毒力因子和扩展频谱Beta-Lactamase生产之间的联系肺炎克雷伯菌而非生产的隔离

文摘

肺炎克雷伯菌被认为是一个重要的机会性病原体耐多药。扩展频谱β-lactamases (ESBLs)和多种毒力因子的表达可能在和谐工作导致治疗失败。本研究进行比较毒性特征和遗传亲缘ESBL和non-ESBL生产之间的关系肺炎。方法。抗生素敏感性测试的隔离是由阀瓣扩散试验。表型和基因型的检测ESBL的完成。各种毒性因素和一些毒性factor-associated基因筛选。随机扩增多态性DNA (RAPD)是用来研究的基因指纹ESBL non-ESBL生产k .肺炎。结果。50%的隔离ESBL生产商。之间未发现重大协会ESBL生产和生物膜(强大而温和的),血清抵抗,和国际空间站基因。此外,重大协会non-ESBL生产者和hypermucoviscosity之间被确认。Dendogram RAPD分析概要文件分类k .肺炎隔离成四个集群(a, b, c, d),百分之七十六的ESBL生产者属于集群。总之,这项研究表明ESBL生产和一些毒力因素之间的相关性。因此,成功的治疗主要依赖增加临床医生意识和增强测试实验室来减少这些隔离的蔓延。

1。介绍

肺炎克雷伯菌负责许多community-onset和院内感染。越来越高的抗菌素耐药性流行是一个夸张的问题,尤其是对卫生保健提供者。k .肺炎可以赋予抵抗大多数的抗生素通过应用大量的耐药机制,导致死亡率和发病率高。这种耐药细菌敦促关注抗菌素耐药性的重要性。今天主要的抗生素用于治疗感染β内酰胺抗生素,抑制转肽酶参与细菌细胞壁的合成。不幸的是这些beta-lactam抗生素可以停用β内酰胺酶酶(1]。

扩展频谱β-lactamases (ESBLs)生产细菌是临床和流行病学重要,耐药的影响β内酰胺抗生素,但仍敏感克拉维酸(1]。ESBLs现在发现在世界各地的所有肠杆菌科物种(2]。大多数的ESBL酶k .肺炎来自这两个经典酶类型TEM和质粒编码的SHV [3]。此外,肺炎克雷伯菌菌株产生CTX-M类型增加了(4]。

良好的灵敏度分析测试和适当的抗生素处方需要筛选和鉴定分离产ESBLs [5]。k .肺炎可以表达高水平的第三代头孢菌素耐药性的获得的质粒基因编码ESBLs港湾。大约20%的k .肺炎重症监护病房感染在美国涉及菌株对第三代头孢菌素(6]。ESBL生产者表达的快速增长的抵抗多种抗生素的家庭是一个严重的问题,缩小治疗机会反对ESBL生产商(7]。

毒力因素(VFs)构成机制允许病原菌引起的感染。基因组学成为一个好的工具用于定义毒性的因素,因为它可以用来识别基因带有特定的毒力因子。然而,生物可以无毒如果只有一个因素提出;有时同时存在的各种因素是必需的决定引起感染的细菌的能力(8]。含铁细胞,许多毒性荚膜多糖等因素综合粘附,这两种类型1和3菌毛的严重性水平发挥重要作用k .肺炎感染(9]。

大多数研究都致力于研究抗菌素耐药性或毒性,尽管生物效应和这些因素之间的关系是特别重要的。从第三代头孢菌素,像其他β内酰胺抗生素,治疗严重hospital-onset至关重要或社区获得性感染所致k .肺炎(10),因此,研究的过程可能提供更好的理解之间的关系β内酰胺阻力和毒性。

因此,本研究旨在获得进一步洞察ESBLs和non-ESBLs产生的毒性特征k .肺炎从收住曼苏拉医院科隔离。此外,我们试图探索ESBLs之间的遗传相似度和non-ESBLs生产肺炎。

2。材料和方法

2.1。细菌的分离和鉴定

几百k .肺炎从243年临床标本分离是孤立的。这些临床标本来自各种临床来源包括痰、尿、创伤、烧伤收住曼苏拉医院科。根据生化分离都是生化鉴定标准(11]。协议进行研究符合伦理准则和使用和处理人类受试者的医学研究研究伦理委员会,通过学院制药、收住曼苏拉大学科、埃及(许可证号码:2013 - 30)。

2.2。抗菌药物敏感性试验

对于每一个纯粹的隔离,一个抗菌药物敏感性测试是由磁盘扩散技术指南中描述的临床和实验室标准协会(2014)(12]。以下使用抗生素:aztreonam (30μg),头孢曲松(30μg)、头孢他啶(30μg)、头孢噻肟(30μg)、头孢哌酮(30μg)和头孢吡肟(30μg)。

2.3。检测ESBL生产隔离

k .肺炎最初检测β内酰胺酶生产根据哈桑et al。2010年(13]。一切积极β-lactamase-producing菌株受到修改后的双盘协同测试(MDDST)为了确定生产ESBL (14,15]。ESBL生产的任何失真或者增加≥5毫米的头孢菌素的抑菌圈向无光盘光盘。

2.4。毒性检测的因素k .肺炎隔离

2.4.1。血溶血

板溶血测试是由裸奔血琼脂平板上分离含有5%(卷/期)人类的血液。(总β)和部分(α)红细胞裂解仔细检测后的孵化24小时37°C (16]。

2.4.2。血细胞凝集

幻灯片的方法用于检测红细胞聚集的细菌菌毛如Vagarali et al . 2008所述17]。测试是通过使用人体血液(“O”型)。经过三次的红细胞的生理盐水洗涤步骤,新鲜红血球暂停3%生理盐水。一滴水的悬架是添加到一个测试细菌培养。然后在室温下的下滑是滚5分钟。聚集被认为是一个积极的血细胞凝集的结果。

2.4.3。血清抗

使用比浊测定血清阻力进行了分析。620海里的吸光度是仔细测量之前和之后的3个小时的潜伏期在37°C。2复制的平均值来确定最终的吸光度,接受了剩下的吸光度相对于最初的吸光度计算孵化之前。如果比率高于100%,隔离被认为是抗血清(18]。

2.4.4。生物膜检测

细菌形成生物膜的能力是评估使用微量滴定板试验(19,20.]。对于每个隔离,意味着OD_492年6井计算(OD_T)。截止OD (ODc)被定义为三个标准差OD -控制井。生物膜形成是断言的水平如下:(我)不依从:OD_T≤OD_C(2)弱附着:OD_C< OD_T≤2 od_C(3)适度附着:2 od_C< OD_T≤4 od_C(iv)强烈粘附:4 od_C< OD_T。

2.4.5。脂肪酶生产

根据Panus et al。2008年(16),隔离于80年分别在渐变条纹琼脂(1%)。经过一个星期的潜伏期在37°C,脂肪酶生产隔离形成一个不透明的沉淀区。

2.4.6。表型检测Hypermucoviscosity (HMV)

它是使用修改后的字符串测试中,单一的殖民地伸展mucoviscous字符串的能力进行测试。当拉伸形成字符串> 10毫米长,它表示HMV表型(21]。

2.4.7。白明胶酶生产

白明胶酶裸奔后发现细菌的生产明胶琼脂板和孵化37°C 24 h。白明胶酶生产殖民地包围一次清除区氯化汞是倒在盘子中变得不透明22]。

2.5。聚合酶链耐药性和毒力基因的分析

每个隔离一个殖民地在70年暂停了μl DNase-free水在95°C和受到热块10分钟。ESBLs基因(TEM、SHV和CTX-M-15),包括毒性基因鱼翅H血细胞凝集,bss生物膜的形成,国际空间站和达叻血清抵抗基因,iucAaerobactin基因放大使用梦想Taq PCR大师(Fermentas,美国)和混合引物列在表中1。12.5反应混合物组成的μl梦想Taq绿色PCR反应混合液(2 x), 1μ正向引物(10 lμM), 1μ反向引物(10 lμM), 1μ9.5 l的细菌溶菌产物,μl nuclease-free水添加总计25μl /反应。- PCR控制做好了准备。循环条件开始最初的变性5分钟在95°C,紧随其后的是40周期在95°C的变性30年代,退火30年代在温度为每个引物指定表中列出1在72°C,扩展1分钟。其次是最后一个在72°C扩展步骤5分钟。

2.6。随机扩增多态性DNA (RAPD)概要文件

根据罗德里格斯等。2008年,底漆操纵子18 (5′-CAGCACCCAC-3′)是用于生成合适的RAPD带概要文件(25]。RAPD执行根据Eftekhar和努里·法,2015年,一些修改(26]。反应混合物(20毫升)包含1μ米的底漆使用,0.2毫米核苷酸,1.5 U FlexiTaq DNA聚合酶,1 x GoTaq®福莱希缓冲区,0.5毫米MgCl₂,3μl的DNA模板。RAPD-PCR进行热循环(FPROGO2D Techne Ltd .,剑桥,英国)使用以下计划:在95°C初始变性3分钟紧随其后40变性的周期为30秒95°C,退火为30秒37°C和扩展为2分钟72°C,然后最后一个在72°C扩展步骤10分钟。放大产品被紫外线透照可视化在1%琼脂糖凝胶电泳后与溴化乙锭染色。RAPD指纹分析目视检查并与100 bp + DNA分子量梯子。

2.7。统计分析

数据代表的存在不同的毒力因素相关的基因在两组,ESBL和non-ESBL被执行分析测试或Fisher精确检验。差异是评估的意义。

3所示。结果

3.1。细菌的分离和鉴定

二百四十三年临床分离收集来自不同病人收住曼苏拉医院科,埃及。分离纯化和鉴定,生化反应k .肺炎。大多数的k .肺炎分离得到从尿(74%),痰(11%),伤口(9%),和燃烧(6%)。

3.2。抗菌药物敏感性试验k .肺炎隔离

抗菌药物敏感性的模式k .肺炎隔离是由阀瓣扩散法。49隔离(49%)耐头孢曲松钠和头孢噻肟。五十个分离株对头孢哌酮(50%)。对头孢他啶和aztreonam,发现40(40%)和38(38%)隔离电阻两种抗生素,分别。另一方面,只有19个(19%)的孤立k .肺炎耐头孢吡肟。

3.3。扩展频谱检测β内酰胺酶(ESBL)生产隔离

检测ESBL透露,50%的测试隔离ESBL生产者和所有这些隔离存在至少两个ESBL基因(SHV,TEM,或CTX-M- - - - - -15)(表2)。此外,ESBL生产商表现出显著降低易感性的所有测试beta-lactams相比non-ESBL生产商()。

3.4。毒力因素的表型和基因型的检测

50 ESBLs的毒性特征和50 non-ESBLs生产隔离表所示2和3,分别。

所有隔离的血液溶血试验显示只有一个ESBL和两个non-ESBL生产隔离α溶血性。

所有隔离检测凝集红细胞的能力。观察红细胞的凝集在48 ESBL生产隔离(96%)和47 non-ESBL生产隔离(94%)。PCR检测鱼翅H基因显示所有ESBL和non-ESBL产生孤立存在鱼翅H基因。

抗血清的使用比浊测定隔离进行了分析。剩下的3小时后吸光度(OD_620年3 h)大于100%,相对于最初的吸光度在29(58%)的ESBL隔离和11(22%)的non-ESBL隔离,所以这些隔离指定的抗血清,差异非常显著()。剩下的隔离显示对血清的敏感性。PCR分析表明,没有一个测试隔离存在达叻基因。相比之下,国际空间站基因检测ESBL和non-ESBL隔离的50%和22%,分别为()。

生物膜形成的隔离是使用微量滴定板试验进行了测试。生物膜强度分为弱,温和,强大和ESBL和non-ESBL生产商之间的比较(图1)。弱的生物膜中检测出40%的ESBL生产者和92%的non-ESBL高度显著差异()。温和型的生物膜高ESBL(38%)相比,non-ESBLs (4%) ()。此外,强大的生物膜生产中只发现ESBL生产商(20%)()。只有一个ESBL生产国和2 non-ESBL生产商nonbiofilm生产商。关于bss基因,它被发现在所有隔离。

脂肪酶生产只有3 ESBL(6%)和5 (10%)non-ESBL生产隔离被认为是脂肪酶生产商与两组无显著差异。

高压表型的患病率高于non-ESBLs生产隔离,31(62%)的non-ESBLs展出hypermucoviscosity ESBLs相比(4%)()。

没有观察到的意义差异白明胶酶生产ESBL和non-ESBL生产之间的隔离。

Aerobactin基因(iucA)中检测出6 ESBLs(12%)和3(6%)的non-ESBL生产隔离。

3.5。毒性资料与ESBLs和Non-ESBLs生产隔离

共有24个不同的毒性资料测试隔离观察。六个概要文件与ESBLs有关生产隔离相比十概要non-ESBLs生产隔离。此外,七个档案中发现了两种类型的隔离。最普遍的概要文件与ESBLs生产隔离是biofilm-serum resistant-haemagglutination -BssS-fimH- - - - - -国际空间站(28%),最常见的配置文件与non-ESBLs生产隔离biofilm-haemagglutination-hypermucoviscosity——观察BssS-fimH(36%)(表4)。

3.6。RAPD概要分析

隔离所有被RAPD-PCR类型化分析。模式的数量所产生的操纵子18是51如表所示2和3。十八ESBL生产隔离模式是特定的,32 non-ESBL生产隔离模式是特定的,和1模式(P8)表现出了两种类型的隔离。十八岁的RAPD模式与ESBLs生产隔离,P3是最主要的(14%)。第二个最常见的模式是P2;它是12%的产ESBLs隔离中观察到。此外,八模式由单一的隔离。总的来说,non-ESBL生产比ESBL生产隔离,隔离更多样化,26日32模式是由单独的隔离。

聚类分析的RAPD概要文件分类所有隔离成四个集群,b, c和d(图2)。四组由ESBLs和non-ESBL生产隔离与不同程度的分布。ESBLs在集群生产隔离是最分散的一个(76%)()相比,non-ESBL生产隔离(16%)()。12% ()产ESBLs隔离被确定在b组8% ()non-ESBLs生产隔离出现在同一组。相比之下non-ESBLs生产隔离更主要在集群c和d 56% ()和20% (),这些隔离被包含在两组,分别。ESBLs生产隔离由较低的百分比在两个集群c和d。

4所示。讨论

肺炎克雷伯菌是一种常见的医院感染病原体相关社区和包括呼吸道和尿路感染和伤口和血液感染27]。其致病性相关的多种毒力因子(28和能够容易获得多个抗生素抗性29日]。事实上,它是一个重要的ESBL的主机。细菌的耐药性β-lactams在人类病原体ESBL产量急剧增加,导致重大的发病率和死亡率(30.]。

的比例k .肺炎隔离生产各国ESBL是可变的。这些比例是12%在美国,33%在欧洲,52%在拉丁美洲,28%在西太平洋31日]。2014年研究胫骨和Ko, 33.6%的隔离是ESBLs生产商(32]。更高的百分比在阿拉伯地区Aljanaby Alhasani, 2016年报道,ESBL生产k .肺炎为62.5% AL-Najaf省,伊拉克33]。在这项研究中,50%的隔离估计ESBLs生产商。这些数据证实ESBL隔离的戏剧性的传播世界各地。

感染造成ESBL生产商与严重不良条件(34]。的确,这是无效的治疗和失败有关抗生素的选择积极反对这些隔离。然而,发病率死亡率增加相关ESBL生产者也可能与毒性的增加这些隔离35]。

大多数β-lactamases有助于抵抗多种抗生素包括第三和第四代头孢菌素和monobactams [36]。本研究证实,产ESBL隔离明显表现出更强的抵抗力比non-ESBL检查beta-lactams生产商()。这些结果与以前报道的胫骨和Ko, 2014年,产ESBL隔离显示显著更高的抵抗大多数beta-lactams比non-ESBL生产隔离()[32]。

k .肺炎主要港口ESBL基因(SHV,TEM,和CTX-M),显示抵抗多数抗生素(37]。在这项研究中,这些基因的PCR检测显示,100年,96年,84%的ESBL生产k .肺炎存在CTX-M -₁₅,SHV,和TEM,分别(表2)。胫骨和Ko, 2014,显示出类似的结果有关CTX-M所有ESBL生产商发现港口bla吗CTX-M基因(33]。此外,Aljanaby Alhasani, 2016年,报告说TEM和SHV93.75%(30/32)和87.5%(28/32),分别为(33]。

的致病性k .肺炎是由于多种毒力因子,引起多种疾病通过攻击哺乳动物的免疫系统23]。ESBL生产引起的感染k .肺炎与严重的条件是由于这些菌株表达毒性因素的能力(35]。微生物生物膜形成和发展已报告有重要的作用克雷伯氏菌致病性。此外,生物膜可以保护细菌免受抗菌素相比与其他nonbiofilm形成细菌(38]。在最近的研究中,生物膜ESBL和non-ESBL生产商非常普遍。更重要的是,发展强大而温和的生物膜更重要的ESBL生产商non-ESBLs相比(图1)。1型和3型菌毛是最重要的毒力因子粘附的负责k .肺炎社区和增加其在生物膜生长的能力(9]。这就解释了为什么fimH基因被发现在所有生物膜产生隔离。

血清抵抗已被证明在多个细菌系统生存至关重要的入侵的细菌和疾病的场所,由于基因突变导致血清阻力损失呈现几位细菌病原体无毒39]。因为抗血清的病原性因素之一克雷伯氏菌优越的抗血清杀菌活动在目前的研究中(40%)是高致病性的风向标。Gundogan Yakar, 2007年,发现32.5%的k .肺炎是抗血清(40]。有几项研究报告,有积极的ESBL和血清抵抗之间的联系。在目前的研究中,比较血清抵抗在我们测试隔离,ESBLs生产商明显高于血清抗比non-ESBL生产商。这一结果与先前建立的匹配sah et al。2004年(41)显示,抗血清分离的患病率大大观察产ESBL隔离(TEM和SHV类型)(30%;27/90隔离)相比non-ESBL生产商(17.9%;32/178隔离)()。林et al ., 2016年报道的比例明显高于血清抵抗ESBL生产k .肺炎比non-ESBL中生产菌株k .肺炎压力(42]。

基因达叻没有发现测试隔离。在之前研究Atmani et al。2015 (30.]达叻基因出席率低(3.1%)在市政废水处理植物隔离和没有在医院废水和临床分离株。这种血清resistance-associated外膜质粒基因以前曾有报道称在临床分离株作为抗血清(次要因素23]。

在目前的研究中国际空间站基因被发现在50%和22%的ESBL和non-ESBL产生分离,分别为()。研究El-Mahdy et al ., 2011国际空间站基因组DNA基因被发现在32%和36%的质粒DNA大肠杆菌隔离。在相同的研究中国际空间站基因组DNA基因被发现在5%和31%的质粒DNAk .肺炎隔离(43]。这证实了水平转移国际空间站基因之间的细菌。我们的发现国际空间站基因被发现在65%的抗血清分离表明这个基因可能与血清抵抗(表2和3)。

不同的荚膜成分和数量的增加荚膜hypervirulent中描述的材料k .肺炎隔离(44]。然而,一些工作阐明hypermucoviscous的角色(HMV)表型的致病性k .肺炎存在,并没有直接的比较HMV和non-HMV隔离使用易感宿主先天免疫系统组件的描述。这是因为大量的基因位点的HMV表型有关k .肺炎(45]。

研究李et al ., 2016年,94.3%的隔离表示hypermucoviscous表型(荚膜K1、K2型/ K5)和抗血清。此外,57.1%的nonhypermucoviscous (non-K1 / K2 /对于隔离也抗血清。李et al ., 2016年,证实hypermucoviscosity和血清抵抗现象取决于类型的胶囊(46]。此外,方舟子et al ., 2004年,发现高8随机选择临床血清中查出了阻力k .肺炎隔离:四人HMV入侵隔离和四人non-HV无创性隔离(47]。此外,El Fertas-Aissani et al ., 2013年报道,hypermucoviscosity被发现在9.2%的隔离虽然只有92.6%的隔离是抗血清(23]。

在目前研究hypermucoviscosity估计的33%k .肺炎隔离。发现8 (24%)HMV隔离表现出抗血清。先前的报道表明,ESBL基因很少发现k .肺炎菌株HMV表型和hypermucoviscosity之间也存在负相关(高压)和ESBL (48]。我们的研究结果支持这一发现,62%的non-ESBLs展出hypermucoviscosity ESBLs相比(4%)()。研究李et al ., 2010年,HMV表型被确定在91年35 (38.5%)k .肺炎隔离。检测ESBLs相同的研究显示,24隔离(26.4%)产ESBL菌株。只有一个ESBL生产k .肺炎应变表达了HMV表型。他们的结果表明一个重要的负面的HMV表型和ESBL生产之间的联系k .肺炎隔离(48]。此外,Yu et al ., 2015年,证实HMV表现型的患病率在ESBL显著降低k .肺炎比non-ESBL分离株(8.8%)k .肺炎隔离(53.8%)(49]。

Aerobactin是citrate-hydroxamate含铁细胞很少表达的古典院内k .肺炎。HMV表达k .肺炎(50]。然而,在我们的研究中HMV的15.1%k .肺炎是aerobactin生产商。这些结果相对类似报道El Fertas-Aissani et al ., 2013年,只有20%的HMV aerobactin生产商(23]。此外,这种含铁细胞并不普遍ESBL和non-ESBL生产商在这项研究和之前报道的Podschun et al . 200151)和Atmani et al。2015年(30.]。此外,α溶血是常与各种病原微生物的毒性是非常罕见的在我们隔离non-ESBL生产商ESBL(2%和4%)和先前的研究32,52]。然而,Gundogan et al ., 2011年,(53已经证实,67%的克雷伯氏菌隔离来自肉类样品表现出溶血活性。同样,白明胶酶和脂肪酶酶都是小贡献者的毒性ESBL和non-ESBL生产商。

毒力因素结合分析了23个不同的毒性资料包括(表2 - 8毒性因素4)。13资料观察中ESBL生产者和十七non-ESBL生产隔离,其中七个概要文件共享的隔离。的确,四建立毒性资料中传阅76%的ESBL生产隔离。剩下的九个毒性ESBL生产商的概要文件包括一个,两个,三个分离株为每个概要文件。关于non-ESBL生产商,两个毒性资料中发现60%的隔离。其余15 non-ESBL生产商的毒性资料包括从一至三隔离在每个概要文件。这些发现表明,ESBL生产商比non-ESBL生产商更相关的基因。我们的观察证实了RAPD分析(表2和3)。这种技术是常用的作为一个流行病学工具来区分不同k .肺炎隔离(54]。总体而言,我们的研究结果证实了标记之间的遗传相似度ESBL non-ESBL生产商相比,十八岁的ESBL的RAPD模式具体是由单一的隔离,而26岁的32个RAPD模式具体non-ESBL是由单独的隔离。Dendogram RAPD分析概要文件分类所有隔离成四个集群(a, b, c, d)基于大量指纹(图生成2)。大多数的ESBL隔离(,76%)属于a组进而证实ESBL生产分离株之间的遗传相似度。相比之下,non-ESBL生产商基因多样化,16%,8%,和20%的隔离是分布式集群中,b和d,分别,虽然一半的非生产的隔离在集群c (,56%)。相反,Eftekhar和努里·2015 (26)报道,大多数non-ESBL隔离(62.1%)属于单个集群和ESBL生产商及其RAPD指纹8集群之间的传播。

总之,这是第一个在收住曼苏拉大学科进行的研究显示ESBLs和non-ESBLs之间产生毒性的差异特征肺炎。因此,这项研究表明ESBL生产和一些毒力因素之间的相关性。因此提高警觉性的临床医生和增强测试实验室是必要的,以减少失败的治疗和预防产ESBL的传播k .肺炎。

的利益冲突

作者没有宣布任何利益冲突。

确认

所有的感谢和感激去收住曼苏拉医院科的临床实验室的工作人员提供临床标本用于这项研究。

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