挥发性成分的分离姜黄根茎的制备气相色谱法

摘要

建立了一种制备气相色谱法(pGC)从甲醇提取物中分离挥发性成分姜黄粉末。化合物在填充10% OV-101 (3 m × 6 mm，内径)的不锈钢柱上分离，然后将流出液分成两种气体流。百分之一的废水进入火焰离子化检测器(FID)进行检测，其余99%直接进入馏分收集器。从甲醇提取物中提取了5种挥发性化合物姜黄经83次单次注射(20 uL)，收率为5.1 ~ 46.2 mg。所得化合物的结构鉴定为β-榄香烯、curzerene、curzerenone、curcumenol和curcumenone的质谱和核磁共振波谱。

1.介绍

精油是具有多种药理活动的最有价值的天然产品之一。在中药（CMS）中，记录在中文药典（2005年版）中，草药含有大约20％的草药，含有精油通常被认为是生物活性分数。然而，参考化合物或化学标准是瓶颈，用于含有挥发性化合物作为其主要活性级分的CMS的质量控制。因此，有必要将纯活性化学品分离和纯化用作参考化合物的纯活性化学品。然而，参考化合物的供应远非关于CMS质量控制的要求。特别是，由于其不稳定性和低极性，纯挥发性化学化合物甚至更难以获得，这阻碍了TCMS的质量控制的发展。因此，这些问题损害了中药的价值，甚至危害消费者的安全。

Ezhu，是常用的中药之一，是三种干燥的根茎姜黄,包括姜黄phaeocaulis，c . kwangsiensis,C. Wenyujin.，根据中国药典[1］.目前，香精油Ezhu被认为是具有抗肿瘤作用的活性组分[2，3.]及抗病毒活动[4，5］.到目前为止,β-榄香烯、莪术烯、呋喃二烯、莪术醇、异莪术烯、吉马隆、呋喃二烯、莪术酮、莪术烯醇、新莪术酮、莪术酮被认为是莪术中主要的活性挥发性成分Ezhu［6- - - - - -8］.实际上，化合物来自Ezhu多采用硅胶柱层析法制备[6- - - - - -8，但这种经典的分离技术对复杂样品的分辨率不够，需要耗时的多步骤分离，且化合物有丢失、改变或污染的风险[9］.

制备型气相色谱(pGC)是一种强大的挥发性和半挥发性化合物的纯化技术[10]，该方法已成功应用于若干相当特殊的应用，例如分离大量的精油微量成分，以作感官评估[11]，分离异构体[12),同位素(13和对映体[14- - - - - -17从复杂混合物。此外，许多植物挥发油中含有丰富的挥发性成分，非常适合用pGC法分离[9，18- - - - - -25］.在本研究中，建立了pGC体系，并将其应用于毫克级挥发性成分的分离Ezhu，并通过质谱和核磁共振谱确定了化合物的结构。

2.材料和方法

2．1．材料

粉末的姜黄是购买的Wanhe2009年11月在中国重庆沙坪坝药业有限公司上市。甲醇，乙酸乙酯，石油和n-丁醇购于中国重庆川东化工有限公司。60-100目硅胶柱层析购自青岛海洋化工厂(中国山东)分公司。代金券标本姜黄重庆大学化学化工学院药学系，重庆，中国。

2．2.样品制备

采用AS3120A超声波清洗机(天津自动化科学仪器有限公司，天津，中国)进行超声提取。简而言之，干燥的材料Ezhu被研磨成直径0.2-0.3毫米的粉末。粉末Ezhu(100 g)在甲醇(200 mL)中浸泡24 h，然后放入超声槽提取15分钟(120 W)。将得到的甲醇提取物加到硅胶柱(3 × 45 cm)上，用乙酸乙酯和石油混合溶液(比例1:1)洗涤，收集出水冷凝后注入pGC系统。

2．3.热解色谱系统

pGC系统是在中国重庆川一分析仪有限公司SC-2000气相仪的基础上进行改进的，如图所示1．It is equipped with a stainless steel column packed with 10% OV-101 (3 m × 6 mm, i.d.), a flame ionization detector (FID), a special effluent splitter with minimum dead volume, and a home-made preparative fraction collector. The data was collected and analyzed on a HW-2000 Chromatographic Workstation (Nanjing Qianpu Software Co. Ltd., China).

高纯度氮(N₂)作为载气，流速为30 mL/min。入口温度220℃，FID温度220℃。将柱温设置为180℃，然后程序设置为3℃min⁻¹至250°C，保持10分钟。使用一种特殊的气体流出分配器将流出物分成两流，一流(1%)流向FID，另一流(99%)流向馏分收集器。采用两个限流阀控制分流流。为了给FID检测提供足够的气体流量，补充气体(N₂， 10 mL/min)。20卷μ.lEzhu注射精油。经色谱柱分离后，用2 mL醋酸乙酯捕集器收集。捕获时间和峰值保留时间是同步的。在相同的气相色谱条件下，采用气相色谱-质谱联用技术对分离得到的组分进行分析。

２.４.gc - ms分析

GC- ms由Trace GC Ultra气相色谱仪器与DSQ II质谱联用仪和Xcalibur Version 2.0.7软件(Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA)进行。毛细管柱(30 m × 0.25 mm i.d)涂以0.25μ.采用5%苯基甲基硅氧烷M膜进行分离。载气采用高纯氦气，流速为1.0 mL/min。其他气相色谱条件如下:入口方式和温度在190°C无脉冲分裂;将柱温设置为60℃，并保持2分钟注射，然后编程为5℃min⁻¹至145°C，在145°C温度下保持25分钟，然后在5°C min⁻¹至200°C，最后在20°C min⁻¹至280°C，并在280°C的温度下保持3min。

采用电子冲击(EI)模式，扫描范围为40 ~ 550 amu，电离能为70 eV，每次扫描速率为0.34 s。四极、电离源温度分别为150°C和280°C。

3.结果与讨论

3.1。恢复PGC.

采用5 × 10的进样回收率进行测定μ.ln以-丁醇和甲醇为捕集溶剂。收益金额n-丁醇的计算依据是n-丁醇制甲醇()注入甲醇和n-丁醇混合溶剂(比例1:1)在相同条件下。最后，一共40个μ.ln回收百分比的回收率为80％。

3.2。用PGC分离来自Ezhu的挥发性化合物

气相色谱图Ezhu用pGC和FID检测记录的甲醇提取物如图所示2．将其作为收集5个组分的基础，通过分析GC和GC- ms系统进行分析，以评价制备GC的分辨率和收率。

填充柱分析气相色谱图Ezhu挥发油和收集到的馏分，以及收集到的各馏分的峰的质谱如图所示2．

3．3.收集馏分的鉴定和得率

五个分数Ezhu采用制备气相色谱法，共83次重复进样，各捕集器中化合物含量为5.1 ~ 46.2 mg。F1-F5的含量分别为5.1 mg、6.6 mg、41.6 mg、46.2 mg和21.2 mg。

5个组分经MS鉴定(表1），¹H和¹³C NMR谱图(见附录)的各个峰，馏分1-5被鉴定为β-榄香烯、curzerene、curzerenone、curcumenol和curcumenone(图3.）.

4.结论

制备气相色谱柱为3 m × 6 mm尖柱，使用FID、出水分离器和馏分收集器，可获得较好的分离、产率和回收率Ezhu获得纯挥发性成分在毫克水平。制备气相色谱和分析气相色谱的结合使用相同的色谱柱和色谱条件，可以直接转移保留时间，便于馏分的鉴定。以上结果表明，制备型气相色谱法非常适合从挥发油中获得少量纯化合物。因此，在挥发油的分离和目标化合物的得率方面，应发展制备型气相色谱。

附录

核磁共振数据的β-elemene, curzerene, curzerenone, curcumenol, and curcumenone，经AV400 NMR (Bruker, Switzerland)分析，溶剂:CDCl_3.，内部标准：TMS。

（1）β-elemene [26］
¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）（1小时，dd，J= 10.5, 17.9 Hz, H-13)， 4.87-4.91 (2H，米, H-14Z和H-8Z), 4.82 (1 h,t，J= 1.6 Hz，H-8E), 4.58 (1 h,年代, H-11Z), 4.56 (1 h,年代, H-11E), 3.57 (1 h,d，J= 10.9 Hz, H-14E), 1.95 (1 h,dd，J= 3.7, 12.3 Hz, H-5)， 1.68 (3H，年代， h-12)， 16.7-1.70 (1h，米， h-3)， 1.32-1.60 (6h，米， H-1， -4和-6)，1.13 (3H，年代， h-9)， 0.98 (3h，年代，H-15）。
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl_3.）(颈- 1),39.8 (c - 2), 52.7(颈),32.9 (c - 4), 45.7 (c - 5), 26.8(其他),150.2(即),108.1 (8),24.7 (C-9), 147.5 (C-10), 109.7 (C-11), 21.0(技术),150.1 (c13), 112.0(碳14),16.7 (C-15)。

(2) Curzerene [27］
¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）（1小时，brs， h-8)， 5.89 (1h，dd，J= 10.8,17.0Hz，H-12），5.02（1小时，dd，J= 1.0, 17.0 Hz, H-13Z), 4.98 (1 h,dd，J= 10.8, 17.0 Hz, H-13E), 4.88 (1 h,d，J= 1.2 Hz, H-10E), 4.77 (1 h,d，J= 1.2 Hz, H-10Z), 2.69 (1 h,d，J= 1.5 Hz, H-1β), 2.43 (2 h,dd，J= 1.1, 1.5 Hz, H-4α和H-4β), 2.31 (1 h,t，J= 1.5Hz，H-3），1.94（3h，年代， h-14)， 1.76 (3h，年代，H-11），1.08（3h，年代，H-15）。
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl_3.）(颈- 1),40.1 (c - 2), 50.0(颈),24.2 (c - 4), 116.5 (c - 5), 149.5(其他),119.3(即),137.2 (8),147.2 (C-9), 112.7 (C-10), 24.4 (C-11), 147.1(技术),110.9 (c13), 8.1(碳14),19.5 (C-15)。

(3)莪术酮(28］
¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）（1小时，brs， h-11)， 5.81 (1h，brs， h-5)， 5.18 (1h，t，J= 7.5Hz，H-1），3.72（2h，AB-system，J= 15hz, H-9a, H-9b)， 2.20 (3H，d，J= 1.5 Hz, H-13)， 1.76 (3H，d，J= 1.5 Hz, H-14)， 1.31 (3H，年代1.60-2.48 (4h，米H-2和H-3)。
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl_3.）(颈- 1),26.4 (c - 2), 41.6(颈),145.7 (c - 4), 132.4 (c - 5), 189.7(其他),122.2(即),156.5 (8),40.6 (C-9), 135.4 (C-10), 138.1 (C-11), 123.7(技术),9.5 (c13), 18.9(碳14),15.7 (C-15)。

(4)莪术醇(29］
¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）（1小时，年代， h-9)， 3.05 (1h，dd，J= 1.2, 2.1 Hz, H-1)， 2.65 (1H，d，J= 15.6 Hz，H-6β), 2.10 (1 h,d，J= 15.6 Hz，H-6α), 1.66 - -1.97 (6 h,米， H-1, H-2, H-3和H-4) 1.81 (3H，年代， h-12)， 1.66 (3h，年代， h-13)， 1.66 (3h，年代， h-14)， 1.03 (3h，d，J= 6.2 Hz, H-15)。
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl_3.）(颈- 1),27.6 (c - 2), 31.2(颈),40.3 (c - 4), 85.4 (c - 5), 37.2(其他),137.3(即),101.5 (8),125.8 (C-9), 137.3 (C-10), 122.1 (C-11), 18.9(技术),22.9 (c13), 21.4(碳14),11.8 (C-15)。

(5) Curcumenone [30.］
¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）(2 h,米， h-7)， 2.55 (1h，d，J= 15.6 Hz, H-10β或H-10α), 2.51 (1 h,d，J= 15.6 Hz, H-10β或H-10α), 2.47 (2 h,t，J= 7.3 Hz, H-4)， 2.13 (3H，年代， h-15)， 2.09 (3h，年代， h-12)， 1.79 (3h，年代， h-13)， 1.60 (2h，t，J= 7.3 Hz, H-3)， 1.12 (3H，年代， h-14)， 0.67 (1h，问，J= 4.4 Hz, H-6)， 0.45 (1H，dt，J= 7.3, 4.4 Hz, H-2)。
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl_3.）(颈- 1),30.0 (c - 2), 24.1(颈),43.9 (c - 4), 208.7 (c - 5), 24.3(其他),28.0(即),128.0 (8),201.6 (C-9), 48.9 (C-10), 147.4 (C-11), 23.4(技术),23.4 (c13), 19.0(碳14),23.2 (C-15)。

承认

国家科学技术委员会自然科学基金项目(no。2010 bb5070)。

参考

1. 中华人民共和国药典委员会，中华人民共和国药典，化学工业出版社，北京，第1版，2000。
2. 蒋剑平，“抗肿瘤活性Ezhu”,吉林中医药第33卷第3期2，页62-64,2000。视图:谷歌学者
3. 聂晓红，奥治国，尹光玉，陶文银，“提取工艺对中药成分及抗肿瘤活性的影响在体外挥发油的姜黄wenyujin”,医药生物技术，第10卷，第5期。3，页152-154,2003。视图:谷歌学者
4. “莪术油对流感病毒和呼吸道合胞病毒的抗病毒作用的实验研究”，中国药理学通报，第20卷，第2期。3, 2004。视图:谷歌学者
5. 明强，孙芳，刘建文等，“莪术油对呼吸道病毒感染的有效抑制浓度”，中国老年学杂志， 2004年第24卷，第267-268页。视图:谷歌学者
6. 杨福强，李世平，赵军，刘世昌，王玉涛，“基于色谱-质谱法同时测定三种植物中9种倍半萜类化合物的研究姜黄根状茎”,医药与生物医学分析杂志号，第43卷。1，页73-82,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. 杨凤琴，李淑萍，陈元元等，“三种植物中11种倍半萜的鉴定与定量姜黄根状茎的加压液体萃取和气相色谱-质谱分析"医药与生物医学分析杂志第39卷第3期3-4，页552-558,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. 杨凤琴，王玉堂，李树平，“三种植物中11种特征成分的同时测定姜黄采用加压液体萃取和高效液相色谱法提取根状茎色谱学报A，卷。1134，没有。1-2，pp。226-231,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. G. T. Eyres, S. Urban, P. D. Morrison, P. J. Marriott，“微尺度制备多维气相色谱-核磁共振波谱法在原油中纯甲基萘鉴定中的应用”，色谱学报A号，第1215卷1-2，页168-176,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. n .野岛，D. J. Kiemle, F. X. Webster, W. L. Roelofs，《挥发性化学物质的亚微尺度核磁共振样品制备》，化学生态学杂志，第30卷，第2期11, pp. 2153-2161, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. r·p·w·斯科特，气相色谱法， Chrom-Ed Book Series, 2011，http://www.library4science.com．
12. C. Meinert, M. Moeder，和W. Brack，“制备毛细管气相色谱法分离技术对壬基酚”，光化层，第70卷，第2期2，页215-223,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. H. Holmstrand, M. Mandalakis, Z. Zencak, O Gustafsson，和P. Andersson，“制备巨型柱毛细管气相色谱中半挥发性有机氯化合物的氯同位素分馏，”色谱学报A，第1103卷，编号1，页133-138,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. D. U. Staerk, a . Shitangkoon, G. Vigh，“用环糊精为基础的固定相制备气相色谱分离2-氯丙酸甲酯对映体”，色谱学报A，第702卷，第702号1-2，页251-257,1995。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. A. Shitangkoon, D. U. Staerk，和G. Vigh，“用衍生化环糊精固定相气相色谱分离挥发性氟醚麻醉剂的对映体。我。”色谱学报A，第657卷，第2期2，第387-394页，1993。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. D. U. Staerk, A. Shitangkoon，和G. Vigh，“用衍生化环糊精分离挥发性氟醚麻醉剂的对映体”。2异氟烷的制备级分离，”色谱学报A，第663卷，第2期1，第79-85页，1994。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. D. U. Staerk, A. Shitangkoon，和G. Vigh，“用衍生化环糊精分离挥发性氟醚麻醉剂的对映体”。3安氟醚的制备级分离，”色谱学报A，第677卷，第2期。1，页133-140,1994。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. Y. Saritas, M. M. Sonwa, H. Iznaguen, W. A. König, H. Muhle，和R. muues，“苔藓(Musci)的挥发性成分”，植物化学(第57卷)3，页443-457,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. A. M. Adio, C. Paul, W. A. König, H. Muhle，“欧洲叶苔(Marsupella emarginata, M. aquatica和M. alpina)挥发性成分的研究”，植物化学第61卷第1期1，第79-91页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. R. Lu, C. Paul, S. Basar, W. A. König, T. Hashimoto, Y. Asakawa，“从苔类植物中提取倍半萜的成分Bazzania粳稻”,植物化学，第63卷，第2期5，页581-587,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. A. M. Adio, C. Paul, W. A. König, H. Muhle，《苔类植物的挥发性成分》Tritomaria polita”,植物化学号，第64卷。2，页637-644,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. A. T. Kreipl和W. A. König，“来自东非檀香的倍半萜Osyris tenuifolia”,植物化学，第65卷，第5期14，第2045-2049页，2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. H. Tesso和W. A. König，“萜烯Otostegia integrifolia”,植物化学，第65卷，第5期14, pp. 2057-2062, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. G. T. Eyres, S. Urban, P. D. Morrison, J. P. Dufour, and P. J. Marriott，“基于核磁共振波谱微尺度制备多维气相色谱分离的小分子发现方法”，分析化学，第80卷，第2期。16，第6293-6299页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. C. Rühle, G. T. Eyres, S. Urban, J. P. Dufour, P. D. Morrison, P. J. Marriott，“通过质谱和核磁共振波谱表征的制备多维气相色谱中的多组分分离”，色谱学报A号，第1216卷30, pp. 5740-5747, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. R. W. Dunlop和R. J. Wells，“从软珊瑚的叶状植物属分离一些新的二萜”，澳大利亚化学杂志，第32卷，第2期第6页，1345-1351页，1979年。视图:谷歌学者
27. H. Hikino, K. Agatsuma, C. Konno, T. Takemoto，《呋喃二烯和异呋喃大麦香烯的结构》，化学及药剂通讯第18卷第2期4，第752-755页，1970。视图:谷歌学者
28. A. Dekebo, E. Dagne, L. K. Hansen, O. R. Gautun, and A. J. Aasen，“两个呋喃二萜类化合物的晶体结构没药sphaerocarpa”,四面体的信号，第41卷。50, pp. 9875-9878, 2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. K. Firman, T. Kinoshita, A. Itai, U. Sankawa， "萜类化合物来自姜黄heyneana”,植物化学第27卷第2期12，页3887-3891,1988。视图:谷歌学者
30. M. Kuroyanagi, A. Ueno, K. Ujiie, S. Sato， "倍半萜的结构姜黄aromaticaSALISB。”化学及药剂通讯第35期1，页53-59,1987。视图:谷歌学者

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