文摘

心肌氧化应激和炎症是心血管重构的关键机制。c型利钠肽(CNP)是一个endothelium-derived心血管因素,尽管它对心脏的影响还没有调查过氧化物生成体内。本研究测试的假设抑制过氧化物生产导致的心血管作用CNP。血管紧张素ⅱ(Ang II)或生理盐水持续注入皮下注射到老鼠使用渗透微型泵。同时Angⅱ的起始治疗小鼠注射了CNP (0.05μ克/公斤/分钟)或2周的工具。心脏重量胫骨长度比例显著增加了Angⅱvehicle-treated老鼠。治疗CNP减少Ang II-induced心脏肥大而不影响收缩压。超声心动图显示CNP减毒和II-induced壁厚的增加,左心室扩张,减少部分缩短。CNP减少Ang II-induced增加心肌细胞大小和间质纤维化和抑制肥厚性和fibrosis-related基因表达。最后,CNP减少Ang II-induced心脏过氧化物生产。这些变化是伴随着NOX4基因表达的抑制。我们的数据表明,CNP减毒和治疗II-induced心脏肥大、纤维化和收缩功能障碍是伴随着减少心脏超氧化物生产。

1。介绍

c型利钠肽(CNP)属于利钠肽(NPs)的家庭,原本从猪脑组织分离,后来建立了积极的监管机构的软骨内骨化(1]。在心血管系统中,CNP分泌内皮细胞和心脏成纤维细胞,并作为自分泌/旁分泌调节[2,3]。心肌增加生产和流通CNP水平在慢性心力衰竭患者4,5),这表明CNP在心力衰竭的发病机制有重要的作用。ANP、BNP (NPR)——来利钠肽受体结合,诱导尿钠排泄和利尿,而CNP优先结合其特定的受体,NPR-B。的相对丰度NPR-B NPR-A心脏成纤维细胞和心肌细胞,据说CNP antihypertrophic更有效和antifibrotic属性,尽管少降血压药和利钠作用与ANP和巴黎银行(6,7]。最近设计的新颖化合物CD-NP, CNP和DNP的妄想,是一种很有前途的候选人为新一代疗法使用NPs [8]。因此感兴趣的阐明CNP的精确作用在心血管病理生理学基础和临床医学的角度来看。

以前的实验研究表明,长期管理CNP减弱心脏收缩功能重构和维护在小鼠心肌梗死模型和心肌炎,独立于其降压效果(9,10]。Cardiomyocyte-specific CNP减毒心脏肥大的超表达小鼠心肌梗死模型(11]。相反,与超表达转基因老鼠的显性负突变NPR-B显示心脏肥大加重(12]。体外,它已被证明,CNP防止agonist-induced心肌细胞肥大通过循环GMP-dependent kinase-mediated蛋白机制(7,13]。CNP还能抑制成纤维细胞增殖和细胞外基质生产的心脏成纤维细胞更有说服力地ANP和法国巴黎6]。这些数据表明,CNP直接作用于心肌细胞防止病理刺激。

实验和临床证据牵连到一个核心作用的血管紧张素ⅱ(Ang II)在所有阶段的心血管连续体(14,15的不利影响,Angⅱ介导的,至少在某种程度上,通过活性氧(ROS) (16- - - - - -18]。为此,报告的抗氧化活性有助于心血管效应的ANP (19]。然而,对中国出版集团的影响和II-induced心脏ROS生成。在这里,我们调查是否慢性CNP输液可以减弱心肌超氧化物生产心脏肥大和重塑诱导的小鼠模型和二世。

2。材料和方法

2.1。动物

12个雄性C57BL / 6小鼠被用于本研究。Angⅱ(肽研究所)或生理盐水就皮下注入通过渗透微型泵的速度(1002年Alzet模型)为2周(3.2毫克/公斤/天20.]。同时Angⅱ的起始治疗,老鼠注入了CNP(肽研究所,0.05μ克/公斤/分钟)或车辆持续皮下输注2周。收缩压(SBP)、心率(HR)的有意识的老鼠被tail-cuff监测方法(mk - 2000;室)。经胸廓的超声心动图进行2周后和II注入。小鼠安乐死,心被称重和收获进行进一步分析。CNP的血清水平测量使用CNP-22环评工具包(凤凰制药,卡尔斯鲁厄,德国)根据制造商的协议(21]。所有程序都执行依照熊本大学动物保健指南,这符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订)。

2.2。超声心动图

经胸廓的超声心动图(煤炭)使用Xario执行系统(东芝、东京、日本)配有12-MHz线性阵列换能器。M-mode图像记录从极震区视图在乳头状肌高级别。左心室舒张末期维度(LVDd),收缩末期维度(LVDs)脑室鼻中隔(IVS),后壁厚度(PW)测量。缩短分数(% FS)计算使用以下方程:% FS = (LVDd−LVDs) / LVDd×100。所有的录音进行有意识的老鼠。超声心动图是由调查人员对治疗组的身份也不清楚。

2.3。实时聚合酶链反应

总RNA制备使用试剂盒RNeasy纤维minikit,使用厂家提供的协议,并使用ThermoScript互补脱氧核糖核酸生产rt - pcr系统(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。如前所述(执行实时聚合酶链反应22]。转录表达水平测定,记录的数量相对于那些glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)和规范化的平均值控制的心。表1列出了在这项研究中使用的引物序列。

2.4。组织学分析

核心部分是准备和苏木精和伊红染色(圆))整体形态或马森的三色的(MT)评估心肌间质纤维化17]。至少10个字段选择随机确定肌纤维使用图像大小和心肌间质纤维化图像分析软件,如前所述17]。Dihydroethidium(她)是用来评估心脏组织的过氧化物水平如前面详细描述(23]。她的心脏部分荧光量化使用腔视觉分析软件2.2版本。

2.5。统计分析

所有数据都意味着±SEM。比较组间是由单向方差分析与费舍尔PLSD测试。一定程度的被接受为显著。

3所示。结果

3.1。慢性CNP灌注血流动力学参数的影响

检查补充外源性CNP对盎II-induced心脏重构,Angⅱ,saline-infused老鼠对待CNP或2周(表的工具2)。Angⅱ注入2周与saline-infused对照组相比显著增加SBP(136±6和97±4毫米汞柱,职责)。循环CNP在CNP-treated水平显著增加小鼠相比vehicle-treated控制。使用的剂量的CNP (0.05μg / kg / min)没有额外影响SBP Angⅱ-或saline-infused老鼠。人力资源是影响Angⅱ注入CNP -和vehicle-treated老鼠相比saline-infused老鼠。

3.2。CNP政府变弱和II-Induced心脏功能障碍

图1(一)显示代表LV M-mode超声心动图记录。如图1 (b)、静脉注射和佩恩表的编制者明显增加了Ang二世在vehicle-treated注入老鼠,和这些变化被CNP抑制治疗(在不影响SBP,如上所述)。超声心动图分析还显示显著增加LVEDD和% FS vehicle-treated老鼠注入Angⅱ(图2周后1 (c));然而,这些影响是显著减毒CNP治疗。相比之下,长期输液saline-infused CNP对超声心动图参数没有影响的老鼠。

3.3。CNP输液变弱和II-Induced心肌细胞肥大

心脏重量胫骨长度(HW / TL)比率明显增加了Angⅱvehicle-treated老鼠注入(与毫克/ mm;图2 (b)),而治疗CNP下降这Ang II-induced心脏肥大16%。CNP saline-infused没有影响心脏大小的老鼠。分析肌细胞截面积在组织学部分证实了这些发现(图2(一个));计算区域的细胞增加vehicle-treated小鼠接受Angⅱ输液,但这增加主要是阻止老鼠给CNP(276±16和375±11μ米²;图2 (c))。CNP治疗vehicle-treated老鼠没有影响肌细胞截面积。符合这一观察,Angⅱ注入ANP fetal-type心脏基因的表达增加,法国巴黎银行,β肌凝蛋白重链,这些upregulations被CNP治疗(图2 (e))。Angⅱ输液两周后,肺湿重(LW / TL) TL比率,一个参数用来评估肺充血,显著减少CNP-treated老鼠相比vehicle-treated控件(与毫克/克;图2 (d))。

3.4。CNP灌注减少Ang II-Induced心肌间质纤维化

调查的结果外生CNP管理心脏重构,我们评估心肌间质纤维化(图3(一个))。间质纤维化在vehicle-treated显著增加小鼠注入Angⅱ(图2周后3 (b))。然而,治疗CNP在这一措施导致明显降低(与%)。同意这一观点,Ang II-induced基因upregulations胶原蛋白我和III明显减少了外生CNP治疗(图3 (c))。CNP注入没有影响纤维化或胶原蛋白表达saline-infused老鼠。

3.5。CNP补充减少活性氧产量的心受到盎II输液

心肌超氧化物生成是一个关键机制和II-induced心脏重构(24]。因此我们调查CNP政府能否在小鼠心脏变弱和II-induced超氧化物生产。心肌组织沾染了她的部分是确定过氧化物生产车辆,CNP-treated老鼠注入Angⅱ(图2周后4(一))。Angⅱ注入vehicle-treated小鼠超氧化物代增加了1.5倍,但治疗CNP明显减少Ang II-induced心脏过氧化物生产(图4 (b))。此外,Angⅱ诱导的基因upregulation NOX4, NADPH氧化酶亚基,这显然是抑制治疗CNP(图4 (c))。相比之下,CNP治疗vehicle-treated老鼠没有影响心肌超氧化物生产或NOX4基因表达。转录表达水平的NADPH氧化酶亚基如第22位和p没有改变了CNP治疗。

4所示。讨论

本研究第一个体内提供证据证明连续输注外源性CNP减毒和II-induced心肌超氧化物生产和心脏功能障碍。CNP明显预防和管理II-induced心脏肥大和LV扩张,从而维持心肌收缩功能而不影响SBP。CNP减少Ang II-induced增加心肌细胞大小和间质纤维化明显抑制肥厚性和纤维化的基因表达。这些有利影响是伴随着减少过氧化物生产和NOX4盎II-infused心肌基因表达。在一起,这些发现暗示CNP施加抗氧化活性的情况下,促进心脏肥大和纤维化,因此,保持左心室收缩功能。

心脏肥大是最初设计的适应性反应维持心脏功能,以应对血流动力学和神经体液的压力。然而,长期的外部负载导致失代偿性的心脏肥大表现为心室扩张和收缩功能的损失。尽管ANP、BNP心脏肥大的作用和重构研究在体外和体内的研究中,有限的数据可用CNP在这一过程中所扮演的角色(3]。我们使用了一个盎II注入模型在这项研究中,因为多个证据证实不仅Angⅱ诱发高血压,但也直接导致心脏重构(15]。Angⅱ注入到老鼠后收缩功能变化之间的报告。例如,Essick等人报道,收缩功能未受相同剂量相同(3.2毫克/公斤/天)和时间(2周)和II注入我们的研究25]。手,藤田等人报道,低剂量的Angⅱ注入(1.2毫克/公斤/天)2周减少收缩函数(26]。差异的原因可能是由于不同的试剂、设备、或老鼠应变。

Ang II-induced ROS生成被认为是一个关键机制调节心血管重构(24]。关于细胞活性氧的来源,Ang II-induced upregulation NADPH氧化酶亚基的已经被记载在各种心血管细胞类型包括心肌细胞、成纤维细胞,血管平滑肌细胞(VSMC) [27- - - - - -29日]。NOX4,其中一个单元是涉及Angⅱ注入和/或压力overload-induced心肌肥大(30.- - - - - -32]。这项研究显示,NOX4基因upregulation极大地抑制了CNP治疗。已经证明,CNP防止agonist-induced心肌细胞肥大通过循环GMP-dependent kinase-mediated蛋白体外机制(7,13]。因此,我们推测慢性抗心肌肥厚效应CNP注入本研究中观察到的是由循环GMP-dependent方式和抑制NOX4生产。

另一个利钠肽,ANP,可以在心血管系统抑制活性氧的生产。例如,ANP体外抗心肌肥厚的行为是伴随着减少过氧化物的水平,通过NPR-A / cGMP介导途径(19]。carperitide我们先前表明,静脉输液,ANP的人类形态,显著降低慢性心力衰竭患者血清活性氧含量和外生ANP施加直接在心肌细胞体外抗氧化性能(33]。ANP、BNP相比,CNP结合并激活其特定的受体,NPR-B [3]。NPR-A和NPR-B激活cGMP-dependent信号在绑定他们的特定的配体,这表明CNP的抗氧化特性是通过NPR-B / cGMP通路介导。此外,所有的利钠肽结合NPR-C。最近的报告表明,刺激NPR-C降低NADPH氧化酶活性和过氧化物的生产衰减NOX4和p的表达式子单元从自发高血压大鼠VSMC NADPH氧化酶的34]。我们推测,CNP抑制NOX4表达式通过相同的机制在目前的实验。

ANP的合成试剂和法国目前用于临床报道antiremodeling效应(35]。然而,由于他们的提示血管舒张和尿钠排泄的行动,这些代理不能用于严重低血压患者有时看到在急性心力衰竭。ANP、BNP相比,CNP对降低低血压患者和尿钠排泄的影响,更有效antihypertrophic和antifibrotic属性(36]。这些功能差异对的相对丰度在NPR-A NPR-B心血管组织(6,7]。CNP的低血压的行动也可用在血液流动不稳定的病人。此外,这些血流动力学和antiremodeling方面非常适合长期的管理,因为心脏重构通常是发达国家由于长期的外部刺激。在这项研究中,慢性CNP输液对SBP影响很小;然而,Ang II-induced心脏重构是显著的预防。因此我们的研究结果支持了这样的观点,即长期CNP在anti-remodeling政府潜在的有用策略为慢性心脏疾病(10]。

总之,我们的数据表明,CNP防止盎II-induced心脏重构的发展是伴随着减少心肌超氧化物生产。这部小说的作用机制使CNP潜在的额外anti-remodeling代理。

确认

作者感谢Saeko Tokunaga和收益Nagahiro优秀的技术援助。