IPID 跨学科视角传染病 1687 - 7098 1687 - 708 x Hindawi出版公司 181253年 10.1155 / 2008/181253 181253年 研究文章 时间改变微生物群落妊娠的非裔美国女性有和没有细菌性阴道炎 Wertz 约翰 1 Isaacs-Cosgrove 娜塔莎 2 Holzman 克劳迪亚 3 沼泽 特伦斯L。 2 布里顿 罗伯特。 1 生物学系 卡尔文学院 伯顿街3201号,S.E.大急流城 MI 49546 美国 calvin.edu 2 微生物学和分子遗传学 密歇根州立大学 密歇根州东兰辛48824 美国 msu.edu 3 部门的流行病学 密歇根州立大学 密歇根州东兰辛48824 美国 msu.edu 2008年 27 1 2009年 2008年 01 07年 2008年 27 10 2008年 2008年 版权©2008 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

细菌性阴道炎(BV)被描述为提高厌氧和兼性厌氧细菌的数量相对于在阴道乳酸杆菌。这个社区转变的一些不良后果包括刺激、白放电,pH值升高,对性传播感染的易感性增加。虽然这种病症的病因仍不清楚的,BV与不良生育和怀孕有关的结果。为了描述阴道社区的结构随着时间的推移,我们确定的系统构成阴道社区从七个女性在多个采样点使用16 s rRNA基因测序。我们发现没有证据表明女性BV社区由乳酸杆菌出现在我们的采样时间内稳定而BV有更大的多样性和稳定性降低加班。此外,只有 乳酸菌内心被发现在BV积极的社区。

1。介绍

生物多样性和生态系统稳定性之间的关系一直是批判性地讨论和研究在过去的十年中 1- - - - - - 10]。大多数报告提供了证据表明更大的生物多样性会导致更大的系统的稳定面临的压力。创建了一系列理论构造占生物多样性和稳定性之间的关系( 3, 11, 12]生态系统内生物多样性高经常等同于一定的功能冗余。因此在时间的压力,一个物种的丧失不是灾难性的水平的冗余。

微生物群落提供卓越的系统调查这些关系。许多明显稳定的微生物群落构建的成百上千的物种。著名的例子是人类肠道微生物区系与估计有500 - 600种( 13, 14)和土壤与估计有2000 - 3000种/克( 15]。扰动导致重大社会变化已发现在这两个社区(例如, 16]),但他们的稳定性没有仔细测量和生物多样性水平一直强劲与稳定。有趣的是,费尔南德斯et al。 17)描述了生物反应器与功能稳定但明显移动系统组成的社区在整个实验过程。这是符合一定的功能冗余物种存在,维护整个过程尽管系统在社区内变化。

从的角度biodiversity-stability辩论,阴道道是一个有趣的生态系统。在一个大比例的女性阴道微生物群落相对比较简单,主要由一个或多个物种 乳酸菌( 18- - - - - - 23]。然而,当这个简单的社区是细菌性阴道炎(BV)所取代,这种转变是在单一的乳酸菌与数量级社区系统发育多样性,特别是关于革兰氏阳性厌氧菌( 19, 24- - - - - - 27]。只有几个调查人员解决社区的稳定时间BV负面或BV积极的女性(例如, 28, 29日])。

这里描述的工作,我们现在的系统发育评估妊娠阴道微生物群落的女性。多个样本来自每个女人每月计划,系统组成的社区是由比较序列分析16 s rRNA基因的库。我们的目标是BV中的微生物群落结构比较积极和BV负面女性随着时间的推移,检查是否多样性与更大的稳定性。

2。方法 2.1。研究样本

阴道样本收集用于这项研究作为一个小的一部分,随机临床试验(RCT)的阴道冲洗停止。个随机对照试验的主要目标的可接受性评估冲洗停止在家和一个数据收集协议在4个月中。二级目标包括描述/ BV存在没有在整个研究期间,和确定因素与BV(如月经周期的阶段,生活方式)。这项研究是进行大学校园和合格标准包括冲洗目前每月至少一次,不是怀孕。妇女被登记在六个多星期的时间和总样本量仅限于第一个45合格的女人。在招生,女性会见了校园诊所的研究人员审查并签署同意书,并完成一个基线调查问卷。参与者被随机继续常规冲洗模式或避免阴道冲洗。在招生,女人镇定的基线数据的两个棉签在阴道微生物区系。之后,研究的参与者被要求完成每天的日记,赛尔夫收集每周三阴道拭子(一个周末和两个分布在工作日)为四个月。日记包含信息天的月经,性行为,避孕,阴道冲洗,阴道症状,洗澡,洗澡,疾病,药物,和压力水平。 Diary sheets and slides were returned by mail weekly. Participants also returned to the campus clinic every two weeks at which time a swab for BV assessment was collected and vaginal pH was measured. Once per month an additional swab was collected, placed in sterile saline and frozen at −80°C。

在目前的研究中,冷冻参加个随机对照试验的7名女性阴道分泌物样本选择深造。所有七个女性非裔美国人,他们被分配给干预组(即。,asked to refrain from vaginal douching) and reported that they did not use any form of hormone-based contraceptive. For comparison purposes, five of the seven women were selected because, throughout the four months of the RCT, all of their vaginal smears were negative for BV; the other two women were selected because they frequently showed evidence of BV during the same study period. Clone libraries of 16S rRNA genes were constructed from 2-3 monthly vaginal samples of each BV negative woman and 4 monthly samples from BV positive women.

2.2。纽金特BV的得分的

一个微生物学家BV(得分的纽金特的训练方法 30.)评估阴道涂片而盲法随机化分配和数据从日记。在之前的研究中使用相同的微生物学家和一个微生物学家,BV的kappa积极(纽金特得分≥7)与BV消极涂片结果是( 31日]。纽金特分数范围从0到10,得分越高表明更多的革兰氏阴性需氧菌和革兰氏阳性厌氧菌和乳酸杆菌的减少。纽金特得分0 - 3被认为是BV的负数,中间4 - 6,7 - 10 BV是正的。

2.3。提取DNA, PCR扩增

使用该款土壤微生物DNA提取DNA提取试剂盒如下。冷冻阴道拭子在一夜之间被浸泡在70%的乙醇。小费被撤管和残余乙醇挤出的管。拭子提示被切断并放置到该款提取管和储存在−20°C之前提取。乙醇清洗离心机30分钟在10000×g microfuge和由此产生的颗粒在200年resuspended μL的水和转移到该款提取管拭子小费。结合颗粒和棉签提示细胞溶解了珠打了1.5分钟,然后提取根据制造商的指示。这个协议确保包括免费的DNA来自细胞溶解细胞和DNA完整细胞收集的样本。飞行员25 PCR反应 μL使用细菌领域特定引物进行27 f (5aga GTT TGA中医TGG CTC AG-3)和1389 r (5agc GGC GGT GTG TAC AAG-3)[ 32]。PCR反应体积25岁 μ与30 L ng模板DNA。反应包含1 x缓冲区(表达载体),1.5毫米MgCl2,核苷酸的0.25毫米,0.2 μ每个引物和0.6米的单位Taq(表达载体)。自行车开始,最初的变性3分钟95°C 25 45秒的周期95紧随其后°在56 C, 45秒°在72 C和1分钟°在72 C,紧随其后的是一个5分钟的扩展°c . PCR产品分析了琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。反应与适当的大小PCR克隆克隆利用表达载体的威尼斯平底渔船装备产品。假定的克隆与插入采摘,MSU筛选和测序技术中心。序列沉积在基因库(EF364727 EF365525(低Nugent分数)和EF365526 EF366669(分数高Nugent))。

2.4。系统和统计分析

每16 s rRNA基因克隆被分配一个初步的系统发育关系通过序列比较核糖体数据库项目二使用序列匹配工具( 33]。序列检查不可理喻使用嵌合体检查程序( 34,比550个核苷酸序列较短的删除。序列没有明显在属级分配比较基因库核苷酸数据库使用爆炸[ 35]。基于二级结构序列对齐到16 s rRNA基因序列数据库ssuJan03 ARB软件包( http://www.arb-home.de/)使用快速对准器工具 36]。手动对齐或含糊不清地对齐核苷酸被纠正。503年所有后续分析,明确一致的核苷酸位置对应119年到638年 大肠杆菌被使用。

系统发育分析,密切相关的序列不确定在ARB数据库中,亲属被发现基因库的爆炸搜索数据库和纳入ARB。系统发育树构建使用neighbor-joining Felsenstein校正方法。PAUP最小进化距离的方法*用于引导分析相同的数据。

库被成对比较检验的差异PHYLIP-formatted距离矩阵为每个库使用webLIBSHUFF version 0.96 [ 37),结合preLIBSHUFF [ 38]和LIBSHUFF version 1.22 [ 39]。社区进行进一步分析,序列分为操作分类单元(辣子鸡)使用DOTUR [ 39]。3%的距离被用来定义一个OTU,和像OTU以后表示0.03。3%的16 s rRNA不同基因序列通常是,但有争议的是,被认为代表一个了解描述( 40]。对于每个参与者来说,2 -,3 -,或four-clone库结合,Chao1丰富性和辛普森多样性(D)估计计算DOTUR程序实现。辛普森多样性指数计算1 d。在一个OTU Chao1估计量,0.03截止,可以被认为代表估计数量的物种的环境。辛普森多样性指数是一个估计,考虑了丰富度和均匀度(每个物种的数量)。获得OTU的定量测量0.03库之间的相似采样相同的参与者,曰,克莱顿非参数最大似然法是计算使用的软件 41]。

3所示。结果

在七个妇女选择在这项研究中,阴道的pH值范围从4.0到5.8,正如所料,BV在场时pH值最高(表 1)。对于大多数女性来说,获得的样本在不同月经周。BV积极的女性,没有使用抗生素或抗真菌的报道,和性交阴道前一周样本中是罕见的。

相关的临床和16 s rRNA基因克隆库信息七参与这项研究。

参与者 图书馆 BV的分数 pH值 月经周期(周) 性交的频率(前一周) 抗生素、抗真菌(前一个月) 不。克隆的图书馆 主导phylotype的系统发育关系 主导phylotype图书馆(%)
1 1 0 4.4 2 0 没有 85年 乳酸菌crispatus 98年
1 b 1 4.4 3 0 没有 86年 l . crispatus 98年

2 2 0 4.0 4 0 抗生素 50 l . crispatus One hundred.
2 b 0 4.0 4 0 没有 91年 l . crispatus 99年

3 3 2 4.7 3 0 抗生素 53 加氏乳杆菌 62年
3 b 4 4.7 3 0 没有 58 l . gasseri 95年

4 4 1 4.4 4 4 抗真菌 79年 乳酸菌内心 99年
4 b 2 4.7 4 0 抗真菌 50 l .内心的 98年
4摄氏度 0 4.4 6 # 1 抗真菌 74年 l .内心的 99年

5 5 0 4.0 4 3 没有 53 l .内心的 91年
5 b 4 4.7 2 4 没有 60 l .内心的 98年
5度 0 * 5 # 0 没有 60 l . crispatus 93年

6 6 8 5.0 2 0 没有 147年 l .内心的 59
6 b 8 5.8 4 1 没有 170年 l .内心的 41
6摄氏度 8 5.8 3 0 没有 162年 纤毛菌属amnionii 36
6 d 4 4.0 5 # 0 没有 159年 l .内心的 76年

7 7一个 8 5.0 3 0 没有 119年 Megasphaerasp。 62年
7 b 9 5.0 3 0 没有 165年 l .内心的 54
7 c 8 5.5 2 1 没有 130年 l .内心的 35
7 d 8 5.5 1 0 没有 92年 普氏菌buccalis 40

*缺失的数据。

# 月经周期。

我们评估微生物群落的结构从表中描述的7名女性 1与16 s rRNA基因库。总共20图书馆是由两个低收入(5妇女和12库)和高-(2妇女和8库)纽金特得分女性。共有1943个序列进行了分析与图书馆从50到170克隆(表大小的 1)。 乳酸菌是数字图书馆的主要属17个。三个库的high-Nugent得分占主导地位的女性 纤毛菌属/ Sneathia,普氏菌, Megasphaera,分别。总共发现了28属在厚壁菌门,Bacteriodetes,放线菌,变形菌门,Fusobacteria类群。BV的积极的女人,只有发现了20个不同的属14个(其中9例单例)中标识BV消极的女性。

1礼物的相对丰度检测属的所有库。顶部12-community构成概要文件从五个人代表社区的女性low-Nugent分数。这些社区是由乳酸杆菌通常构成了社区的91%或更高。例外是图书馆3 乳酸菌构成了克隆人的只有62%。

饼图表示参与者之间的阴道微生物群落结构(从上到下),在每一个参与者,随着时间的推移(左到右)推断由16 s rRNA基因库。每个库的百分比的克隆相关成员组成 乳酸菌属。

八库来自两个女人得分high-Nugent介绍下面两行社区组成的概要图 1。这些披露更多的系统发育多样性比发现low-Nugent得分社区,符合纽金特得分系统的形态学基础和先前记录的观察 30.]。十个属中标识这些库中没有检测到图书馆low-Nugent得分女性。随着时间的推移这些属表现出相当大的波动。例如,在女人# 6,属 Megasphaera构成了22%,3%,27%,和10%的图书馆A, B, C和D,分别。这种不规则的通量克隆数量也在 普氏菌在7号的女人。此外,乳酸杆菌也在克隆数量随着时间的推移和挥发性,一般来说,女性的人数大大减少与high-Nugent分数。这与图书馆low-Nugent得分样本中乳酸杆菌在克隆数量经常高和持续时间。

量化这些我们应用一套生态多样性差异(表和统计测量这些库 2)。辛普森多样性指数低,显示至少有两个区别high-Nugent得分社区而曹国伟物种丰富度同样显示这两个族群之间的实质性差异。悦和克莱顿分析( 41]措施库相似之处。在这个表中,我们计算intra-woman库相似之处,然后比较这些跨Nugent分数的范围。所有图书馆低——纽金特分数高相似度(> 79%)而high-Nugent得分库相似性较低(< 44%)。在这些库的目视检查,很明显,随着时间的推移有社区结构不稳定。纽金特分数没有揭示微妙的系统演示了通过比较社会成分资料3和6 d。

BV的分数和多样性之间的关系,丰富和阴道微生物群落的稳定。

参与者1 BV的分数2 辛普森多样性(1 d) Chao1物种丰富度 图书馆相似度(%)3
1 (2) 0.5 0.15 7 97.0 ± 1。9
2 (2) 0 0.03 4 100.0 ± 0.1
3 (2) 3 0.38 14 79.1 ± 8.6
4 (3) 1 0.03 7 One hundred. ± 0.1
5 (3) 1。3 0.33 15 91.0 ± 5.0
6 (4) 7 0.75 27 43.1 ± 4.6
7 (4) 8.3 0.85 22 38.2 ± 6.9

1数字在括号表示的总数克隆库的参与者。

2BV的成绩表 1

3计算了悦,克莱顿的非参数极大似然估计量。值的±SE。

分析微生物群落和参与者之间的得分高,low-Nugent显示约95.0%(758 799)的克隆low-Nugent得分女性乳酸杆菌(表 3)。剩下的5%,大多数人认定为链球菌克隆(19)或假单胞菌(9克隆)。属 乳酸菌还包含了大多数的克隆其他属中确定参与者得分high-Nugent,尽管乳酸杆菌只占了38.3% (438 1144)。大部分剩余的克隆与属分组 普氏菌(17.3%), Megasphaera(15.7%), Atopobium(7.5%), Sneathia(7.3%), Dialister(3.6%)和 Cryptobacterium(2.4%)。其中,只有 Sneathia不是一直出现在所有八个库(图 1)。没有获得克隆这些属从参与者low-Nugent分数。

系统发育关系16 s rRNA基因的克隆获得参与者有或没有细菌性阴道炎。

1 参与者与BV 参与者没有BV
厚壁菌门
乳酸菌 438年 758年 1196年
Megasphaera 180年 0 180年
Dialister 41 0 41
链球菌 3 19 22
Acetivibrio 15 0 15
气球菌属 16 0 16
Micromonas 8 0 8
Gemella 5 1 6
韦永氏球菌属 0 2 2
Anaerococcus 1 1 2
Peptoniphilus 0 1 1
Helcococcus 1 0 1
葡萄球菌 0 1 1
Turicibacter 0 1 1

拟杆菌门
普氏菌2 198年 0 198年

放线菌
Atopobium 86年 0 86年
Cryptobacterium 27 0 27
Eggerthella 21 0 21
加德纳菌属 7 0 7
Mobiluncus 5 0 5

变形菌门
埃希氏杆菌属 0 1 30.
沙雷氏菌属 2 0 23
假单胞菌 6 9 15
Janthinobacterium 1 2 3
Ralstonia 0 1 1
Dechloromonas 0 1 1
克雷伯氏菌 0 1 1

Fusobacteria
Sneathia 83年 0 83年

1144年 799年 1943年
总OTU0.03 31日 19 46

1一般来说,克隆> 94% 16 s rRNA基因身份到最近的培养相对被认为属的成员。

2克隆的分组 普氏菌属有92 - 94%的16 s rRNA基因身份最亲密的培养相对的。

3操作分类单元(辣子鸡)计算截止97%的相似性。

在两个参与者high-Nugent分数,分布的 普氏菌, Atopobium, Cryptobacterium物种是不同的(图 3)。大部分的 普氏菌克隆从参与者6分组 普氏菌bivia7,而从参与者分组最密切 普氏菌buccalis, p . corporis p . disiens。同样,参与者6大约三倍的克隆数分组 Atopobium阴道比参与者7,而参与者7已经大约三次克隆分组的数量 Cryptobacterium curtum比参与者6(图 3)。两个参与者6和7中有类似的物种的总体布局 Megasphaera Dialister属。

正如上面提到的,属于属的克隆 乳酸菌是最丰富的,不管Nugent得分。然而,参与者得分low-Nugent的多样性 乳酸菌物种,其中包括 l .内心的, l . gasseri, l . crispatus, l . jensenii, l .鞘突(图 2)而从参与者得分high-Nugent只包含库 l .内心的(图 2)。

基于邻居加入1196年的发展史 乳酸菌这一研究获得的16 s rRNA基因克隆。克隆是密切相关 乳酸菌物种被浓缩进梯形。每组数字在括号中表示,克隆得到参与者的数量与细菌性阴道炎(左)和没有细菌性阴道炎(右)。503年发展史是基于明确一致的核苷酸。分支点和> 75%保护是用一个封闭的圆圈表示;分支点50 - 74%保护与开放的圆所示。参考物种基因库加入数字在括号中所示。一个16 s rRNA的基因 枯草芽孢杆菌作为外群。比例尺是0.1每核苷酸变化。

邻居joining-based发展史的16 s rRNA相关基因克隆细菌属始终出现在参与者与细菌性阴道炎。密切相关的克隆被浓缩进梯形与数字在括号中表示,对于每个组,克隆的数量从参与者获得6(左)和参与者7(右)。503年发展史是基于明确一致的核苷酸。分支点和> 75%保护由一个封闭的循环。参考物种基因库加入数字在括号中所示。一个16 s rRNA的基因 Aquifex pyrophilus作为外群。比例尺是0.1每核苷酸变化。

4所示。讨论

关于女性的阴道束群落结构low-Nugent分数,我们之前报道的研究结果相似( 18- - - - - - 20., 23, 42]。所有社区都是由乳酸菌spp。在758年发现了五个不同的物种 乳酸菌序列包括 l .内心l . gasseri l . crispatus l . jensenii, l .鞘突。有趣的是,我们未能发现任何乳酸菌sp.以外 l .内心的在BV积极的女性。类似的不对称分布的乳酸菌种类已报告 l . gasseri l .内心的彼此是“负相关”[ 43)或与BV-associated细菌呈正相关( 44]。我们的研究结果表明, l .内心的可能是BV的状态,更好的适应了幼童腹壁薄弱包括pH值升高。

细菌性阴道炎综合症[被描述为一个幼童腹壁薄弱 19, 21, 25, 45, 46)和微生物多样性高于被认为是健康的基态以乳酸杆菌为主。临床特点是一个白色的放电,pH值和胺浓度的增加,外观线索细胞,检测到微生物群落变化由从阴道分泌物涂片革兰氏染色剂 19, 21, 24- - - - - - 26, 45, 46]。类似于以前的工作(例如, 19, 47)我们发现更大的物种多样性的BV积极的主题。在我们7样本两个BV积极的女性,我们发现五个演化支 普氏菌属,最丰富的nonlactobacillus属存在于我们的图书馆。的两个 普氏菌演化支发现在场BV积极的女性在三个出现在只有一个。这可能反映了主机差异,选择独特的物种或抽样nonsaturating级别的后果。 Magasphaera(克隆演化支,180), Dialister(2演化支,41克隆), Cryptobacterium(1进化枝,27克隆) Atopobium(克隆进化枝,86), Eggerthella(1进化枝,21个克隆), 加德纳菌属(1进化枝,7克隆)也在BV发现积极的女性,虽然克隆数量是不同的。这些研究是令人惊奇的方面克隆人口随时间的波动表现出的BV积极的女性。这表明,对于女性临床发现BV,多样性的增加伴随着减少社区稳定。尽管系统可能波动,社区功能保持不变,如前面提到的生物反应器( 17]。其他的解释是可能的(见下文)。尽管如此,在我们的BV积极女性系统组成随时间发生了显著的变化与女性low-Nugent分数。

考虑阴道是有趣的社区的持续讨论生物多样性和生态系统的稳定,部分原因是人口不稳定的社区时,我们发现在其最大的多样性,BV的积极的女性。而似乎(有点)直观的高生物多样性等同于一个更具弹性的生态系统;以前的工人认为“没有这种任意一般规则”( 48, 49]。的确,可能指出随机构造生态系统扰动后“更有可能失去物种比简单的”( 49]。此外,在一个单独的纸可能报道,简单非线性差分方程描述的增长可以产生稳定的周期以及明显混乱的政权( 50]。因此,BV的社区不稳定积极的状态,我们观察到更能反映出一个随机聚集社区和/或复合的人群与不重叠的增长曲线。

BV是一个顽固的条件即使面对的临床治疗 25, 26, 46]。而分子微生物生态学的方法提供了相当大的洞察phylotypes礼物( 18- - - - - - 20., 23, 28, 42, 44),我们仍然有些遥远的从一个完整的生态阴道社区的描述,包括宿主基因型差异、环境影响、社区的完整描述,包括真核生物,细菌和病毒( 51)和关键物种之间的相互作用,更不用说普遍营养来源和食物网( 52]。令人鼓舞的是,一些研究人员已经确定了某些细菌之间的强相关性phylotypes和BV(例如,[ 19])。此外,激素环境似乎影响阴道微生物区系,证明了低患病率女性BV的接触外源激素( 31日, 53)和更高的患病率BV的月经周期第一周 31日, 54]。在这七个选择的研究参与者,我们特意选择了女性未曝光的外源激素,BV分数(即保持一致。,主要是负面/中间或主要是积极的)无论在月经周期时间。此外,我们已经将综合症视为一个生态系统失败,目前正在努力针对识别的条件或事件,引起社会变化( 25, 26, 46]。虽然这个生态系统方法更为复杂,它可能更有效率比病原体打猎。

我们的报告是一个初步的研究随着时间的推移,女性样本相对较少,群落结构是决定使用文化独立的技术。我们认识到潜在的偏见,第一时间从PCR扩增和图书馆建设 55)包括底漆的偏见。后者尤为令人担忧,因为可以完全错过了一些系统组织不匹配的引物。例如弗兰克et al。 56)和Verhelst et al。 42最近表明,检测 加德纳菌属,属经常与BV(例如, 42]),可以强烈影响引物的选择。而我们的底漆 加德纳菌属序列,丰度可能是影响底漆的偏见。然而,尽管有这些限制,我们已经确定了大量的多样性 普氏菌克隆,非对称分布的乳酸杆菌物种和大量人口随时间变化BV积极的女性。

承认

这项工作受到了来自密歇根蓝十字蓝盾基金会的资助和密歇根州立大学微生物发病中心(密歇根州立大学)。

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