有无细菌性阴道病的非怀孕非洲裔美国妇女微生物群落的时间变化

摘要

细菌性阴道病(BV)被描述为阴道内相对于乳酸菌的厌氧和兼性厌氧细菌数量的增加。这种社区转移的一些不良后果包括刺激、白色分泌物、升高的pH值和增加对性传播感染的易感性。虽然这种疾病的病因尚不明确，但BV与不良生殖和妊娠结局有关。为了描述阴道群落随时间变化的结构，我们使用16S rRNA基因测序，从7名女性的多点取样中确定了阴道群落的系统发育组成。我们发现，没有BV证据的女性有以乳酸菌为主的群落，在我们的采样周期内表现稳定，而BV患者有更大的多样性，随着时间的推移稳定性下降。此外,只有乳酸杆菌在BV阳性社区中发现。

1介绍

生物多样性和生态系统稳定性之间的关系在过去十年中得到了批判性的讨论和研究[1–10.］.大多数报告提供的证据表明，在面临压力时，更大的生物多样性导致更大的系统稳定性。为了解释生物多样性和稳定性之间的关系，人们建立了许多理论结构[三,11.,12.其中，生态系统内的高度生物多样性常常等同于某种程度的功能冗余。因此，在压力时期，如果有一定程度的冗余，物种的丧失并不是灾难性的。

微生物群落为研究这些关系提供了一个显著的系统。许多表面上稳定的微生物群落是由成百上千的物种组成的。值得注意的例子是人类肠道菌群，估计有500-600种[13.,14.]和土壤，估计有2000-3000种/克[15.］.在这两个群落中都检测到导致显著群落变化的扰动(例如，[16.])，但它们的稳定性没有经过仔细测量，生物多样性水平也没有与稳定性密切相关。有趣的是，Fernández等人[17.[描述了具有功能稳定性的生物反应器，但在整个实验中，社区的系统发育组合物中表达动力学。这与存在的物种之间的功能冗余程度一致，尽管社区内的系统发育转变保持整体过程。

从生物多样性稳定性争论的角度来看，阴道道是一个有趣的生态系统。在很大比例的女性中，阴道微生物群落相对简单，主要由一种或几种细菌组成乳酸杆菌[18.–23.］.然而，当这个简单的群落被细菌性阴道病(BV)所取代时，从乳酸菌的近单一培养向一个系统发育多样性数量级更大的群落转变，特别是对于革兰氏阳性厌氧菌[19.,24.–27.］.只有少数研究人员研究了BV阴性或阳性女性群体随时间的稳定性(例如，[28.,29.]）。

在本文所述的工作中，我们向非妊娠妇女提出阴道微生物群落的系统发育评估。从每月按照每月的时间表中取出多个样本，并且通过16S rRNA基因文库的比较序列分析确定了社区的系统发育组成。我们的目标是随着时间的推移比较BV阳性和BV阴性妇女的微生物群落结构，并检查多样性是否与更大的稳定性相关。

2.方法

2．1．研究样本

本研究中使用的阴道样本是作为停止阴道冲洗的小型随机临床试验（RCT）的一部分收集的。RCT的主要目标是评估四个月期间停止冲洗和在家数据收集方案的可接受性。次要目标包括描述整个研究期间是否存在BV，以及确定与BV相关的因素（如月经周期阶段、生活方式）。这项研究是在一所大学校园进行的，合格标准包括目前每月至少冲洗一次，并且没有怀孕。妇女在六周内登记，总样本量仅限于前45名合格妇女。在入学时，女性与校园诊所的研究人员会面，审查并签署同意书，并完成基线调查问卷。然后，受试者被随机分为两组，一组继续常规冲洗方式，另一组不进行阴道冲洗。在登记时，妇女自行收集两个拭子作为阴道微生物区系的基线数据。此后，研究参与者被要求完成一份每日日记，每周自行收集三次阴道拭子（一次在周末，两次分散在工作日），为期四个月。日记包括关于月经天数、性活动、避孕药使用、阴道冲洗、阴道症状、洗澡、淋浴、疾病、药物和压力水平的信息。日记本和幻灯片每周邮寄一次。参与者还每两周回到校园诊所，收集阴道拭子进行BV评估，并测量阴道pH值。每月收集一次额外的拭子，置于无菌生理盐水中，并在室温下冷冻−80^°C。

在目前的研究中，我们从随机对照试验中选取了7名女性的冷冻阴道液样本进行进一步研究。这七名女性都是非裔美国人，她们被分配到干预组(即要求避免阴道冲洗)，并报告说她们没有使用任何形式的激素避孕。为了便于比较，我们选择了7名女性中的5名，因为在整个4个月的随机对照试验中，她们的阴道涂片均为BV阴性;另外两名女性之所以被选中，是因为她们在同一研究期间经常表现出BV的迹象。从每个BV阴性女性的2-3个月阴道样本和4个BV阳性女性的月阴道样本中构建16S rRNA基因克隆库。

2．2．纽金特BV评分

一名接受Nugent法BV评分训练的微生物学家[30.]对所有阴道涂片进行评估，同时对随机分配和日记中的数据不知情。在之前一项由同一位微生物学家和第二位微生物学家进行的研究中，BV阳性的kappa（Nugent评分≥7） 与BV阴性涂片相比为0.81[31.］.Nugent评分范围为0 ~ 10，分数越高，说明革兰氏阴性需氧菌和革兰氏阳性厌氧菌较多，乳酸菌较少。Nugent评分0-3为BV阴性，4-6为中级，7-10为BV阳性。

2.3。DNA和PCR扩增的提取

使用MoBio土壤DNA提取试剂盒提取微生物DNA，如下所示。将冰冻阴道拭子浸泡在70%乙醇中过夜。从试管中取出尖端，并从试管侧面挤出残余乙醇。然后切断拭子尖端，将其放入MoBio提取管中，并储存在−20^°C之前提取。将乙醇洗涤液在10000 × g的微离心机中离心30分钟，所得到的颗粒在200中重悬μL水，并用拭子尖端转移到MoBio提取管中。组合的颗粒和拭子尖端通过打珠1.5分钟进行溶解，然后根据制造商的说明进行提取。该方案确保从样品中收集来自溶解细胞的游离DNA和来自完整细胞的DNA。Pilot25例患者的PCR反应 μL用细菌结构域特异性引物27F (5^′-aga GTT tga TCM TGG CTC ag-3^′)和1389R (5^′GTG tac aag-3^′）[32.］.PCR反应体积为25μ30 ng模板DNA。反应包含1X缓冲液(Invitrogen)， 1.5 mM氯化镁₂, 0.25 dNTPs和0.2毫米 μ每种引物和0.6单位Taq聚合酶（Invitrogen）的M。在95℃下，通过3分钟的初始变性开始循环^°C在95次45秒的25个周期^°C, 56度45秒^°C和1分钟在72^°C，然后在72分延长5分钟^°C. PCR产物经溴化乙锭染色琼脂糖凝胶分析。采用Invitrogen公司的TOPO克隆试剂盒克隆出相应大小的PCR产物。在密歇根州立大学的技术中心进行了筛选和测序。序列保存在GenBank中(EF364727 ~ EF365525(低Nugent分数)和EF365526 ~ EF366669(高Nugent分数))。

２.４.系统发育和统计分析

使用序列匹配工具将每个16S rRNA基因克隆与核糖体数据库项目II进行序列比较，确定初步的系统发育从属关系[33.].使用嵌合体检查程序检查嵌合体序列[34.[除去短于550个核苷酸的序列。将在Genbank核苷酸数据库中使用BLAST进行比较未清楚地分配的序列[35.］.序列基于ARB软件包中的16S rRNA基因序列数据库SSUJAN03对齐序列（http://www.arb-home.de/)使用快速对准工具[36.］.未对齐或排列模糊的核苷酸被手动校正。对于所有后续的分析，503明确地比对了119 - 638 in位置的核苷酸大肠杆菌被使用。

对于系统发育分析，当ARB数据库中没有确定密切相关的序列时，通过Genbank数据库的BLAST搜索找到亲属，并将其纳入ARB。系统发育树是使用邻居连接法和Felsenstein校正构建的。PAUP中的最小进化距离法^*用于相同数据的引导分析。

使用webLIBSHUFF版本0.96对每个库的PHYLIP格式的距离矩阵进行两两比较，测试库中的差异[37.，它结合了preLIBSHUFF [38.]和LIBSHUFF 1.22版本[39.].为了进一步的群落分析，使用DOTUR将序列分为操作分类单元（OTU）[39.].3%的距离用于定义OTU，以下称为OTU_0.03．16S rRNA基因序列3%的差异虽然有争议，但通常被认为代表物种水平的描述[40].对于每个参与者，结合两个、三个或四个克隆库，计算DOTUR计划中实施的Chao1丰富度和辛普森多样性（D）估计器。辛普森多样性指数计算为1D。一个OTU上的Chao1估计量_0.03截止值，可以被认为代表了环境中物种的估计数量。辛普森多样性指数是一个考虑了丰富度和均匀度（每个物种的数量）的估计值。为了获得OTU的定量度量_0.03利用SONS软件计算Yue和Clayton非参数最大似然法[41.］.

3.结果

在这项研究中选择的七名女性中，阴道pH值在4.0到5.8之间，正如预期的那样，当存在BV时，pH值最高（表1）1)。对大多数妇女来说，样本是在不同的月经周采集的。在BV阳性的妇女中，没有使用抗生素或抗真菌药物的报告，而且在阴道样本采集前一周性交很少。

我们评估了表中所述七名女性的微生物群落结构1使用16S rRNA基因文库。从低（5名女性和12名文库）和高（2名女性和8名文库）Nugent评分女性中总共构建了20个文库。共分析了1943个序列，文库大小为50到170个克隆（表1）1）.乳酸杆菌在17个文库中为数量优势属。在纽金特分数高的女性图书馆中，有三所由纤毛菌属/ Sneathia,普氏菌,和Megasphaera,分别。在厚壁菌门、细菌门、放线菌门、变形菌门和梭杆菌门中总共检测到28个属。在BV阳性的妇女中，检测到20个不同的属，而在BV阴性的妇女中仅鉴定出14个属（其中9个为单胎）。

数字1显示所有库中检测到的属的相对丰度。前12名社区组成概况代表了五名Nugent得分较低的女性个体的社区。这些群落以乳酸杆菌为主，通常占群落的91%或更高。唯一的例外是3a图书馆乳酸杆菌只有62%的无性系。

来自两名nugent得分高的女性的8个图书馆显示在图中社区组成概况的底部两行1这些发现的系统发育多样性比在努金特评分低的群落中发现的要多得多，这与努金特评分系统的形态学基础和先前记录的观察结果相一致[30.］.在这些文库中鉴定了10个属，这些属在低纽金特评分女性的文库中未被检测到。随着时间的推移，这些类别中的大多数都表现出相当大的波动性。例如，在女人#6中，属Megasphaera分别占A、B、C和D库的22%、3%、27%和10%。克隆数量的这种不规则变化也见于普雷沃菌属第7个女人。此外，随着时间的推移，乳酸菌在克隆数量上也具有挥发性，通常，在nugent得分较高的女性中，乳酸菌的数量大大减少。这与来自低纽金特评分样本的库形成了对比，在低纽金特评分样本中，随着时间的推移，乳酸杆菌的克隆数量通常是高的和恒定的。

为了量化这些多样性差异，我们对这些库应用了一套生态和统计测量(见表)2）.Simpson多样性指数显示出低nugent评分和高nugent评分群落之间至少有2倍的差异，Chao物种丰富度也显示出两者之间的显著差异。岳和克莱顿的分析[41.]衡量图书馆的相似性。在这个表中，我们计算了女性内部的库相似性，然后在Nugent评分范围内比较这些相似性。所有低Nugent评分的库具有较高的相似性(>79%)，而高Nugent评分的库具有较低的相似性(<44%)。通过对这些库的目视检查，很明显随着时间的推移，社区中存在着结构上的不稳定性。与比较3a和6d的群落结构相比，Nugent评分并没有揭示出系统发育组成的微妙之处。

具有高和低污染成分的参与者之间的微生物社区的分析表明，低污染评分女性的克隆大约95.0％（758分）是乳酸杆菌（表三）.在剩下的5%中，大多数被鉴定为链球菌(19个克隆)或假单胞菌(9个克隆)。属乳酸杆菌虽然乳酸菌只占总数的38.3%(438 / 1144)，但在纽金特分数高的参与者中，也包含了最多的其他属克隆。大多数剩下的无性系与属一起分组普雷沃菌属(17.3%),Megasphaera(15.7%),Atopobium(7.5%),Sneathia(7.3%),拨号(3.6%)和Cryptobacterium（2.4%）。只有Sneathia并非在所有八个图书馆中都一致存在（图1）.从纽金特分数较低的参与者身上没有获得任何属于这些属的克隆。

在两个纽金特分数高的参与者中，分布普雷沃菌属,Atopobium，和Cryptobacterium物种不同（图1）三).大多数普雷沃菌属参与者6分组的克隆二路普雷沃氏菌，而来自参与者7的人则与颊前置杆菌,体孢子虫和P. Disiens..类似地，参与者6的克隆数量大约是与之分组的克隆数量的三倍阴道阿托波氏菌与参与者7相比，参与者7的克隆数量大约是参与者7的三倍Cryptobacterium curtum比参与者6(图三）.参与者6和7的物种总体分布相似Megasphaera和拨号属。

如上所述，属于属的克隆乳酸杆菌无论Nugent得分如何，都是最丰富的。然而，Nugent得分较低的参与者具有多样性乳酸杆菌包括l .内心的,L.gasseri,l . crispatus,延森L.jensenii,l .鞘突（图2)，而nugent得分高的参与者的图书馆只包含l .内心的（图2）.

4.讨论

关于nugent评分低的女性的阴道社区结构，我们的结果与之前报道的研究相似[18.–20.,23.,42.］.所有社区都以乳酸杆菌SPP为主。在758中检测到五种不同的物种乳酸杆菌序列包括L. iners, L. gasseri, L. crispatus, L. jensenii,l .鞘突.有趣的是，我们没有检测到任何乳酸杆菌，除了l .内心的在BV阳性的女性中。类似的不对称分布的乳酸菌物种已被报道L.gasseri和l .内心的“彼此之间呈负相关”[43.]或与BV相关细菌呈正相关[44.］.我们的结果表明l .内心的可能更好地适应BV的多微生物状态，包括升高的pH值。

细菌性阴道病被描述为一种多微生物综合征[19.,21.,25.,45.,46的微生物多样性高于被认为以乳酸菌为主的健康基态。临床表现为白色分泌物，pH值和胺浓度增加，提示细胞出现，通过革兰氏染色检测阴道液涂片的微生物群落转移[19.,21.,24.–26.,45.,46］.类似于以前的工作（例如，[19.,47)，在BV阳性的受试者中发现了更大的物种多样性。在来自两名BV阳性女性的7个样本中，我们检测到了5个分支普雷沃菌属属，是我们图书馆中非乳酸菌属中最丰富的一个属普雷沃菌属在两个BV阳性的女性中检测到的支均存在，而在一个女性中仅存在3支。这可能反映了选择独特物种的宿主差异或在非饱和水平取样的后果。Magasphaera（2个枝条，180克隆），拨号（2个分支，41个克隆），Cryptobacterium（1个分支，27个克隆）Atopobium(1支，86个克隆)，eggerthella.(1个进化枝，21个克隆)加德纳菌属（1个疏蛋，7个克隆）也被检测到BV阳性女性中，尽管克隆数量不同。这些研究的令人惊讶的方面是BV阳性女性展现的克隆人口统计数据的波动性。这表明，在临床鉴定的女性的情况下，多样性的增加伴随着社区稳定的减少。尽管存在系统发育挥发性，但是社区功能仍然是恒定的，就像先前引用的生物反应器一样[17.]尽管如此，在我们的BV阳性女性中，与Nugent评分较低的女性相比，随着时间的推移，系统发育成分发生了显著变化。

在生物多样性和生态系统稳定性的讨论中考虑阴道群体是有趣的，部分原因是当群体处于最大的多样性时，在BV阳性的女性中，我们检测到人口不稳定。虽然人们似乎(多少)本能地将高生物多样性等同于适应性更强的生态系统;以前的工作人员得出的结论是，“没有这样武断的一般规则”[48,49］.事实上，梅指出，随机构建的生态系统“在受到干扰后比简单的生态系统更有可能失去物种”[49]此外，在另一篇论文中，可能会报告描述增长的简单非线性差分方程可以产生稳定的周期以及明显的混沌区域[50］.因此，我们观察到的BV正态下的群落不稳定性更可能是一个随机聚集的群落和/或生长曲线不重叠的种群组合的反映。

即使在临床治疗的情况下，BV也可以是顽皮的病症[25.,26.,46］.虽然微生物生态学的分子方法为目前的系统类型提供了相当深入的见解[18.–20.,23.,28.,42.,44.]，我们离阴道群落的完整生态描述还有一定距离，包括宿主基因型变异性、环境影响、包括真核生物、细菌和病毒在内的完整群落描述[51和物种之间的关键相互作用，更不用说普遍存在的营养来源和食物网[52］.令人鼓舞的是，一些研究人员已经发现某些细菌系统类型和BV之间存在很强的相关性(例如，[19.])此外，激素环境似乎影响阴道微生物区系，暴露于外源激素的妇女中BV的患病率较低就是证明[31.,53]以及在月经周期的第一周出现BV的比率较高[31.,54］.在这项研究中，我们特别选择了未接触外源性激素且BV评分一致(即主要为阴性/中度或主要为阳性)的女性，而不管月经周期的时间。此外，我们已经开始把这种综合症视为一个生态系统出现了偏差，目前正在努力确定导致社区转变的条件或事件[25.,26.,46］.虽然这种生态系统方法更复杂，但它可能比病原体捕猎更有效。

我们的报告是对长期取样的相对较少的女性的初步研究，其中群落结构是使用文化独立技术确定的。我们认识到PCR扩增和文库构建可能产生的潜在偏差[55]包括底漆偏见。后者特别关注，因为一些系统发育基团可以完全错过匹配的底漆。例如Frank等人。[56和Verhelst等[42.]最近证明检测到加德纳菌属，一个常与BV有关的属(例如，[42.])，受引物选择的强烈影响。而我们的底火确实在上升加德纳菌属序列的丰度可能受到引物偏倚的影响。然而，尽管存在这些限制，我们已经确定了序列中的大量多样性普雷沃菌属克隆、乳酸杆菌物种的不对称分布以及BV阳性妇女随着时间的推移的人口统计学变化。

承认

这项工作得到了密歇根州立大学（Michigan State University（MSU）的MICHIGAN基金会的蓝色横向蓝盾的补助金

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