快速果胶甲基酯酶方法的决心

文摘

果胶是一种天然多糖用于食品和医药行业。果胶甲基化程度是一个重要的参数对果胶的应用产生重大影响。快速、完全自动化、动力流方法测定果胶甲基酯。该方法是基于实验室分析仪的使用反向流动注射/停止流动的原则。甲醇是释放果胶,果胶methylesterase第一混合线圈。酶工作解决方案是下游注入混合果胶/果胶methylesterase流在第二混合线圈。甲醇是由酒精氧化酶氧化释放甲醛和过氧化氢。这个反应是耦合的辣根过氧化物酶催化反应,使彩色产品4 n -安替比林(p-benzoquinoneimine)。反应速率正比于甲醇浓度和它后面是使用海洋光学USB 2000 +分光光度计。分析器是完全由实验室虚拟仪器程序编写的。 The detection limit was 1.47 mM with an analysis rate of 7 samples h⁻¹。一个配对以及用手工方法的结果表明,该自动方法结果相当于手动方法在95%置信区间。发达的方法是快速和可持续的和它是第一个流分析的果胶的应用分析。

1。介绍

果胶,天然多糖存在于高等植物的细胞壁,是一种重要的化合物对食品和制药行业。化合物的重要性关系到其独特的属性和它是可生物降解的。商业提取果胶的主要原料是农业副产品,也就是说,柑橘皮和苹果果渣。果胶在食品中的应用主要依赖其胶凝和稳定性能。果胶通常用于生产食品像果酱,果冻,果酱作为胶凝剂和酸乳饮料中,饮料,或糖果作为稳定剂(1]。果胶应用的多样性及其有益健康的影响(2- - - - - -4这种化合物的原因)是近年来引起了广泛的注意。

果胶的凝胶特性是其结构的结果。果胶主要组成的-(1 - 4)与D-galacturonic酸分子,其中一些与甲醇酯化。果胶甲基化程度的比例(DM)被定义为甲基酯化羧基组。DM 50%之间的界线是low-methoxyl (LM)和high-methoxyl (HM)果胶。DM的影响条件,应申请果胶凝胶。High-methoxyl果胶凝胶的存在足够的糖和酸。Low-methoxyl果胶要求二价阳离子形成凝胶结构。LM果胶凝胶没有糖的能力使其特别适用于饮食,即低糖食品(1]。甲基化的程度与设置的果胶(5]。根据设定时间,可以选择最合适的果胶应用程序。例如,快速设置果胶非常适合堵塞和果酱,当沉降或漂浮的水果块必须避免。相比之下,缓慢设置果胶生产特别有用的果冻,当额外需要消除气泡在胶凝时间(1]。

果胶被用于制药行业在药物输送系统(6]。他们的应用程序极大地依赖于甲基化的程度;例如,LM果胶用于鼻制剂由于其形成凝胶的能力在钙离子的存在7]。糖尿病也会影响药物释放时间从pectin-based矩阵平板电脑使用钙配方时(8]。果胶的应用很大程度上取决于它的甲基化程度。这就是为什么快速和可靠的方法快速量化果胶甲基酯的主要兴趣和重要性。

果胶甲基酯可以通过碱性水解或酶水解果胶methylesterase。发布的甲醇可以量化的GC [9,10)和高效液相色谱法(11)或用酒精氧化酶(12]。当使用酒精氧化酶,甲醇甲醛(相关内容可以13)或过氧化氢浓度(14]。这里提供一个新的自动流injection-stopped流测定果胶甲基酯的方法。这种方法的一个独特的方面是试剂注入样品流流动。这种方法,称为反向流动注射(rFI),还有各种优势,试剂消耗最低化是最常见的原因选择rFI模式。rFI时感兴趣的昂贵的试剂,如酶,以及丰富的样例时,例如,当水被分析此外,rFI提供更加敏感。样品不是注射,因此没有明显的分散的样本,提高测量的灵敏度。rFI的局限性有关样品处理量,因为它可能需要停止系统为了改变样本甚至采用测量之间的清洗解决方案。然而自1978年引入rFI,出版物的数量使用这种方法是不断增加15]。

流方法是分析化学的一个的分支和他们的应用程序在质量保证的食品化合物(16)或制药(17)提供一个快速和可持续的替代手工方法。流动注射系统是自动化,提供快速程序的精度提高了人工干预和错误最小化。所有样品的测试环境是相同的,进一步提高精度。通过流方法可持续性纳入分析工作。这里介绍的方法是快速和可持续的方式为分析关键参数的果胶低试剂和样品消耗以及最小的废物产生。酶的使用最小数量的化学物质用于分析工作。酶是一种自然、可生物降解和环境友好替代化学物质。该方法是基于一个容易构造流形,可从现成的商业部件组装而成。

流动注射系统甲醇决心已报告在文献[18- - - - - -23]。然而,使用果胶的流动注射分析仍然是未知的。流动注射方法对果胶的应用分析提供了小说,绿色技术,符合当前可持续发展的趋势。

2。材料和方法

2.1。试剂

工作方案(EWS)的酶用于流和比较方法:1.2 U mL⁻¹酒精氧化酶(AOX) (EC 1.1.3.13), 46 U mL⁻¹辣根过氧化物酶(合)(EC 1.11.1.7)、酚7.5毫米和2.5毫米4-aminoantipyrine 0.1磷酸盐缓冲剂。酶从西格玛奥德里奇被购买。其他试剂均为分析纯。EWS动力学研究中使用包含1 U mL⁻¹AOX 40 U mL⁻¹合。一个商业重组的准备米曲霉果胶methylesterase(中外)(EC 3.1.1.11) (Novoshape,诺维信、Bagsvaerd、丹麦)从汉斯Sejr奥尔森博士是一个慷慨的礼物。这个准备使用前过滤。

2.2。标准和样品

股票的解决方案为0.25 g 100毫升⁻¹果胶相当于7.2毫米甲醇浓度是准备在去离子水中使用HM柑橘果胶的酯化度69.5%。稀释0.02,0.05,0.09,0.12,0.14,0.18,0.22和0.25 g 100毫升⁻¹对应0.49,1.4,2.6,3.4,4.0,5.2,6.3,和7.2毫米甲醇从股票准备解决方案。甲醇浓度的计算是基于酯化度和半乳糖醛酸含量测量。甲醇标准的0.25,0.49,0.74,0.99,1.24,1.48,和1.73毫米比较法是准备在去离子水和存储−20°C。标准是解冻之前测量。甲醇标准用于动力学研究准备0.1磷酸盐缓冲剂,pH值7.5。

果胶是捐赠的研究员ApS(里尔Skensved、丹麦)和博士凯伦·玛丽Søndergaard杜邦NHIB丹麦ap。

2.3。动力学研究

动力学研究EWS的温度和pH值的影响。不同的AOX活动的影响范围从0.5 U mL⁻¹2.5 U mL⁻¹是检查。EWS的稳定性在冰箱里3个月存储进行了研究。0.5毫升的甲醇标准的石英试管放在Jasco v - 550分光光度计和2.5毫升EWS补充道。过程度量程序开始时立即监测反应速率在505 nm 2 - 3分钟。试剂空白必要时从分析信号中减去。

2.4。比较法

进行了比较法、果胶皂化和中和如Klavons和班尼特(1986)所述12]。吸光度测量完全EWS加法后10分钟。EWS试剂和样品空白测定和减去。

2.5。流动注射分析仪

流动注射分析仪是描绘在图1。果胶混合的混合与果胶methylesterase线圈。第一个混合线圈固定在100厘米,这是甲醇创造足够的长度。甲醇释放由于行动的酶甲基酯化果胶组(1): 下游EWS注入。甲醇氧化的AOX释放甲醛和过氧化氢(2)。这个反应是合耦合催化反应,使彩色产品4 n - (p-benzoquinoneimine)安替比林(3)。反应速率正比于甲醇浓度和它后面是使用海洋光学USB 2000 +分光光度计。

分析器是由实验室写程序开发的虚拟仪器提供了从探测器和数据采集控制泵和喷射阀。该项目还控制分析仪的时机,呈现在图1原始数据,显示在屏幕上,并存储在硬盘上。专用的功能已经开发控制的加载和注入位置Vici Valco喷射阀,停止和运行位置的Gilson Minipuls 3蠕动泵。程序运行在个人电脑将pci - 1760 u Advantech蠕动泵和喷射阀控制使用的卡。分光光度计的数据采集模块是通过虚拟仪器通过USB接口控制模块开发。

一分钟是允许的(1)进行;然后EWS注入。允许9秒的反应混合物的流动单元。然后泵停止五分钟允许监控(3)。如果需要,操作员选择冲洗系统之间的连续测量。聚四氟乙烯管材使用0.8毫米身份证。

2.6。数据处理

虚拟仪器程序获得整个谱:189 - 1037 nm,每一秒。这将创建一个依赖时间的数据矩阵。独立实验室写程序被用于提取数据在505海里。使用Visual Basic程序建立,并获得输入从文件创建的虚拟仪器程序。

反应速率的计算是通过回归分析使用数据为每一个测量的重要组成部分。

3所示。结果与讨论

之前反应的动力学研究发展的多方面的。确保测量的反应速率正比于甲醇浓度、甲醇氧化反应(2)必须限制速度的步骤。另一方面,合催化反应(3)应该非常快。AOX浓度对反应的影响曲线研究了甲醇的浓度按预期的嗯~ 0.25 g 100毫升⁻¹果胶样品。当AOX活动高于1.5 U mL⁻¹内,甲醇消耗监测时间和线性丢失在年底前测量。相比之下,低AOX的活动,比如0.5 U mL⁻¹,导致反应速率较低,如图2。1 U mL的活动⁻¹被选为高之间的权衡分析信号和线性。

该方法的鲁棒性强烈依赖于pH值和温度影响酶活性。图3显示的效果EWS温度在20 - 30°C。反应速率增加。这证明室温适合自动化的方法。研究最优的pH值以来EWS是特别重要的酶在EWS有不同的最佳pH值:AOX: 7.5 (24),合:6 - 6.525]。图4表明酶工作解决方案的pH值变化在6.5 - -7.5范围内没有任何对反应速率的影响。总而言之,在反应温度和pH值的影响是次要的,证实了该方法的鲁棒性。长期稳定性的一项研究显示,19.5%和30%的损失EWS活动48和99天之后,分别。

3.1。流方法优化

单变量优化执行以下参数:(i)中外商业准备稀释,(ii)总流率,(3)注入体积,(iv)预培养时间、甲醇生产(允许的时间1),(v)时间允许的反应混合物流动细胞是第二运行时间图1。以下为单变量优化参数选择范围:总从1到4毫升最小流量⁻¹从70年到250年,注入体积μL,预培养时间从2到60年代,第二次运行时从3 - 11年代。选择的范围是基于射流系统的局限性。

中外职业准备的稀释效应被稀释过滤Novoshape测试解决方案在去离子水1:100。高中外职业活动增加达到样品的空白信号。这可能是由于甘油中包含Novoshape作为稳定剂。AOX不是特定对甲醇和虽然对甲醇具有较高的亲和力,它也可能氧化甘油。这是进一步观察的信号支持的空白是沿着Novoshape浓度增加。减少试剂空白、更高Novoshape稀释进行评估。应该注意的是,正如预期的那样,较低的中外职业活动导致较低的分析信号。,尽管稀释1:60和100 1:显示高信号,空白比率(表1)他们被拒绝的基础上12和22%的净分析信号低于1:20稀释终于选中。

总流量为优化考虑的范围是1 - 4毫升分钟⁻¹。总共2毫升最小的流量⁻¹导致最好的混合试剂给最高的分析信号。图5显示信号沿着EWS注入体积的增加增加范围70 - 123μl . 123μ我被选为进一步增加到250μL不影响显著分析信号。

预培养时间与中外行动影响甲醇生产的混合线圈。表2介绍了预培养时间对反应速率的影响范围内的2到60年代。尽管进一步增加预培养时间预计将导致增加的信号,60年代被选为分析运行时和敏感性之间的权衡。缩短开发时间,10 s优化中使用预培养时间。第二次运行时用于使反应混合物的流动细胞(如在图所示1从3到11 s)是不同的。分析信号沿着时间增加,最大被观察到9,然后减少。有趣的是,试剂空白期间观察到的动力学研究是完全消除。

喷射阀促进混合后的混合线圈放置EWS果胶/中外流。以确保反应混合物快速运输监控流中的细胞,线圈长度应尽可能最小的。应该注意的是,线圈抑制蠕动泵脉动导致增加流分析方法的精度。因此,也由于这一事实(3)收益立即很短的混合线圈,也就是说,10厘米,被选中。

必须特别注意避免样本之间的遗留物和减少在管汇上的吸收/解吸过程的影响。这些现象尤其夸张的粘性果胶等样品。阅读第一日常校准曲线从以下方面有显著的差异。第一,两个后续分析的标准对应于1.4毫米甲醇导致,,马年代⁻¹。这是解决通过允许注射8标准在实际测量启动之前,提高精度10连续注射RSD为5.3%。

典型阅读期间获得第二站泵的说明方法的线性图所示6。提出了数据平滑通过替换值产生的意思是之前的20和20后读数。校准曲线反应速率,。

样品的分析结果相比,那些获得使用手工方法如表所示3。检测极限计算的被发现是1.47毫米。样品分析的开发方法是7 h⁻¹。分析时间短于手工方法皂化所需在至少30分钟。验证该方法相当于手动方法配对以及导致0.357当3.18 3测向置信水平为95%,证明证据表明这两种方法之间没有显著差异。为HM果胶两种方法之间的差异是无关紧要的,而对于LM更高。这可能是由于降低水解率较低造成的LM果胶甲酯内容。补救措施是将样品与标准,分析LM果胶时使用LM果胶进行校准。有趣的是,这两个反应,催化了中外AOX,不要走到尽头。此外,注入EWS的物理混合鸡尾酒也动能在自然界中,不稳态分析运行期间。这些是显而易见的差异从手动方法给予的机会较低的分析时间,但也面临的挑战选择适当的校准标准。

在动力学分析方法只有最初的分数反应监测提供一个快速替代费时的终点的方法。分析参数不是信号的绝对值,而是它的速度变化。这就消除了终点问题由于样品和/或试剂空白。与动力学的方法分析,干扰反应迟钝的微不足道而产生的快速反应是通过短预培养步骤消除干扰的物种在哪里消费(26]。

为了提高分析速度,降低检测极限,分析器可以耦合到一个更敏感的检测技术,也就是化学发光,可以测量浓度低至10 nM (27]。使用化学发光将允许更高的样品稀释,因此洗涤步骤可以消除和监测时间缩短。

4所示。结论

本研究报告一个自动化的发展流测定果胶甲基酯的方法。检测极限下降到1.47毫米7样品分析的速度实现了h⁻¹。配对以及显示结果之间没有显著差异从发达分析仪和人工离线方法。发达的方法是第一个应用程序流分析的果胶质量评估。增加样品粘度如橄榄油或果胶泵在流动注射系统时需要特别注意。粘性样本会导致遗留效应之间的样本。为了避免这些问题之前额外的清洗步骤或饱和系统的测量可能是必要的。另一个解决方案可能涉及合并分析器和更敏感的检测方法,例如,化学发光。这将允许使用高稀释的样本引入因此低粘度。进一步的研究应该关注为半乳糖醛酸内容流分析仪的发展,这与本文提供的分析器将构成一个系统的甲基酯化程度的分析。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

研究导致这些结果已收到资金从欧洲共同体的第七框架计划(fp7/2007 - 2013)根据授权协议。238084年的一部分EU-ITN LEANGREENFOOD网络项目。Mahsa Naghshineh酯化程度上承认提供数据和半乳糖醛酸含量的样品。

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