化学产品最小化的里奇寄生虫诊断方法的适应性

摘要

拉丁美洲、非洲和亚洲的水媒寄生虫病广泛传播和流行率高，这有力地表明公共卫生系统的脆弱性。在这方面，寄生虫学分析是极为重要的工具。目前有几种寄生虫诊断方法，其中Ritchie的方法(1948)最为突出。该方法使用甲醛和乙醚，这两种具有毒理学重要性的试剂，可对环境和职业健康造成损害。目前的研究旨在比较经Régis Anécimo改良的不使用溶剂的Ritchie方法与巴西常规用于诊断蠕虫和原生动物的传统Ritchie方法。改进后的方法作了一些改进，如在粪便稀释后控制水温的升高，在材料离心观察寄生虫前用中性洗涤剂替代甲醛和醚。在两种方法检测的样本中，普遍观察到多重感染;改进后的方法对鉴定寄生虫具有相似的敏感性。开发能够最大限度减少乙醚和甲醛等化学产品使用的分析诊断方法，是在接触的专业人员中预防职业病以及通过使用清洁技术保护环境质量的重要工具。

1.介绍

在许多地区，肠道寄生虫因其大规模传播和高患病率而成为一个非常重要的医疗卫生问题。这是发展中国家的典型情况，考虑到基本卫生条件不稳定、环境因素易发性和人口中一个重要部分的不利社会经济条件，这些国家更倾向于病原体和宿主之间的相互关系[1］．

在发展中国家，最常见的蠕虫病是由肠道感染通过土壤传播的蠕虫引起的蛔虫和鞭虫trichiura，以及钩虫(美洲鳄和十二指肠钩虫) [2］．根据疾病控制和预防中心(CDC) [3.]，约有15亿人感染蛔虫， 11亿美元鞭虫trichiura钩虫13亿例，主要临床表现为肠梗阻、营养不良、缺铁所致贫血。据估计，分别有2亿人和4亿人寄主原生动物等贾第虫属duodenalis和痢疾阿米巴,引起腹泻和吸收不良的，其临床表现通常与个体所寄生的寄生虫量成正比[4- - - - - -6］．

对人体寄生虫的临床诊断通常伴随着实验室诊断，以确认怀疑。寄生虫学分析是这一领域极为相关的工具，因为它可以识别生活在人类消化道中的寄生虫，或利用粪便作为将其形态传播到外部环境的正常载体。在寄生虫学中，不同的诊断方法取决于每一种寄生虫，考虑到要检查的微生物的生物学和形态学的变异性。寄生虫学诊断有多种定性和定量方法，如Hofmman和Lutz的自发沉降法;浮士德离心浮选法;Ziehl Neelzen和Kato Katz的染色法和Ritchie的沉淀离心法[7，8］．

在上面提到的方法中，Ritchie的方法(1948)是突出的，它是基于一种公认的效率的方法，诊断蠕虫和原虫在粪便中通过甲醛醚系统离心沉降。甲醛和乙醚是两种对环境健康和职业健康都具有重要毒理学意义的试剂[9］．

这项研究的目的是比较用Ritchie的传统方法和改进的Ritchie方法诊断粪便中的蠕虫和原生动物，避免使用有毒溶剂。

2.材料和方法

2．1．的研究

这项研究是在São保罗大学临床病理学中心实验室的有机流体部门进行的，Ribeirão普雷托医学院，诊所医院，Ribeirão普雷托，São保罗，巴西。它被认为是São保罗州内陆最大的医院。每年，临床病理学实验室进行2,676,500次实验室检查(诊断和治疗支持)，354,700次专业检查，以及约8,000次寄生虫学检查[10］．

2．2.样品收集和分析程序

所有接受寄生虫学检查的患者都接受了一名受检者收集粪便样本，并标记他们的姓名和登记号码。患者在家中收集材料，第二天送到诊所医院的收集室，然后转到有机液体实验室。共对392个样品进行了Hoffmann自发沉降法处理和检测[11]及浮士德硫酸锌离心浮选法[12]用来鉴定虫卵、包囊和幼虫。Hoffman法将约2 g粪便样本在蒸馏水中均质，用纱布过滤，静置24小时。沉淀物用于观察。Faust法中，约2 g粪便样品在蒸馏水(10 mL)中均质，并在锥形管中以2500 rpm离心1分钟。重复离心过程，直到溶液变清。然后，将溶液重新悬浮在ZnSO中₄(33%)和离心机。收集并观察表面膜。沉淀物和表面薄膜样品均用lugol染色，在尼康Eclipse E200显微镜下观察。积极的样品()用于与Ritchie方法的比较分析[9]和Ritchie的方法。

Ritchie的方法经Régis Anécimo改进，是一种肥皂温水离心沉淀法。该技术是在45°C的条件下，将约2g粪便悬浮在10ml水中。样本均质，并在漏斗的帮助下通过折叠的纱布过滤(毫米)。然后，以2500 rpm离心1分钟;清除上清。用中性洗涤剂重悬沉淀物(100μL)在45°C下与10 mL水混合，均质，并以2500 rpm离心1分钟。将一滴沉淀物滴在1-2滴lugol的叶片上，用尼康Eclipse E200光学显微镜分别放大100倍和400倍观察。使用Zeizz AxioVision Scope A1显微镜生成数字图像。

2．3.统计分析

对于结果的统计分析，使用Graph Pad Prism统计程序(Windows 3.02版本，Graph Pad Software, San Diego, CA, USA)。采用Mann-Whitney非参数检验。显著性水平设为．

3.结果与讨论

表格1显示了根据Ritchie的方法和Ritchie的方法发现的寄生虫的百分比。在两种方法检测的样本中通常观察到多种感染。两种方法观察到的寄生虫百分比没有统计学差异(）.

图中给出了Ritchie方法与Régis Anécimo修正后的Ritchie方法鉴别的囊肿、卵和幼虫图像的定性比较1．通过对图像的观察表明，与传统方法相比，传统方法所引入的改进方法能够令人满意地识别寄生虫。中性清洁剂作为表面活性剂的分散剂，溶解粪便中存在的脂肪，使寄生虫结构得以识别，而不会造成形态扭曲。

自1948年Ritchie’s Method引入以来[9]，许多实验室已选择福尔马林醚浓缩程序进行粪便标本的寄生虫学检查。然而，考虑到接触乙醚和甲醛所造成的公认的危险，人们开始研究开发像里奇方法一样有效的技术。13，14］．

1979年，发明了一种方法，用乙酸乙酯代替乙醚，没有形态扭曲或改变，证明生物的浓度与乙醚相同或更高[15］．总的来说，乙酸乙酯似乎在生物体的数量和恢复标本的范围方面提高了程序的效率。乙酸乙酯比乙醚更能有效地集中包囊贾第虫属种虫害和h .娜娜，通常不能用原始方法恢复。

乙酸乙酯在回收生物体方面的效果与醚相似，而且它的优点是比醚的危险性更小。根据这些研究，乙酸乙酯似乎是一种常规使用的有效且毒性较小的溶剂。在禁止使用乙醚或危险的实验室，已建议用乙酸乙酯代替[15］．然而，它是一种对皮肤和眼睛有害和刺激的产品，并可能导致烧伤。长期重复接触可加重这些影响，并可损伤皮肤、粘膜和呼吸系统[16］．

乙酸乙酯还存在其他一些缺点:乙酸乙酯较厚的界面层难以去除，并出现小气泡，因此试剂在覆盖层下仍然不能溶解，掩盖了小生物。因此，验证了该方法在叶片上有残留，不利于寄生虫的鉴定，增加了阅读时间。

一些作者研究了d-柠檬烯(Hemo-De/4-异丙烯-1-甲基环己诺)溶剂，其比重和水溶性类似于乙酸乙酯[17］．在该研究中，使用乙醚、乙酸乙酯或d-柠檬烯对寄生虫学浓度方法进行了比较。d-柠檬烯和乙酸乙酯两种方法对肠道寄生虫的浓度效果相当。然而，作者强调了d-柠檬烯的使用，因为它无毒且可生物降解。此外，与甲醛和乙酸乙酯结合的方法相比，它的经济性为75% [17］．

最近，一种使用福尔马林-聚山梨醇酯20 (Tween 20)的方法发表了。结果表明，该方法比用福尔马林醚的方法效果更好。用聚山梨酯法进行鸡蛋鉴定，效果显著蛔虫；它也显示出类似的敏感性识别兰伯氏贾第虫，鞭虫trichiura，痢疾杆菌,痢疾阿米巴．但在原生动物类的鉴定中效果较差内阿米巴科娜娜,酵母菌属hominis［18］．该方法的另一个缺点是需要使用福尔马林，只能用聚山梨酯代替醚。

Ritchie方法的改进是基于消除化学产品的策略。文献中许多研究对传统方法进行了改进，证明了该方法在鉴别和还原化学产品方面具有良好的效率。然而，根据在本研究的规划和实现过程中发展起来的文献综述，没有一种方法能够从传统方法(里奇法)中完全消除化学产品。

Régis Anécimo改进后的Ritchie方法相对于其他方法有很大的优势，因为除了排除了Ritchie方法中使用的所有化学物质之外，它还提供了与传统方法相当的结果，包括鉴别类圆线虫属stercoralis，表现出向热水性，是线虫幼虫的典型特征[19］．因此，Régis Anécimo改进的Ritchie方法可用于临床分析实验室的寄生虫学诊断。

4.结论

开发能够最大限度减少乙醚和甲醛等化学产品使用的分析诊断方法，是在接触的专业人员中预防职业病以及通过使用清洁技术保护环境质量的重要工具。另一方面，开发尽量减少经济成本的技术是非常重要的，特别是对发展中国家来说，因为在这些国家，寄生虫病的流行程度较高，用于预防、控制和诊断的财政资源比较有限。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

承认

这项工作得到了FAPESP的部分支持。2009/50145-0)。

参考文献

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