甲醇提取物与香精油的联合作用Callistemon僵直(桃金娘科),赤桉(桃金娘科)anopheles gambiae.吉尔斯幼虫（Diptera：Culicidae）

摘要

植物源生物农药由于其对哺乳动物的低毒性、生物可降解性和靶向性，目前在蚊虫控制项目中受到积极鼓励。叶甲醇提取物和精油Callistemon僵直和赤桉单独评估，并组合第三次和第四龄幼虫anopheles gambiae.．根据世界卫生组织的标准方案，分别在125、250、500和1000ppm的剂量下对提取物进行单独和组合测试，精油在25、50、100和200的剂量下使用。阳性对照采用推荐剂量为1000ppm的商用杀虫剂Bi-one，阴性对照采用含0.5 ml甲醇的自来水溶液。在暴露24 h后记录幼虫的死亡率。结果显示，黄芩提取物对幼虫的死亡率为100%C. rigidus.E50%: C50%和E25%: C75%的组合以及阳性对照(1000ppm)。同样，两种植物及其组合的精油对幼虫的死亡率为100%。在各提取物与精油的组合中，只有E75%: C25%精油组合具有协同作用。因此，该植物的精油组合(E75%: C25%)E赤藓和C. rigidus.建议，以促进以天然杀生物剂的形式促进其对蚊虫幼虫的有效昆虫控制的形式的使用。

1.介绍

在撒哈拉以南非洲，疟疾仍然是最危险的疾病之一，每年造成数百万人死亡，5岁以下儿童、孕妇和艾滋病毒/艾滋病患者的病情最严重[1.]. 2017年，报告了约2.19亿例病例，记录了435000例死亡[2.］.由此引起的死亡疾病疟原虫spp寄生虫通过蚊虫属的蚊子叮咬传播给人类按蚊，以及蚊子的种类anopheles gambiae.吉尔斯是撒哈拉非洲国家疟疾的主要传染媒介。然而，目前的方法在达到疟疾施用疟疾时面临着患者中表达的药物副作用以及目前用于治疗中药物的寄生虫抗性的问题。此外，由于许多疟疾疫苗候选者（超过30个以上，因此不存在许可的疟疾疫苗疟原虫疟原虫疫苗）靶向寄生虫生命周期的血浆，血液或性阶段仍在临床试验中[3.,4.］.为此，载体控制仍然是降低人口中疾病传播速率的最佳方法。不幸的是，由于滥用农业和害虫控制方案的合成杀虫剂，导致环境污染的合成杀虫剂，昆虫载体控制也面临着许多困难，从而导致生态不平衡。具体地，使用中的合成杀虫剂不仅对人类毒性，而且对Nontarget生物体而不省略杀虫剂抗性的发展和新的害虫物种的重新训练[5.,6.]. 因此，近年来在世界各地，天然产品引起了研究人员的注意，以寻找新的替代解决方案，减少这些合成农药的过度使用。在自然界呈现的这些替代品中，植物源性产品尤其令人感兴趣，因为它们毒性较小，可生物降解，且具有针对性[7.–9]. 植物含有丰富的生物活性化学次级代谢产物，并通过杀虫或驱虫来证明其杀虫活性[10–13］.

原产于澳大利亚，属于桃金娘科，赤桉是一棵广泛分布在世界各地的大树。该植物精油富含含氧和非含氧单萜和倍半萜[14]. 以前，在该植物的不同部位有单宁、类黄酮、糖苷和甾醇的报道[15]. 以前的几项研究报告了这种杀虫剂的杀蚊活性赤桉对Culex pipiens.和按蚊stephensi蚊子种类[16–18］.

通常被称为硬瓶刷，Callistemon僵直(桃金女科)是一种浓密的树，有狭窄，尖，深色的叶子和粉红色的花，广泛发现只在澳大利亚和现在世界各地。桉油醇、黄酮、黄酮醇和三萜是植物精油中的主要成分C. rigidus.[19]而单宁和类黄酮则存在于植物的叶子中[20.]. 药物的毒性作用C. rigidus.香精油被报告为有害物质anopheles gambiae.,埃及伊蚊， 和culex quinquefascasciatus蚊子种类[21］.该植物的叶提取物和组分对豆甲虫也有一定的防治效果Callosobruchus maculatus[22］.

植物提取物组合的协同作用在文献中被广泛记载，植物组合可能增加药效，而不是单独使用一种植物，从而可能防止昆虫抗性问题[23］.描述为任何一种药物或杀虫剂之间的良性互动,合作可以进行单个组分之间的提取以及香草的混合草药医生一直以来坚持更好的结果得到的天然植物提取物和组合这些化合物(而不是孤立的24］.为了寻找植物产品的杀虫功效和预防杀虫剂抗性问题的改善，本表明评估甲醇提取物和精油混合物的协同活性赤桉和Callistemon僵直针对主要疟疾载体的第三和第四龄幼虫anopheles gambiae.在实验室条件下。

2.材料和方法

2．1.植物材料收集和加工

绿叶Callistemon僵直和赤桉在2017年12月，喀麦隆大学坎普利大学校园收获，并由喀麦隆大学博罗大学植物学院Pierre-Marie Mapongmetsem教授确定。将两种植物物种的叶子在环境实验室条件下干燥10天（24±2°C; 76±4％HR），在木制砂浆中接地，并通过0.4毫米网状筛。将得到的每种植物粉末在环境温度下储存在黑暗瓶子中直至其萃取。

2.2。植物甲醇提取

每种植物的甲醇提取物均通过浸渍法提取 每种植物粉末2500克 毫升甲醇。浸渍每天搅拌两次，72分钟后搅拌 h，并使用Whatman 1号滤纸过滤。滤液中的甲醇在露天蒸发，干燥的甲醇植物提取物在4°C下储存在深色玻璃中，直到用于生物测定和植物化学筛选。通过以下公式计算提取率：

２.３.甲醇提取物的植物化学筛选

的甲醇提取物C. rigidus.和E赤藓进行了定性植物化学筛选试验，以鉴定一些抗虫植物化学化合物，包括生物碱、黄酮、皂甙、鞣质、多酚和萜类，根据文献，这些化合物具有杀虫特性。Harborne执行的方法[25]，埃文斯和崔斯[26， Prashant等[27进行了以确定这些植物组分的靶向。

2.4。精油提取

精油的精油C. rigidus.和E赤藓使用Dean-STARK装置通过氢化物过程提取。实际上，将每种植物物种的200克绿叶与500ml蒸馏水混合，并将其提交至氢化物程序3小时。使用分离漏斗分离花水和精油，并用无水硫酸钠完全除去精油中的水痕迹。将得到的每个干燥的植物精油在深色玻璃中保持并在4℃下储存直至用于测试。使用以下公式计算精油提取产率：

2．5．蚊子

建立菌落，卵的实验室菌株anopheles gambiae.于2018年2月在喀麦隆雅温得的OCEAC采集。在Ngaoundere大学应用动物学实验室的昆虫室中，蚊子卵被转移到装有自来水的桶中，孵化出的幼虫按照世卫组织的标准规程饲养[28］.幼虫喂食TetraMin®(Tetra GmbH，德国)，并在虫媒环境条件下饲养(27±2℃;74±4% rh)。用3、4龄蚊幼虫进行实验。

2.6。杀灭幼虫的生物测定

结果表明:甲醇提取液和挥发油均有杀幼虫作用E赤藓和C. rigidus.单独或以二进制组合方式测试A.Gambiae.根据世卫组织所述的标准方案对幼虫进行评估[29］.的甲醇提取物或精油的二元组合E赤藓具有C. rigidus.分别以25% + 75%、50% + 50%、75% + 25%的比例配制E25%: C75%、E50%: C50%、E75%: C25%的组合。植物甲醇提取物和精油在二进制组合单独或溶解在0.5毫升的渐变- 80浓度的125年,250年,500年,1000年和2000 ppm植物甲醇提取物和25,五十,100,200,400 ppm精油的体积也准备了100毫升塑料杯(250毫升)的解决方案。阴性对照是在99.5 mL自来水中加入0.5 mL，而Bi-one™(1000 ppm)作为阳性对照。将25只3、4龄幼虫转移到各溶液试验制剂中，每个剂量重复4次。处理24 h后记录幼虫死亡率，如果幼虫经昆虫针掐掐后仍不活动，则宣布幼虫死亡。幼虫死亡率被计算出来，然后用Abbott校正[30.，如果阴性对照的幼虫死亡率在5% - 20%之间，按以下公式计算: 其中NC =对照中死亡幼虫的百分比，NT =死亡中死亡幼虫的百分比。

经过LC的计算₅₀单独或组合测试的两种植物提取物和精油的值，每个组合的共毒指数测定如下： E代表提取物或精油的其中E赤藓C代表提取物或精油C. rigidus.．

当混合物的一个组分（提取物或精油C. rigidus.例如，在测试的所有剂量下)造成的死亡率很低(<20%)，联合毒性指数将计算如下:

然后，根据Sun和Johnson [31]，（一世）如果共毒指数小于80，则视为拮抗作用(2)如果Cotoxicity指数在80到120之间，则被认为是添加剂作用(3)如果Cotoxicity大于120，则被认为是协同作用

根据Kalyanasundaram和DAS计算协同因素[32]方法如下：

SF值 > 1表示协同作用和SF < 1表示拮抗作用。

2.7。统计分析

使用SPSS(社会科学统计软件包)16.0版软件对校正的幼虫死亡率进行方差分析(ANOVA)。平均分离采用Tukey检验( ）。概率单位分析(33]应用于确定导致50％的致死浓度（LC₅₀)和95% (LC₉₅)的死亡率。

3.结果

3．1.萃取率

两种植物种类叶片的提取产量C. rigidus.和E赤藓载于附表1.．当用甲醇溶剂萃取时，黄叶的得率C. rigidus.(30.71% (w/w))略高于黄叶E赤藓(23.79% (w / w))。同样的，从香精油的叶子中获得的产量C. rigidus.与从叶片获得的产率相比，为1.20％（w / w）。E赤藓(0.84% (w / w))。

桌子2.介绍了植物化学筛选的结果C. rigidus.和E赤藓．在两种甲醇植物提取物中，生物碱、黄酮类、单宁、皂苷、萜类和多酚等6种植物化学成分均以不同浓度存在。在甲醇提取物中C. rigidus.、生物碱、皂苷和多酚的含量高于其他成分。关于甲醇提取物E赤藓在美国，这种植物富含单宁酸和多酚。

幼虫的死亡率A.Gambiae.用甲醇提取物处理E赤藓和C. rigidus.应用于单个的每一个和二进制的组合及其LC₅₀以及LC₉₅（ppm）值24 暴露后的h如表所示3.．单独或联合应用时，两种植物的甲醇提取物具有显著的( )对蚊幼虫的毒力随浓度的增加而增强。单独测试，幼虫的死亡率从125 ppm时的0%到1000 ppm时的98% (F₍₁₈₎= 350.96; )具有E赤藓提取，从83% (125 ppm)至100% (1000 ppm) (F₍₁₈₎ = 1528.66; )具有C. rigidus.提取记录。混合E25%: C75%可显著提高蚊虫幼虫死亡率，125ppm时为57%，1000ppm时为100% (F₍₁₈₎= 671.17; )与其他组合相比。在两种植物提取物中，C. rigidus.甲醇提取物（LC₅₀ = 39.15 ppm and LC₉₀= 319.80 ppm)E赤藓提取物（LC.₅₀= 408.90 ppm和LC₉₀ = 849.50 ppm) when tested on mosquito larvae. However, the combination of the two plant extract lowers the efficacy ofC. rigidus.通过增加LC₅₀数值（117.91、183.37和106.21 组合E75%的ppm : C25%，E50% : C50%和E25% : （分别为C75%）与LC相比₅₀的C. rigidus.单独测试。

研究了紫檀挥发油的协同因子和共毒指数E赤藓和C. rigidus.针对A.Gambiae.24 h后处理如表所示4.. 从这些结果来看，只有E赤藓75％和C. rigidus.25％（协同因子= 1.031和Cotoxicity指数= 103.177（在80和120之间）显示对幼虫的添加剂作用A.Gambiae., 24 h暴露后。组合为50% : C50%（协同因子） = 0.389和共毒指数 = 38.969（小于80%）和E50% : C50%（协同因子） = 0.476和共毒指数 = 47.632（小于80））被认为是不良混合物，因为它们各自表现出对病毒死亡率的拮抗作用A.Gambiae.24小时后幼虫治疗后。

死亡率的百分比A.Gambiae.幼虫用精油治疗E赤藓和C. rigidus.应用于单个和二进制组合及其LC₅₀以及LC₉₅（ppm）值24 暴露后的h如表所示5.．香精油E赤藓仅在最高测试剂量200ppm时，单独测试的幼虫死亡率为31%，而阳性对照Bi-one的死亡率为100%A.Gambiae.幼虫。香精油C. rigidus.也单独导致了显著的(F₍₁₈₎ = 376.93, )幼虫死亡率从25ppm时的0%到200ppm时的88%不等。在二元组合中，E75%: C25%的混合物引起显著(F₍₁₈₎ = 389.02; )幼稚活性范围为0％（25ppm）至89％（200ppm），而组合E50％：C50％表现出显着性（F₍₁₈₎ = 404.69; )25岁时蚊子幼虫死亡率为0% 200%时，ppm降至43% ppm 24 h暴露后。这一组合也显示出显著的差异(F₍₁₈₎ = 691.00; )A.Gambiae.处理24 h后，幼虫死亡率在25ppm时为0%，在200ppm时为66%。在单株植物精油处理中，C. rigidus.香精油₅₀= 99.66 ppm)是最有效的E赤藓香精油₅₀ = 223.03 ppm) against the larvae ofA.Gambiae.24 h暴露后。在二元组合中，混合物E75% : C25%信用证₅₀ = 62.87 与E50%相比，ppm是最佳组合 : C50%（LC）₅₀ = 132.58 ppm）和E25% : C75%（LC）₅₀ = 115.16 （ppm）组合抗家蚕幼虫A.Gambiae.，24小时后治疗。

桌子6.介绍了紫檀挥发油的协同因子和共毒指数E赤藓和C. rigidus.针对A.Gambiae.，24小时后治疗。组合75％E赤藓精油25％的精油C. rigidus.精油（E75% : C25%），协同因子为2.709（>2），协同毒性指数为270.908（>120），显著优化了组合的功效，产生了对所测定蚊子幼虫的协同功效。组合E赤藓50%,C. rigidus.50％（协同因子= 1.039和Cotoxicity指数= 103.908）以及E赤藓25%及C. rigidus.75%（协同因子） = 1.004和共毒指数 = 100.428）对幼虫表现出加性作用A.Gambiae.24小时后处理。

4.讨论

在害虫防治剂研究中，鼓励采用杀虫剂组合方法，不仅可以优化杀虫剂产品的功效，还可以解决抗虫性问题，并且可以明显保持杀虫剂产品的功效多年。在药物或杀虫剂的组合中，预期只有加性、协同或拮抗作用中的一种作用[34[所进行的任何植物组合测定的目的是获得混合物的协同作用。幼虫活性的结果显示提取物或精油E赤藓和C. rigidus.单独使用或二元组合使用可导致A.Gambiae.幼虫。在本研究中，甲醇提取物C. rigidus.单独测试对蚊子幼虫和它的组合最有效E赤藓提取物具有拮抗作用。然而，以往的研究表明，植物提取物在混合时具有协同作用。由此可见，乙醇叶提取物的二元组合Dracaena arborea和牡荆doniana发挥协同作用按蚊蚊子种类[35]. Yankanchi等人[36]单独测试并与之结合光肩星天牛种子提取物，三叶植物提取物Vitex Negundo，Clerodendrum Inerme， 和Gliricidia海螵蛸对四龄幼虫埃及伊蚊发现，单独测试，C.露珠（立法会）₅₀ = 292.36 ppm) was the most toxic while the maximum synergistic activity was found in the combination extracts ofC.露珠50％p . glabra50% (LC₅₀ = 195.02 ppm) as well as in 50%诉牡有50%的人p . glabra（立法会）₅₀= 191.73 ppm)。混合物的增效作用蓝叶丽蝇提取并Khaya Senegalensis.提取物以1:1的比例对四龄幼虫A. Aegypti.和c . annulirostris在首24小时内[37］.这两种植物提取物对蚊子幼虫的杀灭作用可能是由于它们含有丰富的生物碱、黄酮类、单宁、皂苷、萜类和多酚，这些物质以前曾被报道具有杀虫特性[37］.这些有毒的植物化合物物质被摄入口服或通过角质层途径，这可能会影响导致死亡的昆虫生理学平衡[38］.

混合E赤藓具有C. rigidus.3: 1比例的精油在抗氧化剂中表现出协同活性A.Gambiae.幼虫在目前的调查中。这结果与Ríos等人的结果进行了证实。[39]其中精油胸腺寻常胸腺分别测试和组合Lippia origanoides具有Swinglea需表现出最高的幼稚病活动A. Aegypti.幼虫。同样，结果表明，从树脂中提取的精油组合奥库梅·克兰，加拿大， 和Dacryodes鸡蛋果导致其功效增强，并表现出显著的杀幼虫活性A.Gambiae.[40］.的比值为1:1的二进制组合气味清香植物 + 八角,S. aromaticum. + Trachyspermum Ammi.， 和I. verum. + T阿米精油在二元混合物中表现出协同相互作用[41]. Zibaee等人[42]使用含有迷迭香和洋甘菊油混合物的乳霜配方，可获得最佳的驱避活性答:stephensi和疾病侵害成人。杀虫剂的驱避效果Azadirachta indica油反对A. Aegypti.当甜罗勒油和柠檬桉树加入其中时加强[43]. 以1的比例应用 : 4，两种单萜类化合物百里酚和香芹酚的组合增强了混合物的功效，导致对幼虫的显著协同作用疾病侵害，与单独测试的单一化合物的功效相比[44］.Pavela等人进行的一项研究[45结果表明，香芹酚与香芹酮、香芹酚与4-烯丙基醚、香芹酚与松油醇的组合均具有较高的杀幼虫毒性C金龟子幼虫。相反，当合并时，大蒜和asafoetida精油表现出拮抗作用，与他们的应用单独对抗幼虫疾病侵害和c . restuans[46]. 类似的观察结果也有报道称桉树Citriodora.单独使用与其相结合相比最好的幼稚病活动Cymbopogon nardus油反对A.Gambiae.幼虫(47］.植物提取物的毒性或精油组合混合物的混合物可能是因为phytocomponents混合物和可能作用在协同神经毒性杀虫剂干涉ligand-gated氯通道的蚊子幼虫神经系统或通过阻断章鱼胺或胆碱能受体,防治虫鼠的重要目标地点[48–50］.

5.结论

这两种植物的甲醇提取物和精油单独或以二元组合进行试验，可显著地杀灭幼虫A.Gambiae.幼虫。单独测试，甲醇提取物和精油C. rigidus.被发现是最有效的E赤藓对蚊子幼虫。然而，植物甲醇提取物的二进制组合显示拮抗作用E赤藓(75%)和C. rigidus.(25%)精油混合物对蚊幼虫有协同作用。这使得它更适合开发新的潜在的环保杀幼虫剂A.Gambiae.在幼虫孳生地防治蚊患。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

L. Younoussa, J. L. Tamesse和E. N. Nukenine设计了这项研究。L. Younoussa、M. K. Oumarou、A. C. S. Batti和F. Kenmoe进行了实验。尤努萨分析了数据，写出了手稿的初稿。所有的作者阅读，修改，并批准手稿的最终版本。

致谢

作者感谢Pierre-Marie Mapongmetsem教授对植物物种的鉴定。他们感谢喀麦隆Ngaoundere大学理学院化学实验室的植物提取和植物化学筛选，也感谢防治中非地方病协调组织(OCEAC)提供了用于本工作的蚊卵。

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