钟,4°C,然后在12000 g离心10分钟,丢弃的上层清液,并添加1毫升75%乙醇进入管,在7500 g离心5分钟,放弃了上层清液,干空气中3−5分钟。增加了20μL DEPC去离子水溶解RNA并存储在−70°C。

3.3.3。RNA质量检测

(1)OD值检测。A260 / A280值由紫外线与1μL提取RNA稀释至100年μL TE缓冲。

(2)RNA甲醛电泳。电泳条件的电压是80 V,运行时间40分钟。部分的RNA样品准备3.3.2用DEPC水稀释适当,与同等体积的混合样本缓冲区,然后在沸水中加热4分钟,在冰上冷却2分钟,然后在1200转离心5 s。样品被发现在板进行了电泳。

3.3.4。互补脱氧核糖核酸的合成

RevertAid第一链cDNA用于逆转录合成工具包。rt - pcr反应的反应总量是20μl系统包括2μL RNA, 1μL益生元(dT) 18个引物,9μL RNase-free水,4μL 5 x反应缓冲区,1μL Riblock核糖核酸酶抑制剂,2μL 10毫米混合核苷酸,1μL RevertAid M-MulV。

反转录系统上面的液体受到42°C, 60分钟,70°C, 5分钟,PCR仪器。反应产品储存在−80°C为长期保存。

3.3.5。rt - pcr扩增的测试产品

简而言之,唯一带的存在与否是观察到496个基点作为标准显示的互补的质量。如果有一个且只有一个乐队,PCR产物cDNA合格,Q-PCR可以成为下一个。的电压是130 v,分析时间是25分钟。

rt - pcr扩增系统25μL液体反应总量,由10μL 2 x Taq大师混合,2μL cDNA、0.75μL向前GAPDH底漆和0.75μL反向GAPDH底漆,和11.5μL RNase-free水。PCR反应受到94°C 10分钟,其次是40周期在94°C 15和54.5°C 30年代最后72°C 45 s。

3.3.6。实时荧光定量聚合酶链反应

1μL cDNA是稀释至100年μL与无菌水备用。基因引物,F和R,分别稀释20倍。这个反应体系表所示2。每个样本都应该经历的三个平行试验,以平均值计算。

3.3.7。设计和优化SYBR绿色我反应

(1)优化的退火温度。通过设置一定的温度范围内,我们可以屏幕实时定量PCR反应的最佳退火温度。融化曲线可以用来评估定量PCR的特异性反应的仪器。融化曲线如果有多个峰值,这表明非特异性引物二聚体等产品,它们放大以及特定的产品同时,也表明需要重新设计引物的反应。

(2)建设的标准曲线。互补脱氧核糖核酸被选为模板,设置每个稀释的八大系列10倍稀释点重复了三次。线性回归直线的方程获得了对数的值模板初始浓度为横坐标和CT值为纵坐标。标准曲线相关系数()或确定系数()可用于评估程度的线性化的具体要求和。

4所示。结果

4.1。注册会计师的结果抑制乳腺癌的老鼠(EMT-6)

见表3。

4.2。电泳图和实验室芯片

作为显示在图1,28日和18年代的亮度比例大于或等于2的电泳图,初步确定总RNA是合格的。结果表明,RNA的质量从每组肿瘤组织样本中提取满足进一步检测基因芯片的要求。那么差密切相关的基因治疗过程中肿瘤细胞抑制筛选的时间序列分析,去分析和路径分析与q-PCR和验证。

4.3。RNA的质量结果,互补

(1)OD值的结果。如表所示4,RNA的A260 / A280值从1.63到2.18,满足质量要求的RNA。

(2)甲醛的RNA电泳。作为显示在图4甲醛变性电泳显示28日和18年代很清楚没有杂质能带DNA和RNA降解,符合实验的要求。

(3)互补脱氧核糖核酸质量检验的结果。作为显示在图5,只有一个乐队在496个基点,这表明PCR产品的质量符合要求。

4.4。PCR GSK-3的表达β、APC和β连环蛋白

PCR GSK-3的表情β、APC和β连环蛋白是如图6Balc-b / EMT-6肿瘤组织的肿瘤治疗后小鼠DX(5毫克/公斤),干扰素(5×10⁶U·公斤),注册会计师(20毫克/公斤),注册会计师(10毫克/公斤),注册会计师为12天(5毫克/公斤)。与空白组相比,GSK-3的表达β和APC是调节群20毫克/公斤剂量(),的表达β连环蛋白表达下调在相同剂量组()。

5。讨论

(1)如表所示3相比,阳性对照组的细胞毒性抗癌药物DX,生物反应修饰符(BRM)干扰素组和负群NS,排气口的三个dosag组表现出更好的抗肿瘤效应();特别是20毫克的抑制率·公斤⁻¹剂量组50%以上,相当于59.92%的DX组和40.80%的干扰素组。建议绿原酸应该能够成为一个新的良好的抗癌剂未来的临床应用。

(2)根据不同时间点的数据抑制过程中获得的数据合格的总RNA1,2,3微分Wnt通路密切相关的基因治疗过程中时间序列筛选的,途径。与注册会计师的不同的基因治疗与q-PCR提取并被确认。肿瘤基因组的下降趋势18和21所筛选的对数标准化和与类似的趋势拟合基因的改变;遗传趋势的拟合值接近小,如数字7(一)和7 (b)。

(3)如图7(一)基因组的趋势18是注册会计师的抗癌过程确认。根据KEGG信号通路的分析和18进入基因组的特点,一些表达下调的基因被发现与肿瘤抑制通路,如脑源性神经营养因子介导MAPK、Cflar, Cln3 Ddit3 Notch2 Rps6, Sox9、Spn, Ppp1r13l。基因21时间序列图与Wnt通路,mTOR通路,Notch通路,和一些相关的几种途径,如B细胞受体通路,t细胞受体途径和代谢途径。推断,注册会计师有multipathway抑制肿瘤生长。

(4)因为我们的动物模型是一个乳腺癌(EMT-6 / BALB-C),我们关注Wnt通路的影响(如图8)这是一个特殊的途径,乳腺癌。特别是,糖原合成酶激酶3 (GSK-3基因β)和下游基因泛素连接酶E3 (APC)调节。和基因的两种封闭的关系,在基因APC GSK-3被上游调节基因β。然后,加两个基因可能导致基因β在Wnt通路直接连环蛋白表达下调。如你所知,癌症基因时将开发β连环蛋白表达的调节。什么是基因β连环蛋白吗?从其搜索发现,β连环蛋白是一种多功能蛋白,可以帮助细胞对细胞外信号变化与细胞骨架的交互。这种蛋白质作为核转录(转录)因素促进细胞分裂的基因。的积累β连环蛋白会导致异常的激活下游转录因子核转移后,主要引起肿瘤。所以,建议β连环蛋白抑制的方法来抑制肿瘤的生长。另一方面,GSK-3 upregulationβ是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,扮演着一个重要的角色在Wnt /无翼,pi3激酶,和刺猬信号通路与生理功能包括转录激活、细胞增殖,细胞分化,细胞运动。它可以使磷酸化蛋白质和轴β连环蛋白,引起的降解β连环蛋白的蛋白质,从而抑制通路的激活。活化的APC中扮演一个重要的角色在促进复合物降解迅速,高效,后期细胞周期和高度选择性的方法,也可以使磷酸化蛋白质和轴β连环蛋白,引起的降解β连环蛋白的蛋白质,从而抑制通路的激活。所以GSK-3的激活β和APC的差别,对这些基因β连环蛋白组的海巡署指出,注册会计师可以通过激活GSK-3抑制肿瘤β和APC。

(5)如图6(一)治疗过程中,规定经Q-PCR EMT-6乳腺癌显示组织的注册会计师注册会计师在每个剂量和DX可以激活GSK-3的表情β,特别是注册会计师20毫克/公斤组和DX组可以显著上调GSK-3β()。如图6 (b)组CGA在20毫克/公斤,10毫克/公斤,DX可以激活的APC的表达,但注册会计师在5毫克/公斤剂量组upregulation。如图6 (c)DX群,干扰素组和CGA 20毫克/公斤组抑制基因β连环蛋白。

6。结论

建议GSK-3基因表达的影响β、APC和β连环蛋白由绿原酸在Wnt通路的目标multipathway抗肿瘤的注册会计师。

利益冲突

作者都是四川大学的研究人员和没有利益冲突。试验的某些部分委托给第三方但不是由这个聚会。这句话是充分披露的利益,而不是因为作者认为这是一个利益冲突。

确认

四川省科技支撑项目资金2011 sz0131支持这项工作。作者想说明伟大的感谢刘宏伟,他的伟大的帮助。