本研究分析了DNA minicircles墨西哥的隔离
l .(利什曼虫)墨西哥寻找不同菌株之间遗传差异与患者弥漫性皮肤(DCL)和局部(拼箱)利什曼病。分析了kDNA使用聚合酶链反应(PCR),限制片段的多态性分析PCR产品(PCR-RFLP)和PCR测序。在PCR引物特定亚属
利什曼虫,墨西哥隔离放大更高的产品
l .墨西哥复杂的菌株和与特定的引物
l .墨西哥复杂的他们很差的放大。PCR-RFLP分析
Eco房车,
有三世,
Mbo我限制内切酶,墨西哥隔离显示类似的模式,但不同的模式的其他成员
l .墨西哥复杂。在系统发育树中,墨西哥的kDNA序列克隆形成两组包括LCD或拼箱克隆序列,除了另一个
l .墨西哥复杂的成员。这些结果表明kDNA minicircles墨西哥分离比的kDNA多态的其他成员
l .墨西哥复杂而有不同的限制性内切酶的识别网站用于这项研究。
美国皮肤利什曼病的特点是一系列的临床表现。这些包括拼箱所致
l .(利什曼虫)墨西哥,DCL造成的
l . amazonensis(利什曼虫),
l . venezuelensis(利什曼虫),和
l . pifanoi(利什曼虫),都属于
利什曼虫墨西哥复杂,制程造成的
利什曼虫braziliensis复杂的(
2]。
皮肤利什曼病在墨西哥是非常流行和广泛的地理分布不同的临床表现。在流行地区,拼箱或制程可能由两个成员
l .墨西哥和
原虫配合物(
3),使更准确的分析和识别
利什曼虫菌株命令式的和适当的治疗可以服用。
在目前的研究中,分析kDNA minicircles隔离的
l . (l)墨西哥从皮肤损伤患者DCL或者拼箱是为了确定是否执行一个特定minicircle类是独家的
利什曼虫或疾病的临床表现差异有关任何特定minicircles类。
2。材料和方法2.1。< /斜体> <斜体>利什曼虫物种和文化条件
本研究回顾和伦理委员会批准Escuela Nacional de Ciencias Biologicas, Instituto Politecnico Nacional墨西哥,同意进行人体生物医学研究国际伦理指南(雷将军de Salud、墨西哥)。
七个墨西哥分离的研究
l . (l)墨西哥从患者多个nonulcerative结节性皮肤损伤(DCL)或溃疡性皮肤损伤发展的网站白蛉叮咬(拼箱)从不同的州在墨西哥(图
1),包括知情同意后。寄生虫隔离,针吸入来自边缘的皮肤病变之前,病人接受治疗。墨西哥隔离被送往伦敦政治经济学院为热带医学和卫生(英国)同工酶鉴定。参考株的成员
l .墨西哥复杂的还包括(表
1)。
墨西哥的隔离和参考菌株
利什曼虫
墨西哥复杂的用于本研究。
参考菌株
国际代码1
源
l。
(
l
。
)
墨西哥
MHOM / BZ / 62 / BEL21
1
l。
(
l
。
)
墨西哥
MHOM / BZ / 62 / M379
1
l。
(
l
。
)
amazonensis
IFLA / BR / 67 / PH8
1
l。
(
l
。
)
amazonensis
MHOM / BR / 73 / M2269
1
l。
(
l
。
)
garnhami
MHOM / VE / 75 / HM76
1
l。
(
l
。
)
garnhami
MHOM / VE / 76 / JAP78
1
l。
(
l
。
)
pifanoi
MHOM / VE / 57 / LL1
1
1:世界卫生组织
利什曼虫参考集合在伦敦卫生和热带医学学院,伦敦,英国。
墨西哥隔离2
起源
患者从拼箱
l。
(
l
。
)
墨西哥
人权组织MHOM / MX / 88 / JS(哭泣)
塔巴斯科
l。
(
l
。
)
墨西哥
人权组织MHOM / MX / 88 / MC (MC)
塔巴斯科
l。
(
l
。
)
墨西哥
MHOM / MX / 83 / UAYV (YUC)
坎佩切
从患者DCL
l。
(
l
。
)
墨西哥
MHOM / MX / 84 / ISET GS (GS)
塔巴斯科
l。
(
l
。
)
墨西哥
MHOM / MX / 85 / ISET高频(HF)
韦拉克鲁斯
l。
(
l
。
)
墨西哥
MHOM / MX / 92 /里边的点(点)
韦拉克鲁斯
l。
(
l
。
)
墨西哥
MHOM / MX / 92 / INDRE AG (AG)
塔巴斯科
2:西班牙de记录Referencia Epidemiologicos, Secretaria de Salud墨西哥。塔巴斯科辣酱油,韦拉克鲁斯和坎佩切州位于墨西哥东南部。
序列编辑DNAMAN,浓度2.0版本,和海景软件(
11]。多序列对齐使用Clustal-X版本。1.83 [
12]。构造了一个拔起种系发生树使用neighbor-joining方法(
13与Clustal-X程序)。进化距离计算使用木村的两个参数方法(
14),大型(分子进化遗传学分析),3.1版。(
15]。总共有1000引导复制用于neighbor-joining分析获得相对支持内部节点。kDNA序列数据的序列比较的其他成员
l .墨西哥复杂的先前发表在基因库。
3所示。结果
PCR的具体
利什曼虫亚属的表现与AJS1 DeB8引物导致kDNA的放大
l . (l)墨西哥BEL21和
l . (l)墨西哥M379、参考菌株和墨西哥隔离(通道6 - 12)给700到870个基点放大乐队;
l . amazonensis (l)M2269 PH8以及
l . garnhami (l)HM76 JAP78给乐队不到700个基点(图
2)。
PCR扩增引物的kDNA五角1和DeB 8。巷1,MWMX174三世;2,
l . granhami (l)JAP78;3,
l . granhami (l)HM76;4,
l . (l)墨西哥M379;5,
L . (L)墨西哥贝尔21;6,
L . (L)墨西哥呜咽;7,
l . (l)墨西哥YUC;8日,
l . (l)墨西哥MC;9日,
l . (l)墨西哥GS;10日,
l . (l)墨西哥心力衰竭;11日,
l . (l)墨西哥点;12日,
l . (l)墨西哥AG);13日,
l . amazonensis (l)M2269;14日,
l . amazonensis (l)PH8;15日,
l . pifanoi (l)不断化解。
PCR的具体
l .墨西哥复杂,引物M1和M2,导致的放大
l . amazonensis (l)参考压力,给700个基点放大乐队;其他参考菌株800个基点的乐队。墨西哥隔离放大很差,给680个基点乐队(数据未显示)。
PCR-RFLP分析核酸内切酶
Eco房车。巷1 MW X174
有三世;2,
l . garnhami (l)JAP78;3,
l . garnhami (l)HM76;4,
l . (l)墨西哥M379;5,
l . (l)墨西哥贝尔21;6,
l . (l)墨西哥呜咽;7,
l . (l)墨西哥YUC;8日,
l . (l)墨西哥MC;9日,
l . (l)墨西哥GS;10日,
l . (l)墨西哥心力衰竭;11日,
l . (l)墨西哥点;12日,
l . (l)墨西哥AG);13日,
l . amazonensis (l)M2269;14日,
l . amazonensis (l)PH8;15日,
l . pifanoi (l)LL1。
PCR-RFLP分析核酸内切酶
Mbo我。巷1 MW X174
有三世;2,
l . garnhami (l)JAP78;3,
l . garnhami (l)HM76;4,
l . (l)墨西哥M379;5,
l . (l)墨西哥贝尔21;6,
l . (l)墨西哥呜咽;7,
l . (l)墨西哥YUC;8日,
l . (l)墨西哥MC;9日,
l . (l)墨西哥GS;10日,
l . (l)墨西哥心力衰竭;11;
l . (l)墨西哥点;12日,
l . (l)墨西哥AG);13日,
l . amazonensis (l)M2269;14日,
l . amazonensis (l)PH8;15日,
l . pifanoi (l)LL1。
线条的kDNA minicircles序列类(从1到200个基点)。克隆的墨西哥隔离:LCL4、DCL7 LCL17, DCL15 LCL6, LCL14。序列的其他成员
利什曼虫墨西哥复杂的发表在资源库:
l .墨西哥Y07807、AF54187 Y145437;
l . amazonensis (l)米94090;
l . (l)墨西哥Z11551、Z11552 Z11554、Z11556 Z11549;
l . amazonensis (l)M21325, M 21327;
l . (l)墨西哥Z11553 Z11555。
基于序列比对kDNA minicircles墨西哥隔离和的其他成员
l .墨西哥复杂,构建系统发育树。共识树显示9个分组。第一和第二组由拼箱和DCL墨西哥克隆。两组形成克隆的
l . (l)墨西哥从国际压力
。另两组形成
l . amazonensis (l)和
l . (l)墨西哥克隆。另一个节点只与两组包括成立
l . amazonensis (l)克隆。最后一组形成的克隆
l . (l)墨西哥(图
6)。
系统发育树构建的序列kDNA minicircles。
利什曼虫墨西哥复杂的成员在theGenBank发表:
l . (l)墨西哥Y07807、AF54187 Y145437;
l . amazonensis (l)米94090;
l . (l)墨西哥Z11551、Z11552 Z11554、Z11556 Z11549;
l . amazonensis (l)M21325, M 21327;
l . (l)墨西哥Z11553 Z11555;克隆的
l . (l)墨西哥。墨西哥分离克隆:LCL4 DCL7,拼箱17日LCL5, DCL15 LCL6, LCL14。
4所示。讨论
放大的kDNA与特定的引物
利什曼虫亚属,墨西哥隔离显示PCR产物分子量比略高
l . (l)墨西哥M379,
l . (l)墨西哥Bel21,
l . amazonensis (l),
l . pifanoi (l)参考应变PCR产品(图
2)。另一方面,与特定的引物
l .墨西哥复杂的墨西哥隔离适当放大的其他成员
l .墨西哥复杂的(数据未显示)。这些结果可能是由于特定的引物
利什曼虫亚属的口头语序列做墨西哥隔离,和M1和M2引物的序列的墨西哥分离株同源性低于的其他成员
l .墨西哥复杂,表明kDNA minicircles墨西哥隔离不同的其他成员
l .墨西哥复杂。
有趣的是,墨西哥的隔离消化
Eco房车(图
3),
有三世(数据未显示)
Mbo我内切酶(图
4他们之间)显示类似的限制模式,完全不同于消化模式显示的其他成员
l .墨西哥复杂。此外,与
Xba我核酸内切酶只有墨西哥隔离限制(数据未显示)。这些结果清楚地表明,kDNA minicircles墨西哥分离比的kDNA多态的其他成员
l .墨西哥复杂而有不同的识别网站的多个限制性内切酶用于这项研究。此外,在研究PRC-RFLP kDNA [
16]发现六种基本消化模式在墨西哥的隔离
l . (l)墨西哥不同的消化模式显示的其他成员
l .墨西哥复杂的参考菌株。
墨西哥分离克隆序列类minicircles形成两组每组包括DCL和拼箱克隆,这表明一个特定minicircle类不是独家的应变
利什曼虫,此外不同疾病的临床表现(拼箱或DCL)与任何特定minicircle类(图
5)。比较这些序列的序列的其他成员
l .墨西哥复杂,这是观察到,他们没有广泛的序列同源性。这些结果同意巴克的研究(
17)显示的minicircles代表菌株的主要配合物
利什曼虫不共享丰富的序列同源性。
在这些序列的系统发育树构建的其他成员
l .墨西哥复杂形成的团体,
l . (l)墨西哥和
l . amazonensis (l)克隆除了专门与墨西哥克隆形成的团体。这可能表明墨西哥分离序列类的minicircles不同于其他的成员
l .墨西哥复杂的孤立的在其他国家(图
6)。
另一方面,Gutierrez-Solar et al。
18)发现minicircles之间的同源性地理上分隔隔离比minicircles相同的股票。在人类物种的
利什曼虫罗杰斯和Wirth [
19)描述高度均匀序列只在minicircles隔离相关的地理位置。
另一方面,在研究
l . amazonensis (l)对衣霉素,李et al。
20.)发现,某些小minicircle序列选择复制和替代的主要类型minicircles,成为主导。
虽然
利什曼虫kDNA非常多态,PCR kDNA分析是一个非常有用的和敏感的足够的检测
l . donovani基因在皮肤活检标本病人和建议作为PKDL[确认诊断工具
21),和皮肤的隔离的特征
利什曼虫通过同工酶类型结合kDNA限制分析(
22]。