关于基质辅助激光解吸电离中的初级电离机制

摘要

提出了在基质辅助激光解吸电离中发生电离的第一步骤的机制，导致质子化和质子化基质（MA）分子（和离子)。根据观察，在固体状态下，对于含羧基的MALDI矩阵，分子形成强大的氢键，其羧基既可以作为供体，也可以作为受体。这种行为导致了稳定的二聚体结构。激光照射导致这些氢键的分裂，理论计算表明两者都是和可以通过双光子吸收过程形成。或者，通过仅吸收一个光子，O-H键之一的异源性可导致含有阳离子和阴离子位点的稳定结构。这种结构可以被认为是中间体，通过吸收另外的光子，导致形成基质离子。已经进行了一些实验以评估热电电离的作用，并表明其效果可以忽略不计。在分析物分子（M）离子的形成中，不同矩阵已经观察到一些差异,,， 和和他们已经在电离能，pKa值，以及热力学稳定性的角度来解释。

1.介绍

基质辅助激光解吸电离[1.]是一种宽的分析兴趣的方法，代表了获得关于大分子分子量的信息的有效方法。由于特权形成单电量分子（,即使在一定程度上存在离子抑制作用，它也能提供有关大分子混合物的信息。MALDI被广泛应用于蛋白质领域，并成功地用于测定完整的蛋白质分子量达10^5. Da, as well as to obtain information on the protein sequences by a rapid analysis of their digestion products and by MS/MS experiments performed on them.

不同的机制已经提出来解释MALDI电离[2.］．均与两种不同步骤的存在一致：（i）来自基质（MA）的主要离子形成;（ii）源自反应性基质离子的气相相互作用的分析物（A）的二次离子形成，分析物的中性分子。点（i）是最讨论的，因为光子能量（对于n_2.激光 eV, for triplicated Nd:Yag laser eV) is much lower than that required for matrix ionization (typical ionization energies (IEs) of the most employed matrices are in the range 7–10 eV) [3.］．

有人建议[4.]多光子吸收，导致多个电子激发的基体分子，随后出现能量聚集现象，会导致基体中奇电子分子离子的形成然后，和中性的基质分子反应，导致．最后一种物质必须被认为是气相中分析物(A)质子化的原因: 只有在PA._A.> PA_嘛， (PA =质子亲和力)。

这一机制的可能局限性在于多光子吸收和能量聚集的概率较低，这使得在MALDI实验中观察到的高离子产率难以解释。

也有人认为，电子激发(需要1个光子)一般会导致基质酸度的增加，促进质子转移。然而激发态质子转移(ESPT) [1.,5.]不影响羧酸，因此不能调用作为MALDI基质的质子转移的有效机制;此外，ESPT对于不表现出任何活动作为MALDI基质的化合物是活性的。

已存在于固体样品(激光辐照前)的预形成离子的解吸被认为是MALDI电离机制[6.]在这种情况下，激光效应将只是这些离子或含有它们的基质团簇的解吸。在后一种情况下，离子通过高密度解吸羽流中发生的脱团反应而游离。这种机制可以在预质子化合物、金属络合物和离子化合物的情况下调用，并且它是很好的支持通过热脱附实验，揭示了激光辐照产生的相同离子在气相中的存在⁺激光照射前基体中的离子很难证明，因此气相质子化机制与(1.)必须调用。

其他的电离机制被提出如激光诱导的冲击波[7.]（激光照射产生局部高压冲击，导致基质分析物样品微体积的热激发），热电离[8.]（通过在晶格光子与声子转变始发），和离子电子发射由于压电效应[9］．

所有上述建议主要集中在MALDI电离机制的物理方面，而基质的化学性质仅被略微考虑[10.］．

在本文中，我们提出并讨论了另一种可能的机制，这与MALDI实验有效的基质的化学性质和它们在结晶时的结构安排有关。当受到辐射时，基质分子中羧基的固相相互作用可以被认为是导致歧化反应的原因，导致两种反应和离子，也就是反应物和/或形成。这方面所知甚少，但一些基质中性和阴离子的气相碱度测量[11.,12.表明不对称反应可以通过双光子吸收实现。从实验和理论两方面对这一假设进行了研究。

2.实验

2.1。样品制备

一个μ.三种不同矩阵解的L (α.-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和芥子酸(SA) (10mg /mL乙腈)沉积在MALDI平板上晾干。

将三种基质溶液与钴粉悬浮液(10 mg/mL)混合_2.O)以获得“基体:钴”的摩尔比:10:1,1:1和1:10 (w/w)。一个μ.如此获得的三种溶液中的L种沉积在MALDI板上，并让其干燥。

将0.01mg胰岛素溶于1ml四种不同的溶液中（H._2.哦_2.o含0.1％甲酸，H_2.o含有0.1％乙酸，H._2.O含0.1%三氟乙酸)。5μ.每一胰岛素溶液的L与5混合μ.L芥子碱溶液（10 毫克/毫升，单位：小时_2.O/ACN, 1: 1, v/v)。一个μ.如此获得的溶液L沉积在马尔达板上并留下干燥。

0.1 mg人血清白蛋白(HSA)溶于1 mL的四种不同的溶液(H_2.哦_2.o含0.1％甲酸，H_2.o含有0.1％乙酸，H._2.O含0.1%三氟乙酸)。5μ.每种HSA溶液的L与5混合μ.L芥子碱溶液（10 毫克/毫升，单位：小时_2.O/ACN, 1: 1, v/v)。一个μ.如此获得的溶液L沉积在马尔达板上并留下干燥。

2.2。MALDI-MS测量

MALDI/MS测量使用MALDI- tof UltrafleXtreme (Bruker Daltonics，不莱梅，德国)，配备1 kHz智能束II激光器(nm)，并在正负反射离子模式下工作。

用于分析分子种类的仪器条件m / z正离子模式下50-3000范围为离子源1:25.00 kV;离子源2:22.30 kV，镜头:7.70 kV，脉冲离子提取:80 ns，反射器:26.45 kV，反射器2:13.45 kV。用于分析分子量的仪器条件m / z980-7000范围是离子源1：25.00 kV;离子源2：22.40 kV，镜片：8.00 kV，反射器：26.45 kV，反射器2：13.45 kV，脉冲离子提取：120 ns。用于分析分子量的仪器条件m / z范围50000-80000为离子源1:25.00 kV;离子源2:23.30 kV，镜头:6.50 kV，脉冲离子提取:450 ns。

分析溶液中低分子量的仪器条件m / zrange 50–2000 in negative ion mode were Ion Source 1: 20.00 kV; Ion Source 2: 17.85 kV, Lens: 6.15 kV, Reflector: 21.15 kV, Reflector 2: 10.75 kV, Pulsed ion extraction: 80 ns.

使用肽校准标准来完成外部质量校准，基于单位异位值血管紧张素II，血管紧张素I，物质P，Bombesin，ACTH夹（1-17），ACTH夹（18-39），生长抑素28m / z1046.5420，1296.6853，1347.7361，1619.8230，2093.0868，2465.1990和3147.4714，分别与通过使用单一同位素值胰岛素的“质量/电荷”(m / z5730.6081)。

这个和通过用相同的激光功率和相同数量的激光射击（2000）来测试离子生产。

2．3.理论计算

根据热力学Hess定律计算以下假设的光过程能量。通过同时优化其几何结构计算特定光反应产物的形成能。从剑桥结构数据库中获取的二聚体结构被视为最佳。所有利用混合泛函B3LYP和6-31+G*函数基，采用DFT方法计算地层能量值[13.］．该函数库包含扩散函数(由“+”设计)和偏振函数(由“*”设计)。这些补充功能使得必需的6-31G碱基能够正确描述离子系统。计算是用Spartan软件完成的[14.］．

3。结果与讨论

有趣的是，大多数进行MALDI实验的有效矩阵(Ma)都含有羧基。乍一看，这方面可能表明，基质的酸度直接影响质子化分子的产生分析物。然而，强调这一行为不能解释，在相同的酸性基质下，脱质子反应如何发生，并形成分析物的离子。如引言中所述，物种负责产生在大多数情况下，被认为是，即质子化矩阵，而不是MA分子和/或．因此，该生产应被视为MALDI机制的焦点。如上所述，文献中提出的大多数MALDI机制主要集中在与激光辐照相关的物理方面[2.]：在汇集机制的情况下[4.固体样品与光子的相互作用导致电子激发，即仅在汇集现象之后，可以给予帐户（而不是）离子产生。在预先形成的离子机构的情况下，这些离子被认为是固态样品中已经存在，和激光照射的唯一的作用是使它们在气相中释放[6.］．

在这里，我们提出了一种不同的机制，其中，考虑到羧酸固态中的分子排列，羧基之间可能存在相互作用，如图所示1.．羧酸是一种很容易形成强氢键的化合物，其羧基既可以作为给体也可以作为受体[15.–17.］．在一些情况下，形成这些基团之间的分子间氢键。在剑桥结构数据库5.32（征服版本1.13）中[18.在17615个合并的羧基中，有4129个结构含有分子间的羧基-羧基氢键。它们中的大多数(3431个结构)形成图描述符所描述的中心对称或准中心对称的8元环排列[19.–21.]其他形成链结构，包括链聚体排列，其中H键形成于平移对称性相关分子之间（包括螺旋轴对称性）该特征仅适用于必须在没有对称中心的手性空间群中结晶的手性化合物，也适用于某些简单羧酸，例如甲酸[22.,23.]和醋酸[22.,24.]在比较乙酸的结构时，形成二聚体与邻苯二甲酸二酯结构的偏好并不清楚[22.),三氟醚- [25.和三氯乙酸[26.］．

激光照射的基质二聚体的结构如图所示1.可以被认为是离子偶形成的原因和．事实上，通过照射芥子酸，两者都有和产生离子的丰度几乎是相同的。相关光谱，见图2 (e)和2 (f),have been obtained by using the same laser power (35%) and the same delay time (80 ns). The situation is more complicated in the case of DHB (Figures2 (c)和2 (d))：和相似丰度的离子(80700;分别为96500)，表明发生了歧化反应和或者离子以几乎相同的丰度存在。2,5-DHB的电离能(8.05 eV)低于SA (8.47 eV)和HCCA (8.50 eV)，可以证明前者的形成是合理的[10.]，而形成可能是由于通过的自由基阴离子的高稳定性损失离子。(见方案1.）.在HCCA的形成的情况下离子是高度偏爱的（离子丰富200000），同时离子显示出丰富的2000。这可以通过其pKa值(约8)来证明，高于其他矩阵(约4)[27.］．

产生的主要问题如下：是否通过光子激活的该解离反应或通过激光照射引起的局部加热？如Dreisewerd等人所述，可能发生热电电离。[8.]在基质散装中，在表面电离规则之后。通过热电电离观察的典型反应是由萨哈 - 朗马尔方程管辖的不成比例（2.)其中，功函数被矩阵电子亲和力（EA）取代： 在哪里是物种的电离程度吗,是接近统一的常数，是矩阵电子亲和力，是矩阵的电离电势，是boltzmann常数，和是绝对温度。

从这个方程可以得出，MALDI中的热电离需要非常高的温度，而不是简单的基质辐照所能得到的。为了研究这一点，将三种基质与粉末钴混合，以增加激光功率吸收。在这些条件下，热效应的作用将进一步增强。这样得到的结果被报告在图的直方图中3.．由此可以看出，钴引线的存在的下降离子的形成，以及与钴存在时更高的能量吸收有关的可能的温度升高，并不是导致离子生产。

为了评估光子辐射的作用，进行了一些理论计算。提出了三种计算模型的UV-MALDI初级基质电离机制，其可能产生分析物离子。在这些模型计算中，在其性质中测试苯甲酸二聚体和苯甲酸二聚体二聚体2,5-二羟基苯甲酸，4-甲氧基苯甲酸，4-硝基苯甲酸和4-N，N-二甲基氨基苯甲酸。提出了苯甲酸衍生物，以允许比较取代基的电子给予或电子 - 受体性质对离子化分子分子的能力。二聚体分子的结构取自剑桥结构数据底座，并用作它们电离能量的量子化学计算中的起动晶体结构。

根据第一个模型，吸收的紫外光光子由基质二聚体诱导其解离过程为单体，并同时杂化其中一个氢键。本计算模型以苯甲酸为例，用Scheme中报道的解离反应进行了说明2.．

所有研究的反应的能量（每一个二聚体分子）用DFT方法在B3LYP (6-+31G*)水平上计算，并与两种常用的337和355 nm波长的紫外激光器发射脉冲的光子能量进行了比较和．这些光子能量是 eV and电动汽车。

所研究的二聚体的能量计算值如表所示1.．这些结果清楚地表明，这种类型的离解不是单光子过程，它满足双光子过程的能量标准，使这种过程的概率很低。然而，有趣的是，双光子过程是由Zenobi和Knochenmuss调用的[10.通过汇集现象作为其电离理论的第一步。表中报告的数据1.表明与两个光子的相互作用足以激活方案中所示的离子对形成2.．实验数据见图2.和示出的实际上是相同的丰度和对芥子酸和DHB支持此机制。

第二种提出的基质二聚体分子的光离机理与Scheme中报道的反应相一致3.．两种方法的能量，与质子转移到羰基氧原子相关的两个O-H键的异质均分散，苯甲酸部分的旋转180°的O-H氢键，有助于能量要求这种反应。由于在优化期间，不必要的离子足够不稳定，因此需要在这种离子的建模中进行这种旋转的假设，以便在优化期间倾向于返回到起始二聚体结构。表中的计算值在表中给出2.．这个流程可以为HCCA调用，因为它的pKa值很高。

研究的第三种光处理是二聚体均解离成中性单体(方案)4.）.显然，这不是电离过程本身，但有理由假设质子可以通过激发态质子转移转移[5.从单体到被分析物分子，并因此可能引起被分析物的电离。这一过程也有可能分为两个阶段，尽管可能性较小。根据这个假设，第一个吸收的光子诱导二聚体解离成单体的反应(上面的反应)，在第二阶段，下一个光子可能导致单体的电离。表中收集了所研究的二聚体的离解能值3.．

光子能量的比较（ eV) with the particular energy of each process studied leads to the conclusion that the one-photon ionization of the matrix dimers can take place according to the second ionization model (Scheme3.），可以只为2,5-二羟基苯甲酸，4-甲氧基苯甲酸，4-硝基苯甲酸，和4-N，N-二甲基氨基苯甲酸操作。看来，分析物的两级电离也可能在一定程度上，因为单体的生命时间可以足够长，这些单体可以由下一个光子被电离吸收。

取代基效应对计算能量值的影响分析(）对于研究的化合物引线的结论是，有（取代基的选择的特性例如电子亲和力）和这些化合物的来进行离子化的能力之间没有相关性。当然，具有更多的数据将有可能寻找这样一个趋势。

最后，我们研究了通常添加到溶液中的小有机酸（Ac）的作用()溶液，然后进行MALDI测量。通常添加0.1%的三氟乙酸(TFA)，导致分析物离子强度的高增强。为了验证这一点，将含有胰岛素或白蛋白的三种基质(HCCA、DHB和SA)的溶液加入0.1%的甲酸(HCOOH)、乙酸(CH)_3.和三氟乙酸(TFA)。结果如图所示4.和5.分别指示与TFA的信号强度的宽的增加而获得。这可能是由于TFA和分析物分子，但替代地，它可以被认为之间的质子化反应的是TFA的不同酸度可能导致[复合与不同的电子分布:在这种情况下形成离子将被强烈支持（图6.），由于TFA的较高的酸度。是在这种情况下，也进行了一些计算。关于上述复合所有的计算都根据图解所示的方案进行了2.通过计划4.．在方案中显示的最可能的过程中，应考虑到这一点3.，两个氢键都不等同，因此较弱的一个将被破坏（参见方案5.）.计算得到的相应能量如表所示4.．

共轭物生成取代苯甲酸阳离子和三氟乙酸阴离子的离解能(见表)5.）和成单独的酸单体（表6.)已计算。表中收集的值5.，与表中的类似1.，认为这样的过程不可能是单光子过程和解离成单体是低能量过程。

4。结论

所得数据表明，考虑固体样品中的基质分子为分子间含羧基-羧基氢键的二聚体结构，以中心对称或准中心对称的8元环排列方式，两者均可形成和离子可通过双光子诱导的歧化反应的发生是合理的。可替换地单光子诱导的过程可导致八元环的与所述随后形成含有阳离子和阴离子位点物种的开口。实验数据表明，过程导致必须考虑被光子激活，而热电离似乎抑制了这种行为。

有趣的是，与考虑含有预先形成离子的簇的解吸有关已经提出的机制，所获得的结果是不知情的。6.];我们的数据似乎表明，离子不是原来的固态样品中存在，但它们是由激光照射起源。在多光子吸收的情况下，接着通过汇集现象[4.]，是上面讨论的数据表明，没有必要调用能量池:事实上，两个光子的吸收将足以激活导致的不比例反应和，即用于分析物电离的反应物。

信息披露

本文是初步提出了在“XX讨论组上质谱。高特异性方法：权力和限制，”菲耶拉迪普里米耶罗，意大利，26日至27日2012年3月。

参考

1. M. Karas, D. Bachmann，和F. Hillekamp，“波长在有机分子高辐照度紫外激光解吸质谱中的影响”，分析化学(第57卷)14，第2935-2939页，1985。查看在：谷歌学术搜索
2. R. knochenmuss，电喷雾和MALDI质谱， R. B. Cole, John Wiley & Sons，霍博肯，新泽西州，美国，2010。
3. UV-MALDI中的离子形成机制分析师，卷。131，没有。9，第966-986，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
4. P. D. Setz和R. Knochenmuss，《MALDI矩阵中的激子迁移率和捕获》，物理化学学报，第109卷，第2期。18，页4030-4037,2005。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
5. J. F. Ireland和P. A. H. Wyatt，“有机分子电子激发态的酸碱性质”，物理有机化学进展，第12卷，131-221页，1976年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. M. Karas, M. Gluckmann，和J. Shafer，《MALDI中的电离:单电荷分子离子是幸运的幸存者》质谱学杂志，第35卷，第1期，第1-12页，2000年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
7. D. D. Dlott，S. Hambir，以及J. Franken，“冲击波中的新波”，“物理化学学报B第102卷第1期12、1998年。查看在：谷歌学术搜索
8. K.Dreisewerd、M.Schürenberg、M.Karas和F.Hillenkamp，“在均匀光束轮廓的基质辅助激光解吸/电离中，激光强度和光斑大小对分子和离子解吸的影响，”国际质谱与离子过程杂志，第141卷，第2期，第127-148页，1995年。查看在：谷歌学术搜索
9. X. Chen, J. a . Carroll, R. C. Beavis，“近紫外诱导的基质辅助激光解吸/电离作为波长的函数”，美国质谱分析学会杂志，第9卷，第9号，第885-8911998页。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. R. Zenobi和R. Knochenmuss， " maldi质谱中的离子形成"质谱分析评论，第17卷，第5期，第337-366页，1998年。查看在：谷歌学术搜索
11. R. W. Taft和R. D. Topson，《取代基效应的性质和分析》，物理有机化学进展，卷。16，pp。1-83,1987。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
12. K. Breuker, R. Knochenmuss，和R. Zenobi，“去质子化基质辅助激光解吸/电离基质分子的气相碱度”，国际质谱学杂志，第184卷，第1期，第25-38页，1999年。查看在：谷歌学术搜索
13. C.Lee，W.Yang和R.G.Parr，“将Colle-Salvetti关联能量公式发展为电子密度函数，”物理评论B，第37卷，第2期，第785-789页，1988年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
14. Spartan '08版本1.2.0，波函数，尔湾，加利福尼亚州，美国，2009年。
15. L. Leiserowitz，“分子堆积模型。羧酸，”Acta Crystallographica B，第32卷，第3期，第775-802页，1976年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
16. J. K. Maurin，“肟-羧基氢键:决定‘羧基肟’晶体堆积的首选相互作用”，Acta Crystallographica B第54卷第5期6、1998年。查看在：谷歌学术搜索
17. J. D. Dunitz和P. Strickler，结构化学与分子生物学， W. H. Freeman，旧金山，加利福尼亚，美国，1968年，A. Rich, N. Davidson编辑。
18. F. H. Allen和W. D. S. Motherwell，“剑桥结构数据库在有机化学和晶体化学中的应用”，Acta Crystallographica B，卷。58，不。1，第3部分，PP。407-422，2002。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
19. M. C. Etter, J. C. MacDonald, J. Bernstein，“有机晶体中氢键模式的图集分析”，Acta Crystallographica B，卷。46，第2-262，1990。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
20. J. Grell, J. Bernstein，和G. Tinhofer，“氢键模式的图集分析:一些数学概念”，Acta Crystallographica B，第55卷，第55期6，第一零三零年至1043年，1999年。查看在：谷歌学术搜索
21. M. Ratajczak-Sitarz和A. Katrusiak，“羧酸中氢键尺寸和h位与分子方向的耦合”，[分子结构，第995卷，第1-3期，第29-34页，2011年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
22. I. Nahringbauer, “A reinvestigation of the structure of formic acid (at 98 K),”Acta Crystallographica B第34卷第3期1，第315-318页，1978。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
23. D.R.Allan和S.J.Clark，“阻碍甲酸高压晶体结构中二聚体的形成，”物理评论快报，第82卷，第2期17，第3464-3467页，1999。查看在：谷歌学术搜索
24. R. Boese, D. Blaser, R. Latz, and A. Baumen，《40 K的醋酸》Acta Crystallographica C，第55卷，第55期2、1999。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
25. I. Nahringbauer, J. O. Lundgren和E. K. Andersen，《三氟乙酸》，Acta Crystallographica B第35期2，页508-510,1979。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
26. K. Rajagopal, A. Mostad, R. V. Krishnakumar, M. S. Nandhini, and S. Natarajan, “Trichloroacetic acid at 105 K,”晶体学报，卷。59，没有。3，第o316-o318，2003。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
27. S.绍尔，D. Lechner的和I. G.肠道，质谱和基因组分析，Kluwer Academic，Dodrecht，荷兰，2001年，由J. Nicholas Housby编辑。

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