伊朗吉兰医院供水受到污染嗜肺军团菌，大肠杆菌，和铜绿假单胞菌

抽象的

本研究旨在确定医院供水的污染程度铜绿假单胞菌，嗜肺军团菌,大肠杆菌在Gilan,伊朗。标本直接采集到无菌容器中，离心浓缩。任何样品的一半转移到酵母提取物肉汤，第二部分转移到胰蛋白酶大豆肉汤，培养3天。用商品化试剂盒提取DNA。进行4轮PCR:多重PCR检测铜绿假单胞菌、Integron 1和Metallo-β- 酰胺基因;PCR检测嗜肺性军团菌和m基因分开;PCR检测大肠杆菌；以及另一种用于检测整个细菌存在的PCR。冷水、温水和培养箱水样的污染率铜绿假单胞菌，16.6％，37.5％和6.8％。污染程度退伍军人分为3.3％，9.3％，10.9％，而且大肠杆菌分别为零、6.2%和零。冷、温、培养箱水样的总细菌污染分别为93.3%、84.4%和89.0%。-金属β-内酰胺酶基因在20.0%的样本中发现。污染程度与铜绿假单胞菌是相当可观的退伍军人是温和的。-金属β-内酰胺酶基因经常被发现，表明多种耐药细菌广泛存在。建议采用基于纳米技术的新型去污方法。

1.介绍

医院感染是医院环境有利于其发展的一种感染。微生物可以通过被污染的物品传播到宿主，比如水。水可能在许多方面受到污染。不同形式的污染来自不同的来源，并以不同的方式处理[1］．水污染的三种主要形式是物理污染、细菌污染和化学污染。2］．污染可能发生在源头、源头和储存点之间或储存罐中。接头有缺陷、虹吸、管道生锈和污水管道跨越是造成污染的其他原因[3.］．因此，饮用水分配系统可能含有不同的微生物学区，可能包括机会主义病原体，并且是人类暴露疾病最重要的单一来源，主要是摄入微生物污染水[4］．

医院爆发疾病通常与水源污染有关[5］．新生儿呼吸器和培养箱的水污染是主要转移来源[6，7］．据报，冷却塔及空气调节系统亦是几宗禽流感爆发的源头[8］．人造水系统尤其是热水系统是主要来源军团菌［9］．这些细菌在生物膜中存活，并能抵抗氯和其他消毒剂[9］．

多种机会主义病原体，如假单胞菌可被纳入管道饮用水中，在管道表面寄生大量形成生物膜的细菌[10］．此外，在细菌学评估中，特别是对大肠菌群的评估，许多公共卫生当局必须定期进行粪便污染指标，以确定水的质量，以确保防止病原体通过水机构进一步传播[11］．

在不同的水处理厂中添加氯是一种常见的做法，但这不足以保证水的安全。水样中的细菌数量与游离余氯之间存在着不利的联系，但传统处理工艺无法消除饮用水中的关键水媒病原体，因此需要开发改进和/或新的消毒技术[4］．

本研究的目的是确定冷热水的污染率以及吉兰省，伊朗的医院新生儿孵化器的水铜绿假单胞菌，嗜肺军团菌，和大肠杆菌,用分子生物学方法。

2.材料和方法

2.1。抽样，处理和富集

2014年4月至6月期间，在该地区30家医院的60 mL塑料容器中无菌采集了135份水样(每份约50毫升)(30份冷水样本、32份温水样本和73份培养箱水样)。冷水和温水样品在水运行5min后采集。新生儿病房培养箱水样直接取于无菌塑料容器内。饮用水由市政系统供应给医院，在那里不接受额外处理。送到医院后，水有可检测到的游离余氯。所有水样均浓缩20倍(将所有水样分为5个falcon tubes, 12000 rpm, 4°C离心30min，弃上清，沉淀溶于0.5 mL剩余水中，取管)。丢弃上清液后，沉淀物溶解在1 mL的剩余溶液中，并分成两个不同的部分。其中一部分在50°C处理30分钟，以减少其他污染物，以有效回收军团菌．热处理后，每个样品接种于5 mL含酵母提取物10 g/L、L-半胱氨酸0.04%、焦磷酸铁0.25 g/L、甘氨酸0.3%、万古霉素5的液体培养基中µg/mL，最终pH为6.9,35℃孵育3天。需要注意的是，万古霉素和甘氨酸是在高压釜后，温度在40℃左右时加入到培养基中。随着万古霉素和甘氨酸的加入，培养基的选择性得到了提高。这种选择性培养基应该有助于从环境来源中回收军团菌[9］．将每个样品的第二部分接种在胰蛋白酶大豆肉汤中，并在35℃温育3天以进行恢复铜绿假单胞菌和大肠杆菌．

2．2.DNA提取和引物

所有培养样品均分成1ml以上，在4°C、12.000 rpm的西格玛3k30离心机中离心20分钟。弃上清，用1 mL TE缓冲液悬浮液提取DNA。使用商业程序提取DNA(基因组DNA纯化试剂盒，Thermo Scientific，批次:00155557,Fermentas，立陶宛)。提取的DNA要么立即用于PCR，要么保存在−20°C直到分析。

进行多轮PCR检测铜绿假单胞菌， Integron 1, Metallo-β- 酰胺基因，嗜肺性军团菌，m基因,大肠杆菌(1)常规PCR，利用特异性引物退伍军人和m基因分开，（2）使用特定引物进行多重PCR铜绿假单胞菌、Integron 1和Metallo-β-内酰胺酶基因，(3)常规PCR检测大肠杆菌(4)最后一轮PCR，使用通用引物检测细菌总存在情况。本研究使用的引物如表所示1．

我们使用了基因组DNA退伍军人为第一轮PCR阳性对照。标准应变铜绿假单胞菌（ATCC 27853）用作第二轮PCR的阳性对照，大肠杆菌(ATCC 44338)作为第3、4轮PCR的阳性对照。每轮PCR均以纯净水为阴性对照。

2．3.PCR条件

2微升提取的模板DNA用于20µL反应混合物中含有10µPCR预混物[Prime Taq预混物(2x)， Chorea批号201208]，0.5µ每个引物的l和7 µl ddh2o。第一次圆形放大的循环计划退伍军人(种特异性片段)的初始变性时间为94^∘C 5分钟，然后35个循环，94个^∘C为60秒，45秒^∘C代表50秒，72秒^∘最后一次延长到72岁^∘C 10分钟。第二轮PCR循环程序相同，退火温度为50℃。第三轮PCR的退火温度为58℃，通用引物16S rRNA扩增的退火温度为47℃，循环程序相同。扩增产物在琼脂糖凝胶(2% w/v)上进行125伏电泳45分钟，并通过GelDocTransluminator系统(VilberLourmat模型)进行分析。

3.结果

从该地区30家医院无菌采集了135份水样(30份冷水，32份温水，73份培养箱水样)。冷水、温水和培养箱水样的污染率铜绿假单胞菌分别为16.6%、37.5%和6.8%(表2- - - - - -4和图1)．污染程度退伍军人分别为3.3%、9.3%及10.9%(表2- - - - - -4和图2） 与大肠杆菌分别为零、6.2%和零(表2- - - - - -4和图3.)．冷水样、温水样和培养箱水样的总细菌污染分别为93.3%、84.4%和89.0%2- - - - - -4和图4)．

-金属β-内酰胺酶基因在冷水、温水和培养箱水样中分别为20.0%、15.6%和21.9%2- - - - - -4)．约60.0％的铜绿假单胞菌在培养箱样品中有Metallo-β-内酰胺酶基因，42.0%的温水样品有铜绿假单胞菌有这种基因，10.0%的铜绿假单胞菌在冷水中，样品具有相同的基因。

约8.3％的铜绿假单胞菌在温水样品中有Integron 1，但我们没有发现铜绿假单胞菌在任何培养箱和冷水样品中都有整合子1。我们也没有找到铜绿假单胞菌与整合子1和metallo-β-内酰胺酶基因在培养箱和冷水样本中仅占1 / 12铜绿假单胞菌热水样品中均含有Integron 1和Metallo-β- 酰胺基因。

大约25.0%的退伍军人在培养箱样本中m33.3%的温水样品中含有基因退伍军人与m基因。我们没有找到退伍军人与m冷水样本中的基因。

通用引物PCR检测结果显示，88.9%的样本存在细菌污染，16.3%的样本存在细菌污染铜绿假单胞菌,有8.9%退伍军人， 1.5%大肠杆菌．金属-β-lactamases基因在20.0％中发现，在所有样品的3.0％中发现整合蛋白1。

4。讨论

微生物在医院水库中存活的能力在30多年前就被描述过，许多研究已经证实医院的水是医院感染的一个来源[19］．有关自来水的细菌污染程度是细菌种类(包括可能致病的生物)的扩散点[20.］．水媒传染病的传播方式包括直接接触、摄取水、间接接触、吸入从水源散发的气溶胶及吸入受污染的水[21.］．

地表水受到污染的原因有几个，例如供水系统的使用年限、输送的水质、氯化处理不当及维修不当等[22.］．污染可能发生在源头、源头与储存点之间或储存罐内[3.］．由于在水管的内表面上形成的生物膜中的微生物再生，发生细菌污染。生物膜的生物活性由水，温度和残留氯的营养含量控制[23.］．

微生物在自然界中广泛分布，其丰度和多样性可作为水质适宜性的指标[24.］．某些类型的微生物是人类粪污染的特征[25.］．在本研究中，我们使用了三种细菌(大肠杆菌，铜绿假单胞菌,退伍军人)来评价研究的供水质量，因为河流和地下水是该地区自来水的主要来源，而这些细菌是水源的主要人体病原体。实际上在这项研究中，大肠杆菌被用作肠溶细菌病原体的代表。我们也使用了退伍军人作为普遍的水性微生物和铜绿假单胞菌是普遍存在的水媒条件致病菌。

大肠杆菌大肠杆菌是一种粪便大肠菌群，常见于动物和人类的肠道内，若在水中发现，则是近期污水或动物粪便受到污染的有力证据[26.］．我们没有找到大肠杆菌在冷水和培养箱水样中，只有两个温水样本显示出存在大肠杆菌．在一些类似的研究中，被检查医院的供水系统中完全没有属于肠杆菌科的革兰氏阴性细菌[27.］．虽然大肠菌群被称为用于监测水微生物质量的最佳指标，但在某些情况下，该指标不是很有效。有些人认为异养细菌的过度生长导致抑制大肠菌群。因此，建议使用其他细菌作为水微生物质量控制的替代指标假单胞菌可以是其中一个指标[28.］．

铜绿假单胞菌是环境中无处不在的自由生存细菌的一部分吗．铜绿假单胞菌是医院主要关注的问题，因为它可引起严重的继发感染，例如烧伤病人或免疫功能低下者的肺炎[29.］．它在饮用水中的出现可能更多地与它在管道装置(即龙头和淋浴喷头)生物膜中的寄生能力有关，而不是与它在分配系统或处理过的饮用水中的存在有关。铜绿假单胞菌能在去离子水或蒸馏水中存活;因此，它可能存在于低营养或少营养的环境中，如用于新生儿病房孵化器的蒸馏水[30.］．在本研究中，温水的污染程度与铜绿假单胞菌比冷水（16.6％）和培养物水（6.8％）更高（37.5％）。高温的水可以有利于生长铜绿假单胞菌［30.］．即使在3.00 ppm无残留氯的存在下，它也能被分离出来[30.］．

基于实验室的研究已经证明了由诸如大肠杆菌［31.]，退伍军人［32.),而铜绿假单胞菌［33.］．许多研究表明，这些细菌是重要的机会主义病原体，可参与国内管道系统的生物膜相关污染[34.- - - - - -37.］．

de abreu等。提出了生物膜自来水是医疗保健设施中伪组载的主要环境来源[20.］．在本研究中铜绿假单胞菌与- - -金属β- 酰胺酶为37％。应该指出的是，金属 -β-在世界范围内，产生内酰胺酶的菌株的报道越来越多，并导致了亚洲、欧洲和美国几家医院的大规模疫情暴发[38.- - - - - -42.］．编码金属的基因 -β-内酰胺酶通常位于1类整合子内，与编码氨基糖苷修饰酶的整合子一起，产生多药耐药。此外，整合子中还含有Metallo-β-内酰胺酶决定因素通常位于质粒上，当然有助于它们在种内和种间的传播[43.］．金属流行率高β- 其他地中海国家也发现了产生流行病或流动菌株的酰胺酶，例如意大利和希腊[44.］．

存在退伍军人与温水管道系统中的生物膜有关[45.］．这种细菌也能在较低温度的饮用水环境中生存[46.，47.］．退伍军人，特别是血清组1和6的菌株，被认为是社区获得性肺炎和医院相关性肺炎的原因[48.，49.］．通过吸入环境源产生的气溶胶向人类传播。若干报告表明，军团病的主要来源是医院、疗养院和酒店等大型建筑的饮用水系统[50.］．

在类似的研究中，Yaslianifard等人。发现了相当大的污染率退伍军人和铜绿假单胞菌在德黑兰的医院水样中，伊朗[51.］．Shamabadi和Ebrahimi发现革兰氏阴性菌群污染率低，浓度适中军团菌，以及可能致病的非肠杆菌种[28.］．

在目前的研究中，我们发现了退伍军人在冷水中比在温水和培养箱中低。似乎大量的铜绿假单胞菌可以掩盖的存在军团菌，在某些情况下导致低估。许多作者一致认为，不同的微生物种类以及高微生物负荷可以在限制甚至抑制生长中发挥重要作用军团菌［52.，53.］．在我们的研究中，冷水样品的总细菌污染非常高(93.3%)。事实上，医院供水系统的整体污染军团菌与德国和意大利的早期研究相比，在本工作中发现较小[54.- - - - - -57.］．在美国国家监测研究13个州的20家医院，14家医院被殖民军团菌在水系统中，43%的医院有环境阳性率军团菌［58.］．在西班牙对12家医院进行的一项研究中军团菌≥30% (59.］．退伍军人在台湾63%的医院供水系统中也发现有[52.］．

本研究表明，应注意水源的清洁和去污，以防止致病微生物。氯因其低成本、低效果在许多国家被广泛用作消毒剂，但不足以保证水的安全。在以氯作为消毒剂供应的分配系统内，所有分配点都需要保养残余氯[60］．由于传统处理工艺无法消除饮用水中的关键水传病原体，需要改进和/或开发新的消毒技术。最近的研究表明，纳米技术可能通过使用纳米吸附剂、纳米催化剂、生物活性纳米粒子、纳米结构催化膜和纳米粒子增强过滤提供这一领域的解决方案[4］．

5.结论

我们的研究表明，研究的水样的污染程度与铜绿假单胞菌是相当大的，与退伍军人是温和的，与大肠杆菌很低。我们也发现金属频繁的存在β-内酰胺酶基因，表明广泛存在多种耐药细菌。建议在新消毒技术的基础上，采用新的消毒方法。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

确认

本研究得到了桂兰医科大学的资助。

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