LC-MS-MS测量的尿肌酐和肌酐归一化技术在吸烟者24小时尿液中胞苷的应用

抽象的

开发了一种简单敏感的高效液相色谱 - 串联质谱（HPLC-ESI-MS-MS）方法，并验证了人类尿液中肌酐的定量。该分析在安置Zorbax Eclipse XDB-C18柱上进行（ mm, 3.5 μ.米）。流动相是在水中的0.1％甲酸和乙腈的0.1％甲酸（50/50，体积/体积）。Linear calibration curves were obtained in the concentration range of 1–2000.0 ng/mL, with a lower limit of quantification of 0.99 ng/mL. The intra- and interday precision (RSD) values were below 3%. The method was successfully applied to a bioequivalence study of creatinine in Chinese smokers and nonsmokers. The total cotinine in 24 h urine and cotinine : creatinine ratio were also positively associated (Pearson那）。However, cotinine : creatinine ratio varied significantly across smoking groups for the difference of individual. 24 h urinary cotinine was more appropriate for expressing correlation with tar than cotinine : creatinine ratio.

1.介绍

香烟烟雾中有5000多种化学物质[1］．接触香烟烟雾会对身体产生一系列不良影响[2］．尼古丁是一种化学物质，其含量约为卷烟烟草重量的1%。尼古丁是烟草的主要活性成分，也是导致吸烟成瘾或产生依赖的主要因素[3.］．丁宁，尼古丁代谢的主要降解产物，已经成为评价香烟烟雾暴露[重要认可特异性生物标志物4.］．

尿液标本通常用于生物监测，因为尿液收集是无创的，对参与者和研究人员的感染性疾病风险最小。连续和完整的24小时尿液收集可产生更准确的结果，因为现场尿液取样可能不能提供整个有毒物质暴露概况的有效概述[5.］．尿液样本的完整性和完整性对于暴露评估研究是至关重要的，不符合采集规程是研究人员最关心的问题。由于肌酐通过肾小球滤过以相对恒定的速率从尿液中排出，其测量是对样本完整性和完整性的评价[6.那7.］．此外，尿肌酐通常以比例格式使用以使样品浓度的分析物定量标准化[8.那9.］．归一化过程涉及到将感兴趣的分析物浓度除以同一尿液样本中获得的肌酐浓度，结果报告为目标分析物每毫摩尔肌酐的浓度。最近，尿肌酐作为一种标准化基础，被用于考虑与吸烟有关的各种外源性物质的排泄，包括可替宁和巯基酸[10］．

关于人体流体中肌酐的测定有许多论文，包括贾维特方法[11那12，酶法[13.]，流动注入分析[14.]，高效液相色谱法[15.-22.]毛细管电泳[23.-25.，区带电泳[26.[气相色谱 - 质谱[27.或液相色谱与质谱相结合（LC-MS-MS）[28.-30.］．进行最近测定通过LC-MS-MS直接喷射的生物流体中的肌酐，δ-氨纤维素和酪氨酸，并且使用同位素稀释串联质谱法评估血清，血浆或小鼠等离子体中肌酐测定的准确性[28.那29.那31.-33.］．Hušková等[34.建立了固相萃取-质谱联用法快速分析尿中肌酐的方法。虽然固相萃取用于样品制备费时，串联质谱的选择性不能消除尿液中的所有干扰。Park等人引入了另一种改进的LC-MS-MS方法，可直接分析甲醇稀释后24小时尿液中的肌酐[30.］．然而，在0.59 min的塔中洗脱分析物，其不能与水溶解的尿蛋白和大分子分离（在C18柱上保持时间<1分钟）。人类肌酸酐的尿排泄是医院的常规测试。基于颜色反应和酶测定的方法被缺乏选择性限制。循环结果显示实验室与方法之间的相当大，不满意的变化[35.］．

为了消除由不同的仪器的干扰为尿肌酐和使用尿肌酐来标准化在人类生物流体吸烟相关的生物标志物，一个灵敏的和选择性的LC-MS-MS方法对尿中确定肌酸酐被开发，并用酶的比色测定证实。所提出的方法是从吸烟者和非吸烟者施加到尿样品。数据应用到调整丁宁值，并着手探讨是否发生与焦油的一致性把它与烟草暴露任何改善。

2.实验

2．1.化学药品和试剂

从Tedia公司Inc.（哦，美国）获得乙腈，甲酸和甲醇。所有溶剂都是HPLC等级。肌酸酐是从美国药长公约（Rockville，MD，USA）获得的。肌酐-D_3.(N-methyl-d_3.; 纯度：98%；同位素纯度：99%，多伦多研究化学公司（加拿大多伦多）用作内标物（IS）。

2.2。编制库存解决方案，校准标准和质量控制样品

肌酐和肌酐-d的初步原液_3.为了制备标准和质量控制（QC）样品，通过单独称重来制备。肌酐和肌酐-D的主要储备溶液（0.21和0.1mg / ml）_3.，分别在水中制备和在−80°C下储存，发现其稳定性为3个月(数据未显示)。在水中进行适当的稀释，以产生100、1,000和10,000 ng/mL的肌酐工作原液，用于校准曲线的制备。通过加入不同等量的分析物工作原液和25 ng/mL肌酐-d，新鲜制备了校准剂(1、2、5、10、20、50、200、500和2000 ng/mL)_3.水。还用人尿制备了三种不同浓度(50、200和400 ng/mL)的肌酐质量控制样品。

2.3。样品制备

将冰冻的尿液样本解冻至室温并混合以悬浮任何沉淀。一个10μ.将L甲酸加入到1ml等分试样的人尿样，搅拌，并以10000rpm离心10分钟。将混合物过滤通过0.22 μ.M聚醚砜膜和5 μ.L urine aliquot was transferred to an amber volumetric flask and brought to a total volume of 10 mL with water after being spiked with 100 μ.L (creatinine-d_3.内标溶液（1 μ.g / ml）。一个5 μ.L等分试样用于LC-MS-MS的柱子。保留另一种等分试样的尿液样品以酶学性比色分析。

在日立模块化自动分析仪（罗氏）进行酶比色法。酶促方法基于肌酸酐的酶降解并通过肌酸酐，肌酸，和肌氨酸氧化酶及其反应产物。H.₂O.₂分光光度法测定肌氨酸氧化产生的物质。

２.４.仪器分析

所有样品均采用Agilent 1200液相色谱仪(Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)与API 4000三四倍质谱仪(配备TurboIonSpray源)(应用生物系统，Foster City, CA, USA)进行分析。ESI在正离子模式(离子喷雾电压4500v)下进行，氮气为雾化(气体1)、加热(气体2)、窗帘和碰撞气体。气体流动参数优化(雾化器40psi，加热器40psi和窗帘气体30psi)通过连续的流动注射，同时在200的电离源引入流动相μ.L / min。在恒定流量为10的条件下，采用集成弹簧泵优化肌酐的聚簇电位(73 V)、入口电位(10 eV)、碰撞能量(29 V)和细胞出口电位(8 V)μ.L / min。将涡轮离子喷雾温度设定在480℃。在多重反应监测（MRM）模式下进行定量分析，停留时间为100ms。

安捷伦Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1 × 150 mm, 3.5μ.m粒径，Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)，流速为200μ.L / min在环境温度下。用50％溶剂A（水中的0.1％甲酸）和50％溶剂B（乙腈中0.1％甲酸）进行等型分离。通过0.45过滤溶剂 μ.米膜和脱气，在使用前的真空。等分试样（5 μ.L)的标准品或含内标物的稀释尿液样品注入LC-MS-MS系统。该仪器与一台运行Applied Biosystems Analyst 1.5版软件的计算机相连。

根据先前公布的方法进行酶学法测定[36.］．

根据先前发表的LC-MS-MS方法分析吸烟者和非吸烟者尿可替宁总量[37.］．

2.5。验证实验

根据美国食品和药物管理局(FDA)的生物分析方法指南，对几个性能参数进行了测试，以验证所提出的方法。这些因素包括:校准曲线的线性度、校准曲线与线性回归模型的拟合优度、特异性、选择性、融化稳定性、回收率、基质效应和精密度。

2.6。尿液样本

这些研究得到了郑州大学伦理委员会的批准。246 24 三天内82名吸烟者和57名空白24名吸烟者的h-尿样 非吸烟者的h-尿液样本是从郑州大学临床药理学研究所正在进行的研究（与吸烟相关的尿液生物标志物）中获得的。所有受试者均获得知情同意和/或同意。

3.结果与讨论

3.1. 色谱条件的优化

在方法开发和验证的初始过程中，对几种不同的LC柱和相关溶剂系统进行了评估，以获得背景干扰分析物的最佳色谱分离。除XDB C18色谱柱外，大多数色谱柱的峰型较差。初始流动相选择为水和甲醇（v/v），同时也观察到不良的峰形状。为了得到良好的峰形和分离效果，选择溶剂A（0.1%醋酸铵水溶液）和溶剂B（0.1%甲酸甲醇溶液）作为流动相。

３．２．质谱和检测条件

MS的检测参数以10的流速使用注射器泵进行优化 μ.肌酐的ESI质谱如图所示1．在ESI的条件下，质子化分子（[]⁺）肌酸酐和肌酐-d的_3.在?处观察到为底峰分别是114和117。两种化合物的碰撞诱导解离产生一个主要的片段离子在86用于肌酐和89年creatinine-d_3.分别对应于CO [M + H-CO]的中性丧失⁺．同时，裂解离子[M + H-CO]⁺能在44肌酐和肌酐-d为47_3.（数字1）。对于每个分析物，在多反应模式（MRM）下使用两个离子转变对。这些离子对为肌酐114/86和114/44，用于确认和定量，117/47用于肌酐-D_3.．

3.3。特异性和选择性

在肌酐和肌酐-d的保留时间观察到从内源性化合物没有显著干扰峰_3.．肌酐和肌酐-d的保留时间_3.分别为1.4和1.3 min。总色谱运行时间为12 min。肌酸酐d的典型MRM色谱图_3.呈现溶解在水中的肌酐（A1），（A2）和（A3）中的图表2．两种化合物均在稀释的尿液样本((b1)， (b2)和(b3)中检测到，见图2）。

3．4．解冻的稳定性

尿矩阵在每个验证实验期间接受了解冻/稀释周期，在验证结束时累积了六个这样的循环。血液浓度浓度的六个验证实验的平均值是mmol/L (CV = 2.1%)。cv值与日间cv值相似，表明尿液在冰水中快速解冻不影响分析物的浓度。

3．5．基质效应和稀释的影响

尿液成分对分析物电离和IS的影响是通过比较提取后的尿液标准QC样品()与纯样品在相同浓度下的响应。在相同的分析物和IS浓度下测定基质效应。

Zinellu等。[24.]和waterval等。[33.]据报道，尿液固相萃取预处理不是尿肌酐测量的必要步骤，不经预处理的简单尿液稀释可提供较高的肌酐选择性。鉴于此，本研究采用了水和甲醇的简单稀释。如图所示3.，用水稀释尿液标本，可得到清晰的肌酐色谱图。水稀释尿液的信噪比高于甲醇稀释尿液的窄肌酐色谱峰和低噪声。肌酐在所有尿液标本中容易检测到，当尿液标本稀释到2000倍时，肌酐的分析效果更好。此外，将稀释后的尿液样品应用于LC-MS-MS可以减少基质效应的影响，从而允许更多的样品在清洗前进行处理。

3.6。恢复，校准曲线，检测限（LOD）和定量（LOQ）和精确

通过掺入具有三种浓度的肌酐（50,200和400ng / ml）的Nonsmoker池尿液样品获得分析恢复率。回收率从98.6到106.0％（） （桌子1）。

绘制肌酐与IS的峰面积比与肌酐浓度的关系曲线，以构建校准曲线。使用溶解在水中的肌酐创建的校准曲线是线性的(那)的分析范围为1 ~ 2000ng /mL。

根据分析师1.5软件（应用生物系统）的集成功能，根据仪器响应确定LOD和LOQ。这些计算分别基于LOD和LOQ的3和10的信号/噪声比。根据校准曲线上的基于内部标准区域的比率计算相应的浓度。溶解在水中的肌酐的LOD和LOQ为0.30和0.99ng / ml。

方法的日内精密度(RSD)通过重复分析(）含有低，培养基和高浓度的肌酸酐的样品。间隔的精确度（RSD）是通过在10个单独的几天内复制相同样本的分析来建立。确定的日期和白杨精的精度分别为1.0-1.8％和1.5-2.9％（表2）。内部和白天结果表明该方法可靠。

3.7。比较的方法

公布的HPLC方法，蛋白质的注入样品中的存在可以导致在偏置分析结果列端的修饰。因此，还需要大量的样品清理包括液 - 液（L-L）的提取和SPE得到低样品基体效应和目标化合物良好HPLC分离。然而，固相萃取不是为肌酸酐提供高选择性尿肌酐测定的必要步骤和尿样的简单稀释无需预处理[38.］．在该实验中，在酸沉淀，离心和过滤后使用与水的简单稀释。肌酸酐浓度可以很好地确定，并且在用水稀释2000倍后，基质效应可能是Extraordinaire光。与已发表的LCMS / MS方法相比，新方法需要更少的样品（5 μ.大号相比50 μ.L尿)的检测下限(0.3 ng/mL, 22.8 ng/mL [38.， 1 ng/mL [30.]，6 ng / ml [29.]和3.7 ng / ml [28.])。此外，该方法具有较低的检出限，可用于测定低至1 ng/mL的肌酐浓度。

为了验证LC-MS-MS的有效性，我们采用简单的一步稀释LC-MS-MS和酶比色法(酶比色法详见表)对28份24小时尿液样本(吸烟者16份，非吸烟者12份)进行了测定1在补充资料可在http://dx.doi.org/10.1155/2012/245415)做同样的尿液样本化验。比色法和LC-MS-MS法测定的肌酐值呈正相关(Pearson那那,图4.）（对于原始数据见补充材料中的表1）。然而，与酶比色法相比，LC-MS-MS具有低检测限和高选择性的优点。此外，它可以减少干扰。来自同一仪器的数据可以为肌酐归一化技术提供更准确和稳定的结果。

3.8。在丁宁肌酐标准化技术在吸烟者的尿液影响

Cotinine是尼古丁的主要代谢物，是评估烟草暴露和吸烟状态的最合适参数，因为它与尼古丁相比其稳定性较高和半衰期[9.那39.］．Urinary creatinine and cotinine concentrations were determined in 24 h-urine samples (）from 82 smokers and 24 h-urine samples (）来自57个非墨师（LC-MS-MS方法，用于测定胞苷，参见补充材料）。

归一化过程涉及到可替宁浓度除以同一尿样中获得的肌酐浓度，结果表示为每毫升肌酐的可替宁浓度。评估肌酐归一化与非归一化可替宁值的差异以及24小时尿中总可替宁与可替宁肌酐比值的相关性。归一化可替宁值与非归一化浓度(Pearson那）。Total cotinine in 24 h-urine and cotinine creatinine ratio were also positively associated (Pearson那)(原始数据见补充资料表2-5)。

24小时尿液当前作为评估异丙酚的方法被认为是“黄金标准”，这可能是关于尿氨基氨基排泄的最佳信息。24小时尿氨基氨基与图中的焦油正相关5(一个)(表3.）。丁宁调整值进行了探索是否发生与焦油的一致性任何改善，其结果是在图显示5 (b)(表3.）。很明显，图中的相应气泡5(一个)浓缩以上，在图5 (b)那except 8 mg : 10 mg. There was no use in improving the concordance, except 8 mg : 10 mg (0.716 versus 0.722). The reason may be the influence of age and gender on creatinine production.

4。结论

建立了液相色谱-质谱联用法测定尿肌酐含量的方法。样品制备只涉及稀释尿液的离心和过滤，这不仅允许高的样品吞吐量，而且降低肌酐背景噪声和尿盐浓度。此外，尿肌酐以归一化可替宁浓度的比例形式使用。

24例患者的标准化可替宁值与可替宁总量在统计学上显著相关 h-尿和可替宁肌酐比率也呈正相关。因为可替宁 : 不同吸烟组的肌酐比率差异显著，个体差异为24 尿h-可替宁比可替宁更适合表达与tar的相关性 : 肌酐比率。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金的支持（21277174）。作者希望感谢来自临床药理学研究所（郑州大学，郑州大学，中国医学院）的副教授，用于提供来自非助手的吸烟者和空白尿液样本的24个H尿样。

补充材料

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