IPID 跨学科视角传染病 1687 - 7098 1687 - 708 x Hindawi出版公司 567140年 10.1155 / 2012/567140 567140年 研究文章 革兰氏阴性细菌感染在大腿脓肿可以迁移到遥远的根据烧伤深度烧伤 Hamrahi 维多利亚 1、2 汉布林 迈克尔·R。 3、4、5、6所示 荣格 沃尔特 1、7 便雅悯 约翰·B。 1 保罗 Kasie W。 1 Fischman 艾伦·J。 1 汤普金斯 罗纳德·G。 1、6、7、8 卡特 爱德华。 1、2、6 Marquart 玛丽E。 1 细菌学,后来医院的儿童 02114年波士顿 美国 shrinershq.org 2 儿科 哈佛医学院 02115年波士顿 美国 harvard.edu 3 Wellman光医学中心 马萨诸塞州综合医院 02114年波士顿 美国 harvard.edu 4 皮肤病学系 哈佛医学院 02115年波士顿 美国 harvard.edu 5 麻省理工大学的皮肤病、健康科学和技术 马萨诸塞州,剑桥02139 美国 mit.edu 6 儿科部门 马萨诸塞州综合医院 02115年波士顿 美国 harvard.edu 7 外科学系 哈佛医学院 02115年波士顿 美国 harvard.edu 8 创伤,Emergengcy手术和外科重症监护服务 马萨诸塞州综合医院 02114年波士顿 美国 harvard.edu 2012年 26 07年 2012年 2012年 16 02 2012年 02 04 2012年 2012年 版权©2012年维多利亚Hamrahi et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

脓毒症是严重烧伤患者死亡的主要原因。在目前的调查评估之间的交互烧伤不同严重程度和既存的遥远的感染。我们用革兰氏阴性细菌( 铜绿假单胞菌和 变形杆菌)转基因生物荧光,允许非侵入性,连续光学成像的范围和严重程度的感染。生物荧光细菌从皮下脓肿的腿迁移到遥远的烧伤伤口背面根据烧伤损伤的严重程度,这迁移导致小鼠的死亡率增加。和环丙沙星治疗,注射的腿与细菌感染或燃烧焦痂,阻止这种殖民的伤口和降低死亡率。目前的数据表明,烧伤的伤口很容易被感染殖民遥远的从伤口本身。

 1。介绍

感染是最常见和最严重的并发症主要烧伤,烧伤损伤的大小和严重程度有关( 1]。目前,脓毒症占50 - 60%的死亡在烧伤患者尽管抗菌疗法的主要改进。微生物殖民开放烧伤伤口通常是年底建立第一个星期受伤后( 1尽管抗菌药物的使用。如果细菌密度了宿主的免疫防御系统,侵入性烧伤脓毒症就会随之降低。烧伤伤口变成殖民地由细菌部分原因是皮肤屏障功能的损失,还有一部分是由于烧伤创面有很少或根本没有血管,防止血源性细胞的抗菌作用宿主的免疫系统。

烧伤损伤导致抑制免疫反应的几乎所有方面的 2]。Postburn血清免疫球蛋白水平、纤连蛋白和补充减少,还有一个减少调理素作用的细菌的能力。中性粒细胞的趋化、吞噬作用和杀功能,单核细胞和巨噬细胞受损。粒细胞减少燃烧后损伤很常见。细胞免疫应答受损,就是明证同种异体移植物排斥反应迟缓,无力常见的抗原,受损的淋巴细胞有丝分裂发生,改变混合淋巴细胞反应。烧伤损伤导致减少白介素2(2)生产、t细胞和NK细胞的细胞毒性,助手-抑制t细胞比例(高铁)。

临床研究结果清楚地表明,燃烧大小深刻影响病人烧伤患者的免疫状态和生存 3- - - - - - 6]。的深度烧伤创面损伤也已被证明能够影响烧伤皮肤的渗透性( 7)和天然抗菌肽的内容,到处都是表示包括皮肤的深层部分( 8]。在目前的研究中,我们使用生物荧光细菌可以确定一个脓肿引起的这些微生物在一个位置(大腿)距离和远端上的烧伤创面背可能导致燃烧焦痂的殖民。我们的研究结果表明,燃烧焦痂成为殖民地从大腿的细菌注射的深度烧伤病人。增加殖民燃烧焦痂的细菌注入的大腿与死亡率增加有关,这可能是完全阻止抗生素环丙沙星。

 2。方法 2.1。烧伤病人

动物实验进行了下一个协议批准MGH委员会研究动物保健(IACUC)和NIH一致准则。男性cd -老鼠(查尔斯河,27 - 28日克,12个/组)被麻醉,背面刮,局限于聚碳酸酯模板暴露20%回溯。暴露面积是沉浸在90°C水浴,3、6或9秒,其次是复苏和2毫升生理盐水腹腔内。Sham-treated动物接受了同样的治疗,除了室温水使用。受伤后的老鼠回到笼子里24小时免费的食物和水。

 2.2。组织学

受伤后的一天,烧伤伤口检查和皮肤变化。皮肤伤口切除以及底层深处paraspinal肌肉。组织样本在一夜之间在10%福尔马林固定,切片,插入磁带,加工石蜡块microtome-sectioned 6-micron部分和光学显微镜沾染了)。彩色部分研究了烧伤病理,也用于测量的深度烧伤。

 2.3。生产生物荧光细菌的大腿脓肿

生物荧光 变形杆菌(Xen 44) 铜绿假单胞菌(Xen-4)(创建Xenogen集团的礼物,林荫,CA)被使用promoterless转座子突变,生成完整的勒克斯操纵子(luxCDABE)源自Photorhabdus luminescens所描述的其他地方( 9, 10]。细菌是一夜之间长大然后颗粒状,resuspended的新媒体,和稀释直到光学密度0.3已经实现,这在我们的实验室已经找到对应~ 106微生物/毫升。大约五百万个细菌在0.1毫升的生理盐水(皮下)注入燃烧或sham-treated动物的大腿受伤后两个小时。

燃烧在一组实验中老鼠用环丙沙星治疗(5毫克/公斤)注入到大腿的细菌或腹腔内同时细菌注入的大腿。

 2.4。生物荧光成像

生物荧光成像进行了在不同时期(20天在感染后3小时)根据实验协议。老鼠轻使用异氟烷麻醉和放置在成像室装有光线成像电荷耦合器件(CCD)(滨松光子学KK,布里奇沃特,新泽西)所描述的其他地方( 11]。所有照片被展示在相同的信号范围,以确保生物发光信号可以进行比较。

 2.5。统计分析

生存分析的数据log-rank (Mantel-Cox)方法。

 3所示。结果 3.1。宏观研究

虚假的控制和小鼠秒的燃烧总值显示任何宏观异常。小鼠大约消耗显示轻度红斑和一个三角形的暗红色变色的焦点。6秒的小鼠烧伤显示轻度红斑和肿胀,片状红斑的深层肌肉,和皮肤肌肉粘连。9秒烧伤小鼠显示肿胀,与著名的椭圆形边缘暗变色,大面积皮肤牢牢地附着在深层肌肉。

 3.2。组织病理学研究

图 1显示代表)的部分sham-treated老鼠和老鼠,3、6、9秒烧伤。秒的燃烧的老鼠显示坏死,仅限于表皮。小鼠大约烧脂carnosus显示损伤扩展。6秒燃烧的老鼠显示深度损伤扩展到表面的深层肌肉。这深深的伤害也见过9秒燃烧的老鼠,但也有重要的深层肌肉损伤。

组织学的烧伤伤口有不同的曝光时间。组织准备从正常sham-treated皮肤或烧伤后不同曝光时间90°C水。

图 2显示了一个图的计算燃烧燃烧伤害的深度和时间不同的燃烧时间曝光。秒的燃烧是局限于表皮(20微米)。3秒钟燃烧的损害扩大到约500微米。损坏的6 - 9秒燃烧扩展1000至1500微米深入骨骼肌。

不同曝光时间对燃烧的影响深度。燃烧的深度决定于组织显微镜下组织学分析。字母a, b, c代表组织学从三个不同的老鼠。

 3.3。细菌感染24小时存活率的影响

24小时后没有死亡sham-treated老鼠,虚假的老鼠的腿注射 p .奇异君子兰或 铜绿假单胞菌老鼠被秒,3秒钟,6秒,9秒燃烧没有感染,或者老鼠受到秒和3秒钟烧伤和注射的腿 p .奇异君子兰或 铜绿假单胞菌。然而,死亡率增加小鼠6秒或9秒燃烧时注入的大腿 p .奇异君子兰或 铜绿假单胞菌细菌有50%或更多的老鼠被24小时后小鼠6秒烧伤和80%小鼠9秒伯恩斯(图 3)。这些结果为6秒和9秒的燃烧与受感染组统计学意义( P < 0.001 )由Log-Rank (Mantel-Cox)方法比其他群体。6秒的烧伤感染的结果具有统计学意义从9秒烧伤感染( P < 0.01 )。环丙沙星,注入的腿与细菌注入,或燃烧焦痂本身时细菌注入,降低小鼠的死亡率受9秒燃烧,细菌接种到零(图 3)。

存活曲线的老鼠与烧伤,没有细菌注射。12组小鼠受到骗局,燃烧,或大腿感染所描述的部分 2。每组的记录24小时的生存。 P * < 0.001 6秒+感染和9秒燃烧+感染与所有其他群体, P * * < 0.01 6秒+感染与9秒燃烧+感染。

 3.4。体内生物发光成像

图 4演示了一个典型的结果由注入 p .奇异君子兰的大腿sham-treated动物。我们可以看到有一个不同的生物发光信号可见在注射部位出现的在接种后24小时。这种生物科技继续增加达到最大值在感染后4天。随后,生物荧光逐渐减少,完全没有在接种后20天。类似的结果在动物注射 铜绿假单胞菌(数据没有显示)。任何时候在剃背任何生物荧光观察。

时间的 p .奇异君子兰sham-treated鼠标的增长。代表时间进程显示典型的生物发光信号,发达的腿sham-treated鼠标在20天。伪彩色的规模表明生物荧光的强度,更高的数字和粉红色对应于最高水平的生物发光和相对应的最低数量和紫色发光的最低水平。

图 5显示的结果 p .奇异君子兰或 铜绿假单胞菌注入的大腿烧伤小鼠24小时。1 - 3秒钟烧伤并没有导致生物发光燃烧焦痂,但是大约消耗导致了生物发光信号的大腿脓肿大于被秒的燃烧。皮肤接触到6或9秒燃烧显示增加生物发光信号的燃烧焦痂9秒的燃烧比,看到6秒的燃烧。也得到了类似的结果 铜绿假单胞菌(数据未显示) 。

不同烧伤深度对感染的影响 p .君子兰。老鼠被秒(表面),3(部分厚度),6秒(完整的厚度),或9秒(全厚度与底层肌肉损伤)暴露在90°C水,其次是注入发光 p .奇异君子兰在大腿和24小时后的成像。伪彩色的规模表明生物荧光的强度,更高的数字和粉红色对应于最高水平的生物发光和相对应的最低数量和紫色发光的最低水平。

如图 6,有一个显著增加小鼠的生物发光信号,收到了9秒燃烧注入紧随其后 铜绿假单胞菌在大腿从3到24小时。信号的大腿在7和9小时following-burn强度增加,在24小时内following-burn信号扩展到背燃烧焦痂。也观察到类似的结果动物注射 p .奇异君子兰(数据没有显示)。9秒烧伤小鼠感染的治疗 p .奇异君子兰或 p .奇异君子兰与环丙沙星与细菌或腹腔内注入到腿,防止焦痂的发展强烈的生物发光信号。结果有三个9秒烧伤小鼠感染 p .奇异君子兰的大腿,两个与环丙沙星治疗,在图所示 7。

时间生物荧光的老鼠受到9秒燃烧注入紧随其后 铜绿假单胞菌在大腿上。老鼠受到9秒燃烧,感染的大腿 铜绿假单胞菌和成像3、7、9、24小时后。伪彩色的规模表明生物荧光的强度,更高的数字和粉红色对应于最高水平的生物发光和相对应的最低数量和紫色发光的最低水平。

环丙沙星对发光的影响发展的焦痂的老鼠受到9秒燃烧在90°C注入紧随其后 变形杆菌在大腿上。三个老鼠受到9秒燃烧在90°C和注入生物荧光细菌的大腿。一个鼠标环丙沙星注入脓肿而第二个鼠标有环丙沙星intraperioneally注入。伪彩色的规模表明生物荧光的强度,更高的数字和粉红色对应于最高水平的生物发光和相对应的最低数量和紫色发光的最低水平。

 4所示。讨论

脓毒症仍然是主要因素导致烧伤患者的死亡率和发病率增加。烧伤创面提供一个很好的媒介细菌殖民化,部分原因是有一个减少燃烧产生的宿主免疫反应损伤,部分原因是变性的存在血液元素和坏死组织支持细菌生长。微生物的来源产生细菌殖民化伤口导致脓毒症的研究广泛,包括皮肤、肺、肠、和环境从我们实验室(未发表的结果)。

研究动物模型已用于确定肠道细菌是否能够把肠系膜淋巴结(mln),从而提供一个潜在来源的细菌殖民化的烧伤伤口( 12, 13]。这些研究表明,肠道细菌可以把MLN燃烧后受伤。然而,燃烧的污染伤口由肠道细菌也可以接触排泄物的结果在床单或调料的烧伤患者或床上用品材料在动物模型。尚不清楚这些研究与放射性标记如果转移还活着的细菌和微生物生长或只是隐藏在MLN易位。

在目前的研究中,我们评估是否细菌生长在没有受伤的腿脓肿远烧伤伤口可能导致烧伤伤口殖民。在这项研究中我们用发光细菌,微生物殖民烧伤伤口来自腿部脓肿。发光的优势微生物,大量研究表明,在体外或体内生物发光释放出这些细菌微生物的数量直接相关。

我们目前的数据表明,随着烧伤伤口变得更深,伤口的细菌殖民化的可能性增加。我们还证明了细菌殖民伤口还活着,在伤口的基础上增加生物发光体内。这里使用的发光生物以来转基因细菌荧光素酶及其底物生产癸醛,增加发光信号也意味着增加了细菌生长的组织,我们证实(Hamrahi,未发表的观察)。

我们目前组织学结果表明,不同时代的背侧皮肤的接触水平90°C水产生增加受伤的9秒曝光产生的最大深度损伤底层肌肉层。可能引起的热变性的矩阵和一个完整的组织的瓦解导致增加血液传播的物质泄漏到伤口上。

在这项研究中,我们观察到6秒燃烧导致死亡和9秒烧伤50% 80%死亡两个物种 普罗透斯-奇异君子兰和 铜绿假单胞菌来华的老鼠。相信的毒性 p .奇异君子兰和 铜绿假单胞菌类似,但由不同的机制。为 p .奇异君子兰看来,其非凡的运动性或“聚集能力”允许其穿透组织到达血液。为 铜绿假单胞菌其显著的表达一个数组的组织破坏酶(蛋白酶、脂酶)允许其进入血流通过开辟一条全新道路组织而不是游泳通过现有的缺口。

我们没有比较生物发光的区域在不同时间点之间的动物,一直延续到24 h和动物死在确定早期传播和死亡之间有相关性。原因是为了测量生物发光,动物麻醉。非常生病了动物,额外的麻醉会导致死亡率增加。因此,我们不做研究,以确定是否有相关的生物荧光细菌和早逝的燃烧的老鼠。

增加的原因殖民燃烧焦痂的细菌没有受伤的大腿脓肿的可能与组织渗透性的变化,抑制免疫功能,或两者兼而有之。的皮肤含有抗菌肽表达的角化细胞,汗管上皮细胞,细胞的头发根和头发灯泡,以及血管内皮的皮肤深水域 8]。水平的降低抗菌肽已报告与燃烧有关( 14]。在这项研究中,殖民燃烧焦痂的生物荧光细菌与烧伤的深度有关。

其他类型的细胞,包括树突细胞,也可能参与进来。免疫病理反应将被应用在未来的研究调查机制(s)的免疫抑制。

它也表明,老鼠的皮肤渗透性的增加与烫伤( 7]。我们已经检查了渗透率在脉管系统和组织使用L -燃烧产生的损伤18F-glucose [ 15),这不是运输到细胞,但根据简单扩散分布。因此,渗透率的变化会产生L -积累增加18F-glucose。本研究中使用的背烧损伤小鼠(90°C, 9秒)导致显著更高的L -积累18F-glucose比周围的皮肤,建议增加渗透率。

我们没有检查的血燃烧动物注射后不同程度的烧伤病人的生物荧光细菌进入腿来确定血液中如果有更多的生物荧光细菌可能导致死亡率上升。然而,当小鼠腹膜的9秒燃烧被打开,内脏器官(肝、脾)有一个高水平的生物发光并没有观察到的虚假的动物或老鼠较小程度的烧伤病人(数据没有显示)。此外,抗生素环丙沙星阻止生物荧光细菌的生长和提高生存。因此,可以假设增加细菌殖民化的9秒烧伤创面焦痂有关,至少在某种程度上,生物荧光细菌生长的腿脓肿,然后获得血液扩散到身体。

总的说来,目前的数据表明,细菌殖民化的烧伤伤口可能发生由于细菌生长在脓肿远端迁移和分离的烧伤伤口。焦痂殖民烧伤深度的增加而增加。这个模型可能是有用的在研究有关burn-induced免疫抑制因子(s),伤口细菌殖民化,燃烧伤害的严重程度。此外,该模型可以使分子机制的进一步了解烧伤感染和烧伤脓毒症的预防和治疗。

 确认

本文由国家卫生研究院批准号2 P50 GM21700-27A1后来儿童医院拨款。8550、8660、8810和8690。m·r·汉布林被NIH R01 AI050875支持。

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