小说三明治电化学免疫传感器基于DNA-Derived磁Nanochain甲胎蛋白探针

文摘

一个新颖的电化学免疫传感器是由固定的捕获抗体甲胎蛋白(AFP Ab₁)在全氟磺酸/ nanogold-particle改性玻璃碳电极。三明治免疫测定,一DNA-derived磁nanoprobe简化为DNA / (ZMPs-HRP-AFP Ab₂)_n是用于检测AFP。该生物传感器的制作过程是通过循环伏安法和电化学阻抗谱特征。生物传感器的性能及影响性能的因素也被评估。在最优条件下,开发生物传感器表现出一个定义良好的电化学行为的减少法新社从0.01到200 ng / mL的检出限4 pg / mL ()。生物传感器是应用于测定血清AFP的令人满意的结果。重要的是要注意,三明治nanochainmodified electro-immunosensor提供另一种衬底的固定其他肿瘤标志物。

1。介绍

甲胎蛋白(AFP)是一种针对癌症的生物标志物的诊断。高水平的法新社可以表明肝癌的风险增加1,2]。免疫测定是其中一个最强大的分析工具由于抗原抗体相互作用的特异性和敏感性,因此,它广泛用于临床诊断3]。然而,增加对早期和超灵敏检测癌症生物标记物的需求正在推动检测灵敏度的提高信号放大或新颖的检测技术4,5]。相比与传统免疫测定,如酶联免疫吸附试验(ELISA)和化学发光免疫分析法,电化学免疫分析法已经吸引了相当大的兴趣广泛的内在优点,如高灵敏度,低成本,快速分析和可能成为黄金标准临床检测AFP。但是他们有可怜的检测极限,患非特异性结合,不适合高通量分析6,7]。最近,电流型免疫传感器的夹层法新社吸引了大量关注的基于信号放大策略大大提高灵敏度。为了构建的免疫传感器,近年来,随着纳米技术的发展,各种纳米粒子,如金纳米粒子(Au NPs)已经应用的标签可以显著提高电化学免疫传感器的信号强度。同时,全氟磺酸作为导电聚合物通常是采用传感器捕捉大量的非盟NPs平台。形成nanofunctionalized接口可以提供一个有效的抗体固定矩阵具有良好的稳定性和生物活性8- - - - - -11]。

酶放大是一种常用的信号放大系统三明治免疫测定(12- - - - - -15]。Nanozirconium二氧化碳(nano-ZrO₂),作为一种路易斯酸,可以直接用来解决抗体和酶结合羧酸(12,13)的蛋白质分子磷酸组(14)(如刘易斯强碱)的DNA。因为抗体和酶固定化nano-ZrO₂表面积大,总量显著增加,可以长时间保持生物活性15]。能具体地结合ZrO DNA₂(10),但如果DNA直接用于修复ZrO₂调查,这将是非常困难的分离的抗体探针从自由悬挂共存。近年来,nanoferromagnetic探针nanoferromagnetic氧化物(如铁做的₃O₄)材料开发;他们可以控制独立的外磁场下的反应。该方法方便、简单、快速和彻底,吸引了越来越多研究人员的关注15]。我们组有合成铁₃O₄(核)/ ZrO₂(壳)磁性纳米探针(ZMPs),非常适合建设这样的磁探针(16,17]。DNA, DNA-linked长链分子,包含很多磷酸基,可以解决几个HRP-enzyme-labeled法新社抗体的磁珠,在同等条件下,电流响应与增量酶的浓度增加。

三明治,一种新型电化学免疫传感器的nanomagnetic探针是捏造的。自组装全氟磺酸/非盟NPs膜之间的强相互作用形成了全球教育运动和电解质表面。单克隆鼠标反法新社共价固定化在电极,作为捕获抗体。特别是与法新社的交互示例解决方案后,免疫传感器是孵化DNA-labeled ZMPs / HRP-AFP Ab₂抗体允许形成一个夹在复杂的捕获antibody-AFP-DNA / (ZMPs / HRP-AFP Ab₂)_n。然后,合酶在电极表面富集可以催化o-phenylene-diamine过氧化(门诊部当)氧化乙内酰脲(CP)产生一个放大还原峰通过电子转换反应。当前的反应是直接关系到人类法新社分析物的浓度。免疫传感器电极的制备和检测原理如图1。

2。实验

2.1。试剂和化学物质

O-phenylenediamine过氧化(门诊部当)和乙内酰脲(CP)是购自上海晶纯试剂有限公司有限公司铁₃O₄/ ZrO₂磁性粒子是由我们。Ab(法新社AFP单克隆抗体的解决方案₁从σ)和法新社ELISA试剂盒获得公司,ELISA试剂盒包含法新社标准溶液和HRP-labeled AFP单克隆抗体(HRP-AFP Ab₂)。小牛胸腺DNA和牛血清白蛋白(BSA)从奥尔德里奇,购买美国。其他试剂均为分析纯。重蒸馏的水被用于所有实验。

2.2。装置

循环伏安法(CV)测量使用chi - 660 b进行电化学工作站(上海CH仪器有限公司,中国)。简历实验进行传统three-compartment电化学电池含有铂丝为辅助电极和Ag / AgCl(饱和氯化钾)作为参比电极。裸露或修饰玻碳电极(GCE),毫米)作为工作电极。透射电子显微镜(TEM)获得的图像使用h - 7650型(日本日立公司)。此外,本文中使用的设备包括S2 RANGER x射线荧光光谱仪(力量、德国),st - 360微型板块读者(上海科学生物技术),钕铁硼磁铁(杭州磁铁设备有限公司,中国),和超纯水计(密理博公司,美国)。

2.3。ZMPs和DNA的合成和表征/ (ZMPs / HRP-AFP Ab)_n探针

首先,nano-Fe₃O₄粒子合成的方法根据先前的协议(共同沉淀21]。然后,纳米铁₃O₄/ ZrO₂(ZMPs)磁性粒子被覆盖了铁₃O₄磁性粒子与nano-ZrO₂。透射电子显微镜(TEM图2(一个))的铁₃O₄/ ZrO₂显示,其结构是核壳型:铁₃O₄核(黑)和ZrO吗₂(白色)壳。铁的平均大小₃O₄/ ZrO₂(ZMP)磁性粒子为18.2 nm electromicroscope转移。铁的x射线衍射(XRD)图₃O₄/ ZrO₂显示有两个特征峰的铁₃O₄(2θ= 72.7°)和ZrO₂(2θ= 21.4°)晶体,这表明晶体ZrO₂被包裹在外层的铁吗₃O₄和结晶状态。x射线荧光光谱(光谱仪)ZMP Zr-K_β(17.4 keV), Zr-K_α(15.7 keV), Zr-L_β(2.12克),Zr-L_α(2.03 keV), Fe-K_β(7.21 KeV), Fe-K_α(6.35 keV)峰值,表明铁、锆同时存在于这磁粉。法新社Ab₂加入5毫升2毫克/毫升ZMPs解决方案,我们将该混合物不断搅拌12 h。在肠道anti-AFP2消除了磁分离和清洗,反复几次。此外,300 ng / mL合用于块ZMPs未覆盖的和非特异性的网站。它的TEM(图2 (b))表明,ZMPs表面涂有一层抗体和合。当1毫克/毫升DNA ZMPs-HRP-AFP Ab₂形成了nanochain探针(DNA / (ZMPs-HRP-AFP Ab₂)_n),它的TEM(图2 (c))显示,有许多ZMP粒子标记DNA链。探测器被吸引铁吸收时,表明它可以移动磁场(图2 (d))。

2.4。免疫传感器的制备

免疫传感器是捏造的,根据文献[特征6]。AuNPs /法新社Ab₁(20μg / mL)固定化(吸附)GCE上电极/电解质。50μL AuNPs /法新社Ab₁解决方案是传播到清洁、抛光GCE电极,电极在4°C的环境。孵化后,电极与蒸馏水冲洗和电极被2% BSA + 0.05%在室温下渐变为30分钟。电极再次与蒸馏水冲洗,删除任何剩余工资。AuNPs / Ab₁5电极被孵化μL(法新社抗原在室温下为30分钟。抗原结合后,电极在50孵化μ5毫克/毫升DNA / L (HRP-AFP Ab₂)_n磁探测器。最后,电极被去除的共轭。

3所示。结果与讨论

3.1。电化学免疫传感器的特性

采用电化学阻抗谱研究电极的修改过程。如图3裸GCE显示一个相对较小的电子转换阻力Ret电解质后(曲线)。/纳米金薄膜电极上形成,一个较小的Ret观察曲线(b),这意味着nano-Au具有较高的导电性可以大大减少Ret和电极之间的电子转移和促进表面。在法新社Ab₁抗原,Ab₂,HRP-labeled Ab₂,probe-labeled Ab₂都可以抵抗氧化还原探针的电子转移动力学在电极界面,观察阻抗的增加趋势在逐步附件(曲线c, d, e),证实了这些物质在电极表面的固定。

3.2。电化学免疫传感器的行为

全球教育运动/ Nafion-Au NPs /法新社Ab₁(图4(一)电极没有氧化还原峰之间的空白PBS−0.6 V和0.6 V。当5更易与L / L CP和1更易门诊部当被添加到解决方案,修改后的电极(图4(b))有一对氧化还原(100 V / s)−0.475 V和−0.545 V。图4(d)的简历曲线显示在回应法新社获得的免疫传感器。在法新社的存在,不同的催化还原峰观察(减少门诊部当电流明显增加,而其氧化电流减少)。在控制实验,BSA是用来代替法新社,简历中没有明显的峰值电流曲线(图4(c)),表明免疫传感器对法新社高度的选择性检测。

3.3。免疫传感器的光学测量方法进行优化

很重要的是,大量的捕捉法新社抗体固定到ZMPs可以发挥关键作用的分析特征有关的线性范围和免疫测定的灵敏度。法新社Ab的数量的影响₁抗体是由固定的评价,在每一个实验中,50μ不同法新社Ab的L₁解决方案在0-35准备μ克/毫升浓度范围从事这项研究。研究显示,第一峰值电流对门诊部当与固定化法新社Ab急剧上升₁浓度达到20μ克/毫升。较大的抗体载荷下降伏安法产生的信号。

合的浓度固定在ZMPs免疫传感器的性能是至关重要的,因为它可以催化还原电流与CP门诊部当。合的浓度的影响进行了研究。如图5(一个)合,增加(从100、200、300、400和500 ng / mL),增加OD响应信号。当浓度达到300 ng / mL, OD值变得稳定,表明合已经达到饱和吸附量ZMPs表面。

pH值的影响在4.8和8.5之间的绑定反应研究相同浓度的法新社(50 ng / mL)在PBS缓冲溶液5更易与L / L CP和1更易门诊部当。电容的变化从4.8到7.00的pH值的增加而增加,然后随着pH值的增加进一步下降。这一结果表明,电容信号的最大变化发生在pH值为7.00(图5 (b))。因此,pH值7.00绑定PBS作为缓冲的反应。质子的比例参与电极反应的电子转移反应是1:1。门诊部当电极反应的过程是一个double-electron过程(18- - - - - -20.,22- - - - - -24),也就是与门诊部当氧化还原的数量。孵化温度(图5 (c)在催化电流)和时间。我们发现免疫传感器在室温下具有良好的电流响应信号。所以所有的实验都是在室温下完成。APF Ab的培养时间₂与功能化DNA / ZMPs也优化,结果显示最大值为45分钟。因此,pH值7.0的最佳实验条件,在室温下反应检测了45分钟。

3.4。法新社在真正的血清样本的检测

在最优条件下,氧化峰电流的第一项免疫传感器可以用作定量测量的AFP浓度。图6(一)描绘了第一信号响应的电化学免疫传感器对人类不同浓度的法新社。这是观察到的传感器给增加信号AFP浓度增加。如图的插图所示6 (b),发达免疫传感器给当前反应线性相关(法新社)浓度在范围从0.01 ng / mL 200 ng / mL的检出限4 pg / mL,都堪比甚至比之前报道(表1)。

3.5。免疫传感器的精度、再现性和稳定性

15 ng / mL和25 ng / mL法新社被免疫传感器分别测量4次准备在不同的时间和不同的批次。组,获得的变异系数分别为2.3%和2.2%。这表明,免疫传感器具有良好的重复做准备。该传感器可以存储在pH值6.5 PBS为45天(4°C),和它的信号没有明显变化(< 5%),表明传感器具有良好的贮存稳定性。可以刷新使用更新电极,测量结果的100 ng / mL和15 ng / mL法新社样本,分别99.3和15.7 ng / mL和相对标准偏差分别是3.1%和3.2%。它表明传感器具有良好的可重复性做准备。

3.6。再现性和干扰

再生传感器可以多次重复使用,节省时间和金钱。因为法新社和固定化法新社抗体之间的交互是通过静电力(24可以删除),法新社从电极表面通过使用再生解决方案。我们发现,在pH值2.50 50更易与L glycine-HCl缓冲区,大部分的法新社可以有效地从法新社Ab中删除₁表面上的电极。但是我们仍然发现一些法新社Ab₁表面上仍被法新社占领后的再生步骤,因为减少10%和15%之间的电流信号。然而,如果一个额外的垂直磁场(0.3吨)增加了表面的电极在电解池,然后,冲洗电极在相同的缓冲区,再生电极可以完全再生。它的检测信号可以完全康复了。这可能是由于DNA / ZMPs探针的超顺磁性,可以帮助去除法新社AFP抗原Ab₁通过磁力在电极表面。更新电极可以用来做一些检测,100 ng / mL的测量结果和15 ng / mL法新社样本,分别为99.3和15.7纳克/毫升,相对标准偏差分别为2.4%和3.2%。结果表明,电极可以重用具有良好再现性的45倍标准偏差低于3.4%。

物质的影响可能会干扰生物传感器的响应系统也进行了研究。这表明,当法新社的浓度是5 ng / mL,传感器的信号的变化主要的干扰,如10倍癌胚抗原(CEA)和乙型肝炎病毒(HBV)在血清,牛血清白蛋白的200倍,(BSA)、葡萄糖、尿酸、Na的800倍⁺、铁^{2 +}、铁^{3 +}、锌^{2 +},Ca^{2 +}都小于5%,表明该传感器可以有效地抵抗人类血清的主要干扰。

3.7。免疫传感器的应用在人类血清检测AFP

如表所示2,在人类血清AFP水平是取决于这个方法。在分析血清稀释约50 ~ 100倍减少基体效应。经济复苏在95%和105%之间。这种技术可以应用的定量分析在人类血清CEA的数量。

4所示。结论

免疫测定,根据高度特定antibody-antigen识别,可用于敏感定量检测AFP。极大地增强了敏感性依赖双信号放大方案:(1)ZMPs enzyme-loading载体可以加载很多每个ZMP合酶分子。因为DNA可以结合许多ZMP,标签协议允许多个信号/绑定纳米链,(2)电解质/纳米金膜可以提供高密度的主要抗体,因为他们的高表面积,和(3)探针可用于分离、富集和检测。检测后,它可以从外部磁场的电极表面的免疫传感器的表面更新。描述方法与工艺重现性显示为可接受的检测。是有用的临床检测超人类血清肿瘤标记物水平。

确认

作者感谢的支持中国的国家自然科学基金(20805024)和广东的科技项目,浙江省和宁波市(2010 a030300006;2009年2011 c23126 2011 a610018 r50025和2011 c50038)。

引用

1. YZ。张,肯塔基州。张,HY。妈,“电化学DNA生物传感器基于金纳米粒子/半胱胺/聚(谷氨酸)修饰电极,”点。j .生物医学。科学。,1卷,不。2、115 - 125年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 诉Wiwanitkit,”阿尔法胎蛋白在人群筛查肝癌与病毒性肝炎B:泰国的评估报告,“亚洲太平洋癌症预防杂志》上》第六卷,没有。4、535 - 536年,2005页。视图:谷歌学术搜索
3. HX。Chang y元,问。施,YF。关,“基于导电聚苯胺纳米管阵列电化学DNA生物传感器,”肛门化学,卷79,不。13日,5111 - 5115年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. y . x, y秦,w . b . Chang和y z,“应用程序模拟酶的酶免疫分析法α1-fetoprotein。”分析Chimica学报,卷300,不。2、273 - 276年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. e . s . Lianidou loannou p . c, e . Sacharidou“同步扫描二阶导数荧光光谱法作为敏感检测技术在免疫测定。应用程序的决心α胎蛋白”,分析Chimica学报,卷290,不。1 - 2、159 - 165年,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. d·杜·l·王,y邵,j . Wang m·h·恩格尔哈德和y林,“功能化石墨烯氧化物作为酶标记nanocarrier放大策略磷酸化p53的超灵敏的电化学免疫分析法(s392)”分析化学,卷83,不。3、746 - 752年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 问:魏,z, j . et al .,“Dumbbell-like Au-Fe₃O₄纳米粒子作为电化学免疫传感器的制备,标签”生物传感器和生物电子学,26卷,不。2、627 - 631年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. x q, r .元,y .问:柴,c . l .香港和x钱,”一个敏感电流型免疫传感器基于碳纳米管/ DNA的甲胎蛋白/这/ nano-Au修饰玻碳电极,”胶体和表面B,卷79,不。2、421 - 426年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. d·杜z邹,y Shin et al .,“敏感癌症生物标记免疫传感器基于石墨烯的双重信号放大策略表和多酶的功能化碳团簇,”分析化学,卷82,不。7,2989 - 2995年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. v . r . Malhotra Patel, j . p . Vaque j . s .为研究和j . f . Rusling“超灵敏的电化学免疫传感器对口腔癌生物标志物il - 6使用森林碳纳米管电极和multilabel放大,“分析化学,卷82,不。8,3118 - 3123年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. r·崔和j·j·朱”,制造一种新型电化学免疫传感器基于金纳米粒子/胶体碳nanosphere混合材料,”Electrochimica学报,55卷,不。27日,7814 - 7817年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. y胡锦涛和p·w·卡尔,“合成和表征的新zirconia-based高分子阳离子交换固定阶段蛋白质的高效液相色谱法,“分析化学,卷70,不。9日,第1942 - 1934页,1998年。视图:谷歌学术搜索
13. l ., a·v·麦考密克和p·w·卡尔,“polybutadiene-coated研究不可逆吸附的蛋白质氧化锆,”杂志的色谱,卷658,不。2、465 - 473年,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. y谢,r .元,和y .问:柴”,中国分析测试中心;HaikouChina。固定的DNA-Hb氧化锆薄膜修饰金电极的制备过氧化氢生物传感器,”化学传感器卷。18日,32-38,2008页。视图:谷歌学术搜索
15. j·l .商x Liu钟,c .粉丝,铃木,g·李,“制造超薄,protein-containing逐层组装和血红蛋白的电化学表征的影片,影片中,“化学信,32卷,不。3、296 - 297年,2003页。视图:谷歌学术搜索
16. 曾问:j . Wang Chen c, b .侯”Magnetic-field-induced单个水晶Fe的增长₃O₄纳米线。”先进材料,16卷,不。2、137 - 140年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. j . Yu和h .居”,安培计的生物传感器基于血红蛋白的过氧化氢禁锢在二氧化钛溶胶-凝胶膜内,“分析Chimica学报,卷486,不。2、209 - 216年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. y z . Wu w·l·徐j·g·侯,n . Gan和t·h·李”,跟踪测定organophosphous农药在蔬菜基于磁富集电感耦合等离子体原子发射光谱法,纳米铁₃O₄@ZrO₂”,中国农药科学》杂志上,2卷,第184 - 178页,2010年。视图:谷歌学术搜索
19. j . j . Wu唐,z .戴“一次性电化学免疫传感器对流动注射免疫测定癌胚抗原,”生物传感器和生物电子学,22卷,不。1,第108 - 102页,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. y吴、陈c和s .刘”Enzyme-functionalized二氧化硅纳米粒子作为若敏感标签,”分析化学,卷81,不。4、1600 - 1607年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j . Yu和h榉”制备多孔二氧化钛溶胶-凝胶法矩阵固定化辣根过氧化物酶的汽相淀积方法,”分析化学,卷74,不。14日,第3583 - 3579页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. s元,r .元,y柴et al .,“夹层电化学发光免疫传感器基于Ru-silica@Au复合纳米粒子标记anti-AFP,”Talanta,卷82,不。4、1468 - 1471年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. c . Ou r .元,y柴,m . Tang r·柴和x他,“一种新型的电流型免疫传感器基于逐层组装的黄金nanoparticles-multi-walled碳nanotubes-thionine多层聚电解质表面的电影,”分析Chimica学报,卷603,不。2、205 - 213年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. z . p . Aguilar w·r·Vandaveer和弗里奇,“独立的微型电化学免疫分析法对小卷使用老鼠免疫球蛋白作为模型系统,”分析化学,卷74,不。14日,第3329 - 3321页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2011宁甘等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。