大腿脓肿的革兰氏阴性细菌感染可迁移到远处烧伤，取决于烧伤深度

摘要

脓毒症仍然是严重烧伤患者的主要死亡原因。在本研究中，我们评估了不同严重程度的烧伤与先前存在的远处感染之间的相互作用。我们使用革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌和变形杆菌)通过基因工程使其具有生物发光性，从而可以对感染的程度和严重程度进行无创、连续的光学成像。根据烧伤的严重程度，生物发光细菌从腿部皮下脓肿迁移到背部远处的烧伤伤口，这种迁移导致小鼠死亡率增加。用环丙沙星治疗，注射到有细菌感染的腿部或烧伤焦痂中，可防止伤口定植，降低死亡率。目前的数据表明，烧伤伤口很容易被远离伤口本身的感染所定植。

1.介绍

感染是严重烧伤最常见和最严重的并发症，与烧伤的大小和损伤的严重程度有关[1］.目前，尽管抗菌治疗取得了重大进展，但败血症占烧伤患者死亡的50-60%。开放性烧伤创面的微生物定植通常在伤后第一周结束时建立[1尽管使用了抗菌剂。如果细菌密度超过了宿主的免疫防御，就可能发生侵袭性烧伤败血症。烧伤创面被细菌占领，部分原因是皮肤屏障功能的丧失，部分原因是烧伤创面没有或很少有血管阻止宿主免疫系统的血源性细胞的抗菌作用。

烧伤损伤导致几乎所有免疫反应方面的抑制[2］.烧伤后血清免疫球蛋白、纤维连接蛋白和补体水平降低，细菌调理作用能力减弱。中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的趋化、吞噬和杀伤功能受损。烧伤后粒细胞减少是常见的。细胞免疫反应受损，表现为延迟的同种异体排斥反应、对普通抗原无能、淋巴细胞有丝分裂受损和混合淋巴细胞反应改变。烧伤损伤导致白细胞介素-2 (Il-2)的产生、t细胞和NK细胞的细胞毒性以及辅助-抑制t细胞比(HSR)的降低。

临床研究结果清楚地表明，烧伤的大小深刻地影响着患者的免疫状态和烧伤患者的生存[3.- - - - - -6]烧伤创面的深度也会影响烧伤皮肤的渗透性[7]和天然抗菌肽的含量，这些抗菌肽在皮肤的各个部位都有表达[8］.在目前的研究中，我们使用生物发光细菌来确定这些微生物引起的脓肿是否会导致烧伤痂的定植。我们的结果表明，与烧伤损伤的深度有关，烧伤痂是由注射在大腿的细菌定植的。这种细菌在大腿注射的烧伤痂上的定植增加与死亡率增加有关，抗生素环丙沙星可以完全防止这种情况。

2.方法

2．1.烧伤病人

动物实验是在MGH动物护理研究小组委员会(IACUC)批准的协议下进行的，并与NIH的指导方针一致。雄性CD-1小鼠(Charles River, 27-28克，每组12只)被麻醉，背部剃毛，并限制在暴露20% TBSA的聚碳酸酯模板中。暴露区域在90°C水浴中浸泡1、3、6或9秒，然后腹腔内给予2ml生理盐水复苏。假处理的动物接受相同的处理，除了使用室温水。受伤后将小鼠送回笼子24小时，自由获得食物和水。

２.２.组织学

伤后1天，检查烧伤创面，观察皮肤变化。切除皮下深棘旁肌及皮肤创面。组织标本在10%福尔马林中固定过夜，切片，插入盒中，加工石蜡块，切片至6微米切片，并用H&E染色进行光镜检查。染色切片用于研究烧伤病理，并用于测量烧伤深度。

2.3. 生物发光细菌产生大腿脓肿

生物荧光变形杆菌（Xen 44）和铜绿假单胞菌(Xen-4)(来自Xenogen Corp, Alameda, CA)是由转座子诱变产生的，使用一个无启动子，完全的lux操纵子(luxCDABE)，从Photorhabdus luminescens衍生，如其他地方所述[9，10］.细菌生长一夜后成球，在新鲜培养基中重悬，稀释至光密度为0.3，我们实验室发现光密度为~10⁶微生物/毫升。在受伤后两小时，将大约500万个细菌注入0.1 mL盐水(皮下)到烧伤或假治疗动物的大腿。

在一组实验中，烧伤小鼠的大腿注射环丙沙星(5 mg/kg)的细菌或腹腔内细菌注射在大腿。

２.４.生物荧光成像

根据实验方案，在不同时间(感染后3小时到20天)进行生物发光成像。用异氟烷对小鼠进行轻度麻醉，并将其置于装有微光成像电荷耦合器件(CCD)的成像室(Hamamatsu Photonics KK, Bridgewater, NJ)，如其他地方所述[11]。所有图像均在相同的信号位范围内呈现，以确保生物发光信号可以进行比较。

2．5．统计分析

生存数据采用log-rank (Mantel-Cox)方法进行分析。

3.结果

３．１．宏观研究

无论是假手术组还是烧伤1秒的小鼠都没有出现肉眼可见的任何异常。烧伤3秒的小鼠显示轻度红斑和一个三角形的深红色的色斑。烧伤6秒小鼠出现轻度红斑和肿胀，深部肌肉出现斑片状红斑，皮肤肌肉粘连。烧伤9秒的小鼠表现出肿胀，深色的皮肤有明显的椭圆形边缘，大面积的皮肤牢固地附着在深层肌肉上。

3.2.组织病理学检查结果

数字1具有代表性的H&E切片显示了假药处理小鼠和1、3、6或9秒烧伤小鼠。烧伤1秒的小鼠出现坏死，仅局限于表皮。烧伤3秒的小鼠显示损伤延伸至肉膜。烧伤6秒的小鼠显示深损伤延伸到浅表深肌肉。这种深度损伤也出现在9秒烧伤的老鼠身上，但深层肌肉也有明显损伤。

数字2显示了不同烧伤暴露时间下计算的烧伤深度与烧伤损伤时间的图表。1秒的烧伤仅限于表皮(20微米)。在3秒的燃烧中造成的伤害延伸到大约500微米。在6秒和9秒的烧伤中看到的损伤延伸到骨骼肌深处1000到1500微米。

3.3.细菌感染对24小时的影响 人力资源生存

24小时后没有死亡 hrs在假手术组小鼠中，假手术组小鼠腿部注射p .奇异君子兰或铜绿假单胞菌在另一种情况下，被烧伤1秒、3秒、6秒或9秒而没有感染的小鼠，或者被烧伤1秒、3秒并在腿部注射其中任何一种p .奇异君子兰或铜绿假单胞菌．然而，当小鼠的大腿被注射6秒或9秒烧伤后，死亡率会增加p .奇异君子兰或铜绿假单胞菌烧伤6秒的小鼠中50%或更多的细菌在24小时后死亡，烧伤9秒的小鼠中80%的细菌死亡(图)3.）.感染组6秒和9秒烧伤的结果均有统计学意义()，采用Log-Rank (Mantel-Cox)方法进行比较。6秒烧伤伴感染的结果与9秒烧伤伴感染的结果有统计学意义(）.环丙沙星，无论是用细菌注射在腿部，还是在细菌注射时注射在烧伤痂上，将9秒烧伤和细菌接种小鼠的死亡率降低到零(图)3.）.

3．4．活体生物发光成像

数字4演示了注入产生的典型结果p .奇异君子兰进入假的动物的大腿。接种后24小时，注射部位可见明显的生物发光信号。这种生物发光持续增加，在感染后4天达到最大值。随后，生物荧光逐渐减弱，在接种后20 d完全消失。同样的结果在动物注射铜绿假单胞菌（数据未显示）。在任何时候都没有在剃光的背部观察到任何生物发光。

数字5显示了p .奇异君子兰或铜绿假单胞菌24小时前注射于烧伤小鼠大腿。1秒和3秒烧伤的焦痂没有产生生物发光，但3秒烧伤引起的大腿脓肿的生物发光信号比1秒烧伤更大。皮肤暴露在6秒或9秒烧伤后，灼伤痂上的生物发光增加，9秒烧伤的信号比6秒烧伤的信号更强。得到了类似的结果铜绿假单胞菌(数据未显示)．

如图所示6，在接受9秒烧伤后注射的小鼠中，生物发光信号明显增加铜绿假单胞菌从3岁到24岁期间，在大腿上 在烧伤后7小时和9小时，大腿的信号强度增加，在烧伤后24小时，信号扩展到背部烧伤焦痂。在注射p .奇异君子兰(数据没有显示)。治疗9秒烧伤小鼠感染p .奇异君子兰或p .奇异君子兰将环丙沙星注射到腿部或腹腔内，可以阻止焦痂中产生强烈的生物发光信号p .奇异君子兰如图所示，其中2例正在接受环丙沙星治疗7．

4.讨论

败血症仍然是导致烧伤患者死亡率和发病率增加的主要因素。烧伤创面为细菌定植提供了极好的培养基，部分原因是烧伤创面产生的宿主免疫反应减少，部分原因是支持细菌生长的变性血液元素和坏死组织的存在。在导致败血症的伤口中产生细菌定植的微生物的来源已经进行了广泛的检查，包括皮肤、肺部、肠道和环境(我们实验室未发表的结果)。

已经进行了动物模型的研究，以确定肠道细菌是否能够转移到肠系膜淋巴结(MLNs)或其他部位，从而提供烧伤伤口细菌定植的潜在来源[12，13]。这些研究表明，肠道细菌可在烧伤后转移到MLN。然而，肠道细菌对烧伤伤口的污染也可能是烧伤患者接触床单或敷料上的粪便或动物模型中的床上用品的结果。这些研究不清楚如果转位的细菌仍然存活和生长，或者在转位后仅仅隔离在MLN中，则为th放射性标记微生物。

在本研究中，我们评估了生长在烧伤创面远端未受伤腿部脓肿中的细菌是否会导致烧伤创面定植。在本研究中，我们使用生物发光细菌来确定定植于烧伤创面的微生物来自腿部脓肿。生物发光微生物的优势在于s的研究表明，这些细菌在体外或体内发出的生物发光与存在的微生物数量直接相关。

我们目前的数据表明，随着烧伤伤口变得更深，伤口细菌定植的可能性增加。我们还证明，细菌定植伤口是活的，并在伤口中生长的基础上，随着时间的增加生物发光在体内。由于这里使用的生物发光生物体已经通过基因工程产生了细菌荧光素酶和它的底物癸醛，增加的生物发光信号意味着增加了组织中的细菌生长，这是我们证实的事实(Hamrahi，未发表的观察)。

我们目前的组织学结果表明，改变背侧皮肤暴露于90°C水中的时间会导致损伤程度增加，其中9秒暴露对下层肌肉层造成的损伤深度最大。据推测，高温导致了基质的变性和组织的完全紊乱，从而增加了血源性物质向伤口床的渗漏。

在这项研究中，我们观察到6秒烧伤导致50%的死亡，9秒烧伤导致80%的死亡普罗透斯-奇异君子兰和铜绿假单胞菌来华的老鼠。人们相信，毒性p .奇异君子兰和铜绿假单胞菌是可以比较的，但有一些不同的机制。为p .奇异君子兰其显著的运动性或“群集能力”使其能够穿透组织到达血流。为铜绿假单胞菌它显著表达一系列组织破坏性酶（蛋白酶和脂肪酶），使其能够通过在组织中形成一条路径而不是游过现有的缝隙，从而进入血液。

我们没有比较存活到24 h的动物和死亡之前的动物在不同时间点的生物发光面积，以确定早期传播和死亡之间是否存在相关性。原因是为了测量生物发光，动物必须被麻醉。对于严重烧伤的动物，额外的麻醉会导致死亡率增加。因此，我们没有做一项研究，以确定细菌的生物发光是否与烧伤小鼠的早期死亡相关。

来自脓肿的细菌在未受伤的大腿上增加烧伤痂的定植可能与组织通透性的改变、免疫功能的抑制或两者都有关。皮肤含有抗菌肽，这些抗菌肽在角质形成细胞、汗腺上皮、毛根和毛球细胞、血管内皮以及皮肤的更深部分表达[8].据报道，抗菌肽水平下降与烧伤有关[14]在本研究中，生物发光细菌对烧伤焦痂的定植与烧伤深度有关。

其他类型的细胞，包括树突细胞，也可能参与其中。未来的研究将应用免疫病理学来研究这种免疫抑制的机制。

研究还表明，烫伤后小鼠皮肤的渗透性增加[7］.我们用L-检测了烧伤后血管和组织的通透性¹⁸F-glucose [15，不进入细胞内，而是按简单扩散分布。因此，渗透率的变化会使L-积累增加¹⁸F-glucose。本研究中使用的小鼠背侧烧伤(90°C, 9秒)导致L-的积累显著增加¹⁸与未受伤的周围皮肤相比，f -葡萄糖含量增加，说明渗透性增加。

在腿部注射了生物发光细菌后，我们没有检查不同程度烧伤动物的血液，以确定血液中是否存在更多的生物发光细菌，这些细菌可能导致死亡率的增加。然而，当9秒烧伤小鼠的腹膜被打开时，内脏器官(肝脏和脾脏)有高水平的生物发光，这在假动物或轻度烧伤小鼠中没有观察到(数据未显示)。此外，抗生素环丙沙星阻止了生物发光细菌的生长，提高了存活率。因此，有可能假设9秒烧伤创面痂上的细菌定植增加至少部分与腿部脓肿中生长的生物发光细菌有关，这些细菌随后进入血液并扩散到全身。

总而言之，目前的数据表明，细菌定植可能是由于脓肿中生长的细菌迁移到烧伤伤口的远端和分离的结果。焦痂定植随烧伤深度增加而增加。该模型可用于研究与烧伤诱导的免疫抑制、创面细菌定植和烧伤严重程度有关的因素。此外，该模型还有助于进一步了解预防和治疗烧伤感染和烧伤败血症的分子机制。

致谢

本文由美国国立卫生研究院(NIH)资助。2 P50 GM21700-27A1和Shriners儿童医院补助金no. 28550, 8660, 8810和8690。Hamblin先生得到了NIH R01 AI050875的支持。

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