来自墨西哥分离株的KINETOPLAST DNA分析利什曼虫(l)墨西哥

摘要

这项研究分析了墨西哥孤立株的DNA Minicirclesl .(利什曼虫)墨西哥寻找从弥漫性皮肤利什曼病(DCL)和局限性利什曼病(LCL)患者分离的菌株之间的遗传差异。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、限制性片段多态性(restriction fragment polymorphism, PCR- rflp)分析kDNA，对PCR产物进行测序。在PCR中采用针对亚属的引物莱山岛，墨西哥分离株的扩增产物高于其他分离株l .墨西哥菌株复杂且具有特异性引物l .墨西哥复杂的是，它们没有被很好地放大。在PCR-RFLP分析中采用Eco RV.那Hae III.,Mbo我墨西哥分离物显示出类似的限制模式，但不同于其他成员的模式l .墨西哥复杂。在系统发育树中，墨西哥克隆的kDNA序列分为两组，分别为LCD克隆和LCL克隆l .墨西哥复杂的成员。这些结果表明，墨西哥分离物的KDNA小碱基比其他成员的KDNA更多态l .墨西哥复合物和本研究中使用的限制性内切酶有不同的识别位点。

1.介绍

皮肤利什曼病(skin leishmaniasis, CL)是利什曼病最普遍的一种形式，可引起原发性局部皮肤病变(primary局部性皮损，LCL)，寄生虫可传播至鼻咽黏膜，并引起典型的粘膜-皮肤利什曼病(muccutaneous leishmaniasis, MCL)或以结节性皮损(nodular lesions, DCL)扩散至全身[1］．

美国皮肤利什曼病的特点是一个频谱的临床表现。这些包括拼箱造成的l .(利什曼虫)墨西哥， DCL引起l . amazonensis(利什曼虫)那l . venezuelensis(利什曼虫),和L.（Leishmania）PIFANOI，都属于利什曼虫墨西哥和MCL造成的成员Leishmania Braziliensis.复杂的 [2］．

墨西哥的皮肤利什曼病是具有广泛的地理分布的临床表现的高度现象。在流行区域中，LCL或MCL可以由两者的成员引起l .墨西哥和L. BAZILIENSIS.复合物[3.]，制作更准确的分析和识别莱山岛菌株是必需的，以便进行适当的治疗。

聚合酶链反应(PCR)方法已用于寄生虫DNA分析。一些PCR分子靶点已经被开发出来，包括小圆的动粒质体DNA (kDNA) [3.]，小外显子(剪接的leader RNA)基因[4.，以及gp63 PCR-RFLP [5.),等等。

Kinetoplast DNA含有大约800个碱基对（BP）约为10,000个细胞的细胞，大约200bp保守区域和大约600bp变量区域[6.那7.］．小圆的序列类是统一的，包含一个或几个高度保守区域(CR)。CRs中有三个高度保守块(CSB): CSB1 (GGGCGT)、CSB2 (CCCCGTTC)和CSB3 (GGGGTTGGTGTA)，称为通用小圆序列(UMS) [6.那7.］．小圆受到频繁的插入和删除，导致大小的多样性;可以观察到各种限制性内切酶识别位点的移除和插入，以及小圆整体大小的一些大小异质性[8.］．

在本研究中，分析了kDNA小型的分离株l . (l)墨西哥从DCL或LCS患者的皮肤病变，以确定特定的小型循环是否排除一个菌株莱山岛或者疾病临床表现的差异与任何特定的小圆类别有关。

2。材料和方法

2．1．莱山岛物种和文化条件

该研究经顾问德南·德·塞康省Biongicas，墨西哥Insciento Politecnico Nacional，墨西哥伦理委员会的审查和批准，涉及涉及人类受试者的国际伦理研究（Ley General De Salud，Mexico）。

这项研究是用7个墨西哥分离的l . (l)墨西哥来自墨西哥不同州的多发性非溃疡性结节性皮损(DCL)或白蛉叮咬部位出现溃疡性皮损(LCL)的患者(图)1），在获得知情同意后包含。对于寄生物分离，在接受治疗患者之前从皮肤病变的边缘取自针吸血物。墨西哥孤立ate被送到伦敦热带医学和卫生（英国）的学校，以进行同工酶表征。参考菌株的成员l .墨西哥复杂也包括在内（表1）.

菌株莱山岛在含有10%胎牛血清的RPMI培养基中，28°C培养。

2．2．DNA提取

DNA制备，如别处所述[3.)，通过离心^9.指数生长阶段的寄生虫在1900克条件下培养10分钟。球团用1 mL NET 100 (100 mMTris-HCl, pH 8.0;100毫米EDTA;4 . SDS含量为1%μ加入10mg /mL蛋白酶K (Sigma)， 37°C孵育过夜，然后两次苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀。提取的DNA用70%乙醇洗涤，100分溶解μL蒸馏水，在使用前保持在−70°C。

2.3。聚合酶链反应

通用引物AJS1 (GGGGTTGGTGTAAAATAG)和DeB8 (CCAGTTTCCCGCCCCG)，专为kDNA小圆莱山岛亚属(9.]，以及M1 (CCAGTTTCGAGCCCCGGAG)和M2 (GGTGTAAAATAGGGCCGGATGCTC)引物，特异性用于微圆l .墨西哥复杂的 [10.用于扩增来自参考菌株和墨西哥分离株的KDNA．如其他地方所述进行PCR扩增[9.那10.]，在每个0.2 mM的脱氧核糖核酸(Invitrogen Life Technologies，卡尔斯伯德，CA, USA)溶液中，每种特定引物50 pmol, 2.5个单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)， 100 ng DNA模板，1.5 mM的MgCl₂在最终体积为100 μL.样品在96℃下变性6分钟。PCR（35次循环）由60℃的退火组成，对于AJS1和DEB8引物，对于M1和M2引物为67.5℃，在72℃下延伸1分钟，并在72℃下的最终延伸持续10分钟 -Elmer模型2400热循环仪（Perkin Elmer，Roche Solulular Systems Inc.，Brancbourg，NJ，美国）。PCR产品（10 μL)在1%琼脂糖或8%丙烯酰胺凝胶中电泳分离(90 mM tris - hcl pH 8.3, 90 mM硼酸和2 mM EDTA)，溴化乙酯染色(50 g/mL)，并在透射器下观察(SIGMA Chemical Co.， St. Louis, MO, USA)。

2．4．kDNA限制性片段多态性分析

用AJS1和DEB8引物获得的KDNA扩增子莱山岛参考毒株和墨西哥分离株用BAM嗨那Eco RV.那Hae III.那后第三那Kpn我那Mbo我那Mse我那Msp我,XBA I.内切酶(Gibco BRL)。这些限制是按照供应商的指示执行的，简单地说:10μG PCR产品，2.5 μL的对应缓冲液，10 u的核核酸酶的最终体积为25 μ将L在37℃下孵育2小时;这Taq I.在67℃下孵育。如上所述通过电泳分析反应。

2．5．墨西哥分离毒株小圆圈测序

kDNA的扩增子的墨西哥隔离,MC(从病人拼箱),和GS(从病人DCL)获得与AJS1 DeB8引物凝胶纯化使用卡塔尔投资局快速凝胶萃取设备(试剂盒、德国),结扎成一个助教克隆载体(pCR II向量)(生命表达载体技术),并转换为大肠杆菌发票αF”。使用Wizard Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega Corporation, Madison, WI, USA)提取质粒DNA并测序。核苷酸序列采用双脱氧核苷酸链终止序列试剂盒(ABI PRISM Dye Terminator Cyclers Sequencing Ready Reaction kit, Perkin Elmer)和ABI PRISM m310基因分析仪自动测序仪(Perkin Elmer)测定。

2．6．序列比对和系统发育分析

序列是用DNAMAN、Chromas 2.0版本和Seaview软件编辑的[11.］．使用Clustal-X Ver对齐多个序列。1.83 [12.］．采用邻居连接法构建无根系统发育树[13.[Clustal-X程序。使用Kimura的两参数方法计算进化距离[14.]，用Mega（分子进化遗传学分析），版本3.1。[15.］．总共1000个引导复制用于邻居加入分析以获得内部节点的相对支持。将KDNA序列数据与其他成员的序列进行比较l .墨西哥之前发表在GenBank上的复杂信息。

结果

特异性PCR莱山岛利用AJS1和DeB8引物进行亚属扩增，得到了该菌株的kDNAl . (l)墨西哥BEL21和l . (l)墨西哥M379，参考菌株和墨西哥分离株（车道6-12），给出700至870bp扩增带;l . amazonensis (l)M2269和PH8以及l . garnhami (l)HM76和JAP78的条带小于700 bp(图2）.

特异性PCRl .墨西哥复合物，具有引物M1和M2，导致扩增l . amazonensis (l)参考菌株，得到700 bp扩增条带;其他参考菌株的条带为800 bp。墨西哥分离株扩增不良，条带为680 bp(数据未显示)。

限制性长度多态性分析。在kDNA内切酶的酶切中Eco RV.墨西哥分离株的核酸内切酶为6条带(6-12条链)l . (l)墨西哥Bel21展示了8个乐队(第5道)，另一个莱山岛结果显示有两条条带，部分条带不受限制(图3.）.和Hae III.墨西哥分离株都表现出相同的模式，即在长度上有几个条带l .墨西哥复杂的参比菌株也显示了几个条带的限制模式，但大小不同(数据未显示)。和Mbo我，所有墨西哥分离株均表现出相似的双条带限制模式(6-12通道)莱山岛参考菌株显示了两种或四个频段的图案（图4.）.与之XBA I.仅仅，墨西哥分离株被限制显示数条带长的模式(数据未显示);这后第三那MSPI.,Spe我内切核酸酶仅限于某些菌株，但不是墨西哥分离株（数据未显示）。这BAM嗨和Kpn我内切酶不消化任何莱山岛菌株(数据未显示)。

在墨西哥分离株的KDNA小刻录物的克隆和测序中，获得了七个小型克隆葡萄序列，来自LCL中的5个孤立的5个，来自DCL（数据未显示的数据）。所有七个克隆在其保守的部分中表现出高同源性，呈现高度被称为通用Minicircle序列（UMS）（Shlomai，2004）的保守区块CSB3（GGGGTGGTA），但在第19组已经发现了两组小组序列（LCL6，LCL14和LCD15），这是一个757-759 BP（LCL6，LCL14和LCD15）ACTCCTGGatt图案，790至791 BP组（LCD7，LCL17，LCL5和LCL4），其呈现TATCCTCTCCT主题。这两组序列的比较显示了沿KDNA Minicircle沿线缺失和BP的缺失和取代的差异（图5.）.

基于墨西哥分离株的KDNA Minirlate和其他成员的序列对准l .墨西哥构建了复杂的系统发育树。共识树显示出九种分组。LCL和DCL墨西哥无性系形成第一和第二组。另外两组由无性系形成l . (l)墨西哥从国际压力．另外两组由l . amazonensis (l)和l . (l)墨西哥克隆。另一个节点由两组组成，包括仅l . amazonensis (l)克隆。最后一个群体是由克隆的l . (l)墨西哥（数字6.）.

4.讨论

在kDNA的扩增中，引物特异性为莱山岛亚属，墨西哥分离株的PCR产物分子量略高于L.（L.）墨西哥人M379，L. (L.) mexicana Bel21那l . amazonensis (l),l . pifanoi (l)参考株PCR产物(图2）.另一方面，有了特定的引物l .墨西哥复杂的墨西哥隔离物没有一个像其他成员一样被适当放大l .墨西哥复杂已经(数据未显示)。这些结果可能是由于特定的引物莱山岛子树具有墨西哥分离物的UMS序列，并且M1和M2引物的序列与墨西哥分离株的同源性较少，而不是与其他成员l .墨西哥表明墨西哥分离株的kDNA小圈与其他分离株的kDNA小圈不同l .墨西哥复杂。

有趣的是，墨西哥分离菌被Eco RV.（数字3.)，Hae III.（数据未显示），和Mbo我内切核酸酶（图4.)的消化模式与其他成员的消化模式完全不同l .墨西哥复杂。此外，与XBA I.仅限墨西哥分离株的内切酶(数据未显示)。这些结果表明墨西哥分离株的kDNA小圈比其他成员的kDNA更具有多态性l .墨西哥对本研究中使用的几种限制性内切酶具有不同的识别位点。此外，kDNA的PRC-RFLP研究[16.在墨西哥分离株中发现了六种基本的消化模式l . (l)墨西哥这与为其他成员显示的消化模式不同l .墨西哥复杂的参考菌株。

墨西哥分离株的小圆克隆序列分两个类群，每个类群包括DCL和LCL克隆，表明一个特定的小圆类群并不排斥一个品系利什曼虫,此外，疾病的不同临床表现(LCL或DCL)与任何特定的小圆类别无关(图)5.）.将这些序列与其他成员的序列进行比较l .墨西哥复杂，观察到它们没有广泛的序列同源性。这些结果与Barker的研究一致[17.]，表明主要配合物的代表性菌株的小圆莱山岛不要共享广泛的序列同源性。

在用这些序列构建的系统发育树中，其他成员l .墨西哥复杂形成的团体,l . (l)墨西哥和l . amazonensis (l)除了与墨西哥克隆完全形成的组外的克隆。这些可能表明墨西哥分离株具有与其他成员不同的序列类l .墨西哥复杂孤立在其他国家(图6.）.

另一方面，Gutiérrez-Solar等人[18.]发现地理上分离的分离株之间的小圈比同一种群的小圈具有更大的同源性。在人类物种中莱山岛，罗杰斯和wirth [19.[仅在地理上相关分离株的小型内描述高度均匀的序列。

另一方面，在研究中l . amazonensis (l)李等[20.发现，选择某些次要的小型循环序列以复制并替代主要类型的小型型，并成为主要类型。

虽然莱山岛kDNA具有很强的多态性，PCR检测kDNA是一种非常有用和敏感的检测方法l . donovani患者皮肤活检标本中的基因，建议作为PKDL的确认诊断工具[21.]，以及皮肤分离物的特征莱山岛通过同工酶键入与KDNA限制分析相结合[22.］．

总之，似乎Minicircle类可能会在KDNA网络中改变[8.］．我们不能说kDNA网络中的一个或另一个小圈序列类是永久性的，或者是典型的致命或不那么致命的莱山岛该疾病的临床表现(LCL或DCL)与任何特定的小圆类无关。此外，这与它们的地理分布没有关系。

致谢

这项工作得到了墨西哥国立理工学院研究生调查秘书处的财政支持。A. Monroy-Ostria和F. Martínez-Gómez由CONACyT, EDI和COFAA IPN，墨西哥赞助。

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