扩展范围β-内酰胺酶(ESBL)基因型与多药耐药尿病的关系大肠杆菌尼泊尔一家教学医院的临床分离物

摘要

尿路感染（UTI）代表尼泊尔医疗中心门诊诊所的患者中最常见的细菌感染。然而，通过与扩展频谱相关的多药抗性尿换蛋糖的出现和扩散来复合这种感染的治疗β-lactamases (ESBLs)。在本研究中，我们旨在调查临床尿源性分离株的耐药性负担和ESBL基因的发生大肠杆菌在尼泊尔的一家三级护理教学医院在研究期间，我们共处理了1626份尿路标本，分离了重要的病原菌，并调查了它们的抗菌药物敏感性。大肠杆菌（N= 154)，通过常规表型和分子方法进一步研究了与UTI相关的主要病原ESBL酶的存在。在泌尿道感染的疑似病例中，我们发现15.2%的患者有泌尿道感染，生殖年龄组的女性患者受影响更大( ).大肠杆菌154,62.1%是主要的泌尿系统病原体，大多数(~ 64.9%)是多药耐药(MDR)。在耐多药大肠杆菌其中40.3%的菌株产生超广谱β-lactamases (ESBLs)。bla-TEM(83.8%),bla-CTX-M（66.1%）及bla-shv.(4.8%)为常见ESBL基因型。呋喃妥因、庆大霉素和亚胺培南是产生esbl最有效的抗生素大肠杆菌隔离。这表明多药耐药率很高大肠杆菌是我们医院常见的尿路感染原因。呋喃妥因和氨基糖苷是治疗UTI最有用的一线药物。我们建议定期调查所有分离菌的耐药性，并在我国制定有效的抗生素处方政策。

1.介绍

尿路感染（UTI）代表各种临床实体，涉及从肾皮层到尿道肉瘤的泌尿系统的任何组织的微生物侵袭[1］.每年，来自所有年龄组的数百万人受到泌尿道感染的影响，发病率、死亡率和医疗费用都很高[2］.此外，它是患者录取医院的患者中最常见的感染之一，是革兰氏阴性菌血症的主要原因之一[3.那4.］.女性是比男性更受影响，约20的妇女经历％至少UTI期间他们的生活时间和复发的插曲是很常见[5.那6.］.因此，准确的诊断和治疗和预防尿路感染（尿路感染）是必要的适当使用抗生素，以减轻负担以及长期的后果[7.］.

参与泌尿道感染的病因因素是多种多样的，最常见的微生物是革兰氏阴性肠杆菌，包括大肠杆菌[8.]. 根据病原体的频率、抗生素敏感性的局部趋势和疾病的严重程度，根据经验使用常规抗生素治疗与这些生物体相关的感染[9.］.然而，抗生素耐药性和高复发率的增加速度大大降低了尿路感染的治疗选择，近年来[10.］.特别值得关注的，肠杆菌科的成员引起尿路感染，包括大肠杆菌和K.肺炎，含有编码扩展光谱的获得性质粒β-lactamases（ESBLS）在全球范围内上升[11.那12.］.这些质粒迅速蔓延到第三代头孢菌素以及其他抗生素[13.那14.］.首次在1983年检测到，在家庭肠杆菌的各种成员和其他污染物的各种成员中鉴定了超过300种ESBL的变体[13.］.在不同的基因型,CTX-M那施那和tem主要在肠杆菌科的临床菌株中被描述，具有更广泛的抗菌素耐药性，包括β-lactams，氟喹诺酮和氨基糖苷[15.］.

早期识别引起临床疾病的产ESBL菌株对于医院的适当治疗和有效感染控制非常重要[11.］.多药抗性尿鼠疗法增加大肠杆菌这些研究大多局限于对耐药细菌的表型描述[16.那17.］.然而，报道描述了esbl产生的分子类型大肠杆菌导致患者中的尿路感染和流行病学主要是未知的。因此，我们知道由ESBL制造引起的泌尿道感染的当地流行病学非常重要大肠杆菌并在我们的环境中调查有用的治疗方案。从这个角度来看，我们旨在确定尿路感染的发病率、细菌病原学以及产ESBL的多药耐药菌株的基因型大肠杆菌在尼泊尔加德满都的一位高等教育保健中心。

2.患者和方法

本研究是在尼泊尔马铃薯纪念教学医院临床实验室服务部进行的六个月（从2017年2月至2017年7月）。在研究期间，从患有尿路感染的临床怀疑的患者中收集了总共1,626个泌尿道标本，并研究了潜在的细菌尿养异常。

3.包含和排除标准

曼莫汉纪念教学医院(MMTH)门诊病人和住院病人的尿路感染标本被纳入研究。泌尿道感染的临床诊断是在有发热和/或任何症状(如排尿疼痛、频率增加、烧灼性排尿和耻骨上疼痛/腰痛)的情况下由各自的单位医生作出的。所有在开始抗菌治疗前无菌采集的尿液标本(中段尿和导管吸入尿)都被纳入研究。但排除了来自同一患者的重复样本和不符合美国微生物学会标准的样本。

4.实验室程序和细菌尿咽癌的鉴定

通过标准微生物方法处理中小期尿液和导管吸食尿样，没有延迟MMTH的细菌学实验室。通过将0.001ml样品（使用校准的线圈）接收到胱氨酸乳糖电解质缺陷（Cled）琼脂上，半定量处理它们，并在有氧气氛中在37℃下将接种的板在37℃下温育24小时。单一生物体的生长计数≥10^5.菌落形成单位(CFU)/mL被认为是感染的代表，并使用适当的常规鉴定方法，包括菌落形态学、革兰氏染色和一套内部生化试验确定生物体[18.］.在所有分离物中，最主要的尿养原，大肠杆菌,进一步筛选出抗菌药物敏感性测定及多药耐药(MDR)和广谱β -内酰胺酶- (ESBL-)产生菌株的检测。

5.抗微生物易感性测试

抗微生物易感性大肠杆菌采用改良Kirby-Bauer纸片扩散法在Mueller-Hinton琼脂(HiMedia Laboratories, India)上测定，采用美国Wayne临床和实验室标准研究所(CLSI)推荐的标准程序[19.］.包括在测试面板抗生素阿莫西林（AMX 10 μ.g） ，庆大霉素（GEN 10 μ.g)、复方新诺明(COT 30μ.g） ，头孢克肟（CFM 5 μ.g)、呋喃妥因(NIT 300μ.克），环丙沙星（CIP 5 μ.g)、头孢噻肟/头孢曲松(CTX/CTR 30)μ.g），头孢他啶（CAZ 30 μ.g)、哌拉西林(PI 100μ.g)、哌拉西林-他唑巴坦(PIT 100/10)μ.克），四环素（TE 30 μ.克），亚胺培南（IMP 30 μ.g)、美罗培南(MEM 30μ.g）（赫雷迪亚实验室，印度）。根据CLSI的区域大小解释标准进行抗生素易感性结果[19.］.大肠杆菌ATCC 25922用作抗生素敏感性的对照菌株。

6.多药耐药（MDR）大肠杆菌和潜在的ESBL生产者

在这项研究中，大肠杆菌对三种常用抗菌药物中至少一种药物耐药的菌株被视为多药耐药(MDR) [20.］.If the zone of inhibition (ZOI) was ≤25 mm for ceftriaxone, ≤22 mm for ceftazidime, and/or ≤27 mm for cefotaxime, the isolate was considered a potential ESBL producer as recommended by the CLSI and further tested by confirmatory methods [19.］.

7.ESBL表型检测的联合纸片试验

通过初始筛选产生推测的ESBL制备分离株，用4-6ml蛋白胨水乳化，以调节含有0.5麦克兰浊度标准的接种物密度。按照CLSI的推荐，组合磁盘测试（CDT）是全部执行的大肠杆菌假定为ESBL产生菌的菌株。在本试验中，头孢噻肟（30 μ.g）单独和与克拉维酸（Cefotaxime +克拉维酸，30/10的组合 μ.g） 将纸片涂在Mueller–Hinton琼脂（MHA）平板上，该平板接种了试验菌株，然后在35℃的环境空气中培养16–18小时 ± 2摄氏度。该分离物显示出≥5. 与单用头孢噻肟纸片相比，联合纸片抑制区内的mm被认为是ESBL产生者[19.］.

8. ESBL基因的分子键入

所有表型的ESBL大肠杆菌对分离菌株进行分子分析以确认ESBL的产生。分子检测大肠杆菌患ESBL基因（bla-CTX-M那bla-TEM,bla-shv.）通过在加德满都基因组学和研究实验室（KCGR1），加德满都，尼泊尔的加德满都中心进行常规聚合酶链反应（PCR）进行。ESBL制造分离株分子检测方法大肠杆菌与我们之前的工作相似[21.］.

9.质粒DNA提取和扩增

提取质粒DNA时，每一个可能产生esbls的单个菌落大肠杆菌被接种到LURIA-BERTANI肉汤中并孵育直到对数状态。使用商业试剂盒（来自Genetix Biotech，Asia）的商业套件（Furespein Plasmid Mini Kit）进行制造商的说明，进行细菌质粒DNA的提取和纯化。将来自细菌分离株的纯化DNA用作模板以检测ESBL基因型：CTX-M那TEM,SHVβ- 酰胺酶基因。用于扩增ESBL基因型的引物（bla-CTX-M那bla-TEM那和bla-SHV)的设计和采购自印度GeNei™，其序列列于表中1。

ESBL基因的聚合酶链式反应 - （PCR-）基于扩增进行如先前描述的方法[22.］.例如，采用多重PCR方法检测质粒基因施和CTX-M，而常规线性PCR用于检测TEM型ESBL基因。扩增反应在一个DNA热循环仪（CG）用下面的热和循环条件进行：初始变性94℃3分钟，变性在94℃的35个循环，退火45秒在60℃下进行30 sec of 35 cycles (forbla-shv.和bla-CTX-M)和55°C 30秒35个循环(用于bla-TEM)， 72°C伸展3分钟，35个循环，最后72°C伸展2分钟。之前确认肺炎克雷伯菌临床分离株具有bla-TEM那bla-shv.,bla-CTX-M基因作为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照。

PCR扩增后2.5μ每个反应的L在1%琼脂糖凝胶中，在1 × TBE缓冲液中，在100 V (10 V/Cm)下电泳30 min。用溴化乙锭(1μg/ml)，并使用UV-transilluminator (Cleaver Scientific Ltd)观察扩增的DNA条带。

10.数据分析

有关患者个人资料的信息和结果被输入到计算机程序中。使用统计包装（SPSS™）版本20.0（IBM，Armonk，NY，USA）进行数据分析，并以百分比基本分配呈现。数据有值小于0.05 (CI 95%)为显著性。

11.结果

11.1。尿路感染患者

出从患者总1626个尿路标本怀疑患有UTI的，248（15.2％）显示出确认尿路感染的至少一种的uropathogen生长显著。女性（166，66.9％）是患者的显著组（ ）uti影响，大多数属于年龄组21 - 30年。UTI的发病率不同于不同年龄组，性别和患者类型（住院患者或门诊）（表2).

11.2。细菌尿膜状原

从1626例疑似尿路感染患者中检出248例细菌尿路病原体。革兰氏阴性菌(82.5%)更为常见大肠杆菌（154,62.1％）残留在所有年龄组中与UTI相关的主要原因。从我们UTI案件中分离的其他病原体是金黄色葡萄球菌（24,9.7％），肺炎克雷伯菌(22, 8.9%),肠球菌粪便器（18,7.3％），假单胞菌铜绿假单胞菌（10,4.0％），和念珠菌白葡萄酒（4,3.2％）。

11.3。抗菌谱的大肠杆菌

抗菌药物的敏感程度不同大肠杆菌隔离。硝基呋喃素（92.2％）和庆大霉素（76.6％）是最有效的尿致病性的一线治疗方案e Coli.隔离。几乎一半的分离物对头孢菌素和氟喹诺酮类药物抵抗力。此外，64.9％（100/154）大肠杆菌被发现多药抗性。组合，约21％的分离物对β-内酰胺，喹诺酮和磺酰胺耐药，12％对β-内酰胺，氨基糖苷类和磺酰胺耐药，9％对β-内酰胺，喹诺酮类和氨基糖苷耐药（数字1， 桌子3.).

11.4. ESBL大肠杆菌

约40.3％（62/154），我们的大肠杆菌分离物被证实为ESBL生产商。

eSBL制作大肠杆菌与非产ESBL的菌株相比，分离株对抗生素的耐药程度明显更高(见表)3.).

11.5。ESBL之间的基因型分布e Coli.

六十二个孤立大肠杆菌经ESBL基因分子分析证实。在ESBL基因型中，bla-TEM（83.8％）更常见，其次是bla-CTX-M（66.1%）及bla-shv.（4.8％）。以上所述的一半（54.8％）产生ESBL的大肠杆菌分离物是Coharboring.bla-TEM和bla-CTX-M(表4.,图2).

12.讨论

尿路感染（UTI）继续成为门诊部患者中的常见临床实体，也代表了尼泊尔医院的常见医院感染之一[6.那16.］.然而，尼泊尔报告的发病率及其流行病学并不一致，不足以揭示病原学谱和抗菌药物敏感性的实际情况[5.那23.-25.］.在基于实验室的研究中，我们检查了通过表型和基因型方法的扩展光谱β-内酰胺酶的产生，导致尿路感染及其抗性感染的生物。据我们所知，该报告代表了来自尼泊尔尿路感染的尿液感染的ESBL产生尿藻素的第一个基因型表征。

与之前在尼泊尔进行的类似研究的报告相比，我们的研究中UTI的总发病率非常低(15.2%)[6.那16.那25.］.在这项研究中发生率较低可能是由于之前使用抗生素和感染，由于生长缓慢的有机体或归因于无法给我们的日常培养基上生长的有机体。此外，更多的门诊中发现尿路感染住院病人比。伴随地，显著更多的女性（66.9％）被发现与UTI，如先前别处描述[5.那6.那25.］.本研究中生殖年龄组女性UTI较高的发生率得到了其他研究的良好支持[5.那26.］.此外，本研究发现老年男性更易患泌尿道感染，可能存在膀胱流出梗阻等慢性共病。

我们观察到，革兰阴性菌是最主要的（81.4％），与我们的UTI病例相关生物和大肠杆菌(62.0%)为主要病原菌。在一些研究中，肠杆菌科的成员已经被很好地描述为UTI的主要病原体。较高的发病率大肠杆菌在我们的研究中发现也类似于以前的研究结果从尼泊尔[16.那17.那25.］.虽然在本研究中孤立了非常低的革兰氏阳性细菌和酵母，但它们也负责uti在各种研究中[6.那27.］.

本研究的主要发现之一是泌尿系致病菌的耐药性。大肠杆菌是主要的泌尿病原体，对常用的治疗药物（β-内酰胺类、磺胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类）高度耐药。154人中大肠杆菌对氨苄西林、哌拉西林、头孢克肟、复方新诺明、氧氟沙星分别耐药89.3%、68.9%、50.4%、49.1%和41.6%。这一发现与Baral等人之前的报告相似[17.]，Neupane等。[28.]和Rijal等人[26.从尼泊尔]。氨苄西林和其他口服头孢菌素在我们的研究中无效，因此在作为经验性治疗前应进行评估。此外，如其他报告所述，对头孢菌素和喹诺酮类药物的分离菌株的敏感性结果显示，它们的耐药性大幅增加[16.那29.］.而呋喃妥因(92.2%)和庆大霉素(76.6%)对尿致病菌有效e Coli.菌株。正如其他人所述，在我们的环境中，这些可以被视为UTI病例的一线治疗方案[24.那26.]. 碳青霉烯类药物，包括亚胺培南和美罗培南，可作为多重耐药和复杂尿路感染的二级治疗[30.］.但是，在近年来，尿液中患有碳癌耐药性的出现进一步使utis的治疗变得复杂[31.］.

在这项研究中，我们发现了很高的比例大肠杆菌（64.9％）分离物是多药抵抗（MDR）。我们对UTI案例的MDR细菌的研究结果与来自世界不同地区的报告兼容，包括尼泊尔[17.那28.那32.那33.］.这些mdr.大肠杆菌菌株在研究医院中很常见，因为我们以前报道过儿科UTI病例中类似的发现[34.］.此外，最常见的MDR模式大肠杆菌分离株对β-内酰胺+喹诺酮+喹啉+磺酰胺（21％），这可能是由于水解酶的产生（β- 酰胺酶）由细菌[30.］.我们的发现表明UUTIS造成的抗生素治疗方案大肠杆菌由于对常用抗生素的耐药性，已受到严重挑战，导致仅依赖某些储备抗生素的情况。

随着时间的推移，MDR和esbl产生的尿致病的发病率和流行病学大肠杆菌不断变化，发展中国家报告的比率较高[30.］.在这项研究中，40.3％的大肠杆菌分离株被发现为ESBL产生菌，患者年龄超过50岁 ESBL发生率较高的年份大肠杆菌。与先前研究的报告的率相比，本研究中的ESBL率非常高[17.那29.］.然而，速率产ESBL肾盂肾炎e Coli.在尼泊尔一直不断上升，最近，Neupane等人（33.2％）和Bhandari等人（38.6％）记录了UTI病例的ESBL生产商增加率[28.那35.］.从国际角度来看，esbl的生产速度相似大肠杆菌还通过从印度耶拿等人，（41.07％）[报道32.， Masud等人(40.9%)来自孟加拉国[36.]，Moore等人（44%），来自柬埔寨[37.]来自土耳其的Kizilca等人（41.4％）[38.］.但是，ESBL产生的尿致病率的速率e Coli.正如其他地方报道的那样，来自发达国家的收入非常低[30.那39.]. 研究中ESBL产生菌株差异的原因可能是当地的抗生素处方做法、广谱抗生素（尤其是第三代头孢菌素）的广泛使用以及当地耐药病原体的地方性。

在旁边，我们观察到ESBL之间的不同基因型e Coli.隔离。在这项研究中，bla-TEM（83.8％）为ESBL之中的最主要的基因型e Coli.最近印度研究的孤立，这是一项很好的支持[32.］.然而bla-CTX-M基因被描述为肠杆菌科中最常见的ESBL基因型[40-42.］.在我们之前的报告中，我们也发现了bla-CTX-M来自各种临床标本的ESBL制造肠杆菌基因的基因[22.］.此外，还注意到了同一生物体中的多种基因，其中bla-TEM+bla-CTX-M(54.8%)是常见的。这些基因通常存在于大质粒上，并伴有对各种抗菌剂产生耐药性的遗传决定因素[43.］.在这项研究中，ESBL-产生的分离物更耐受头孢菌素和氟喹诺酮类。然而，在ESBL引起的UTI的情况下，硝化呋喃素和氨基糖苷被证明是最佳的一线药物e Coli.在我们的研究中。这可能是由于这些药物在我们医院的使用受到限制，而呋喃妥因通常只在泌尿道感染的病例中使用，因为它会以尿液的形式排出并浓缩[29, 30］.碳青霉烯类可用于初级治疗无效的重症UTI病例[30.］.

由ESBL产生的生物引起的感染是全球性问题。细菌种类中含有的流动遗传元素易于转移到附近的其他生物[36.]. 及时检测耐药菌株及其耐药性对于有效管理流行地区的UTI非常重要。然而，发展中国家的检测设施有限，对此类病菌的了解不足，是此类病原体在全球传播的原因[13.那15.］.

13.限制

虽然这是一个横断面研究，我们无法评估的风险因素和患者尿路感染的结果。产ESBL的分子特征大肠杆菌具有详细分析系统发育轮廓的菌株在理解ESBL的流行病学方面更为有用大肠杆菌在我们的设置。此外，测定治疗用抗生素的最低抑菌浓度(MIC)有助于治疗和监测耐药感染。

14.结论

抗菌素耐药性负担高，产esbls的患病率增加大肠杆菌与UTI相关的是本研究的主要发现。ESBL的不同基因型大肠杆菌随着观察到对常见抗生素的抵抗力。发现含氮呋喃素和氨基糖苷作为在我们的环境中UTI的情况下使用的最有用的一线药物。在这种观点来看，常规全国性的细菌病原体的流行病学监测导致UTIS及其抗微生物抗性可用于制定我国的治疗指南。

缩写

ATCC：	美式文化收藏
ASM：	美国微生物学会
e Coli.：	大肠杆菌
CLSI：	临床和实验室标准研究所
ESBL：	Extended-spectrum beta-lactamases
耐多药:	耐药
MHA：	Mueller-Hinton琼脂
CTX-M：	Cefotaximase-Munich
TEM：	Temoniera
施：	Sulfhydryl Variant.
泌尿道感染:	尿路感染。

数据可用性

研究期间产生的所有数据均包含在本手稿中。

伦理批准

这项研究是由曼莫汉纪念健康科学研究所(IRC MMIHS)的机构审查委员会批准的，尼泊尔加德满都。在开始研究工作前，获得批准信(编号:21/MMIHS/2072)。

同意

知情同意是从患者或他们的父母参与研究前服用。关于个人信息和传染病对数据进行编码，并严格保密。此外，同意将这个研究结果的公布，从参与研究的每一位病人服用。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

NPP构思了研究的设计，回顾了文献，并确定了临床病例。RP、SSS和GJ进行了实验室测试。BPR, BKA和NPP监督工作。RP和NPP分析了数据。RP, NPP, BPR准备了手稿。所有作者阅读手稿并批准。

致谢

作者非常感谢Puspa Raj Khanal教授和Sujan Babu Marahatta从MMIHS获得研究工作中的有价值的建议。他们还真诚地感谢所有MMTH患者参与这项研究，特别感谢Sandiep Thapa先生和尼尔姆·塔克·昆瓦议员在分子分析期间从KCGRL担任其支持。

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