文摘

我们检查了EphB2 ephrin-B1及其同源受体的表达,血管生成的关键调节因素和胚胎发生,人类腹主动脉瘤(AAA)和分析它们的功能角色在细胞迁移。从10例(9 1男性和女性;的年龄,)血管手术为AAA,我们获得AAA和邻近组织的控制。使用实时rt - pcr,我们ephrin-B1和EphB2分析表达式。我们还在AAA组织学上局部这些分子的组织。最后,影响ephrin-B1和EphB2炎症细胞的趋化作用被细胞迁移试验检查。ephrin-B1表达水平(与,)和EphB2 (与,在AAA)高于正常控制。ephrin-B1和EphB2都表达了在巨噬细胞、T淋巴细胞和内皮细胞在AAA。在趋化性测定,ephrin-B1和EphB2抑制单核细胞趋化作用引起的基质衍生因子- 1下% (),% (),分别。这些数据表明,ephrin-B1 EphB2可能在成人炎症细胞功能和参与AAA的发病机制,尽管这些分子进一步应该寻求的特定角色。

1。介绍

腹主动脉瘤(AAA)主动脉破裂的风险高,是老年人死亡的主要原因之一(1],有时与冠状动脉扩张[2]。闭塞的动脉粥样硬化,如颈动脉粥样化相比,AAA影响更广泛的血管层,但股票等致病方面炎性细胞积累(3]。转基因小鼠模型对AAA阐明发病机理的关键分子AAA (4]。例如,一些基质金属蛋白酶(MMPs)调节和巨噬细胞表达在AAA,这可能会导致AAA(内侧变性5)有或没有生理应激如缺氧(6]。然而,我们理解AAA的分子和细胞机制仍然是有限的,特别是在人类病例。

最近,我们发现ephrin-B1及其同源受体EphB2,血管生成和胚胎发生的主要监管机构,调节和主要表达在巨噬细胞和淋巴细胞)在人类颈动脉粥样硬化斑块(6]。Ephrin-B1 EphB2属于ephrin和弗家族基因21个成员国组成,无所不在地表达在胚胎组织和参与形态发生通过调节细胞粘附和迁移7,8]。因此,我们假设ephrin-B1和EphB2可能也参与了AAA的发病机制和出发来分析这些分子在人类AAA的表达及其调节影响炎症细胞的趋化作用。

2。方法

2.1。病人

实验协议符合赫尔辛基宣言的原则和伦理委员会批准的国家脑和心血管中心。书面知情同意了所有的10个病人选择性移植替代手术AAA(9 1男性和女性;的年龄,)[9]。没有AAA病人患有临床手术前不稳定状态,如主动脉破裂。AAA的直径来衡量计算机断层扫描范围从38 - 80毫米(55.3±3.5毫米)。AAA的危险因素的流行是如下:8高脂血症,高血压在9日在7,吸烟和糖尿病2的患者。

2.2。主动脉组织抽样

在移植替代AAA,一条主动脉壁的扩张地区和缺乏附壁血栓是仔细切除。infra-renal主动脉条含有最少的动脉粥样硬化改变不扩张也从五个病人获得控制。所有的样品都迅速在液态氮冷冻和储存在−80°C到提取的RNA。组织与non-formalin-fixative固定解决方案的一部分,Histochoice (Amresco,梭伦,哦),在石蜡和嵌入。

2.3。抗体和试剂

对于免疫组织化学,我们使用以下鼠单克隆抗体:anti-CD68(克隆KP1) (Dako、斯特鲁普、丹麦)和anti-CD8(克隆4 b11) (Novocastra、纽卡斯尔、英国)。以下多克隆抗体被:兔子anti-ephrin-B1(圣克鲁斯,圣克鲁斯,CA);山羊anti-EphB2(σ,圣路易斯,密苏里州);兔子anti-von血友病因子(vWF) (Dako);兔子anti-CXCR-4 (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。生物素化的猪抗体免疫球蛋白(Dako)也使用。使用下面的重组蛋白:人类stromal-derived因子- 1 (SDF-1) (PeproTech、伦敦、英国);人单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1) (BioLegend,圣地亚哥,CA);鼠标和鼠标ephrin-B1-IgG-Fc嵌合体EphB2-IgG-Fc嵌合体(研发系统、明尼阿波利斯、MN);IgG-Fc(雅典研究科技,雅典,GA)。

2.4。定量逆转录-聚合酶链反应(定量rt - pcr),

总RNA分离从主动脉标本使用等基因试剂(日本基因、东京、日本)根据制造商的指示10]。RNA浓度测量与分光光度计及其完整性确认视觉1.2%变性琼脂糖凝胶电泳沾SYBR绿色染料(Carsbad表达载体,CA)。然后,10μ克总RNA已经没有dna处理细胞代理(Ambion、奥斯汀、TX)和转换为互补使用随机引物和上标二世逆转录酶(表达载体)。定量rt - pcr进行使用TaqMan试剂在7700年ABI棱镜序列检测系统(PE应用生物系统公司,福斯特城,CA)。Assay-on-Demand鸡尾酒(PE应用生物系统公司)是用于ephrin-B1 (Hs00270004_m1)和EphB2 (Hs00362096_m1)。使用GAPDH, predeveloped TaqMan化验试剂。的表达水平ephrin-B1或EphB2规范化的GAPDH如前所述(5,11]。

2.5。免疫组织化学

AAA的石蜡包埋标本分组3μmthickness。这些部分是deparaffinized Neo-Clear(默克,Darmsdat,德国)。组织病理学评价,部分被苏木精和伊红染色())。ephrin-B1的双重免疫组织化学染色和CD68 ephrin-B1和CD8 ephrin-B1和vWF或ephrin-B1 cxcr,部分是第一次孵化anti-ephrin-B1抗体(1:300稀释)和间接为棕黄色沉淀使用peroxidase-coupled设想系统(PO-Envision Dako)和3、3′-diaminobenzidine (DAB)作为衬底。随后,相同的部分与anti-CD68孵化(1:300稀释),anti-CD8(1: 40稀释),anti-vWF(1: 200稀释),或anti-CXCR4(1: 100稀释)抗体和彩色的红色沉淀使用碱性phosphatase-coupled设想系统(AP-Envision Dako)和新的碱性品红(Dako)作为衬底。

双EphB2组织化学染色和CD68 EphB2和CD8 EphB2和vWF或EphB2 cxcr,部分最先孵化与山羊anti-EphB2抗体(1:50稀释)和处理peroxidase-coupled Histofine马克斯- (G)系统(Nichirei、东京、日本)和轻拍。相同的部分被孵化与anti-CD68 anti-CD8, anti-vWF或anti-CXCR4抗体和处理AP-Envision和新洋红。之前ephrin-B1双免疫组织化学和CD8或EphB2 CD8,部分已经在0.01 mol / L热压处理过的柠檬酸缓冲(pH值6.0)5分钟在121°C到揭开CD8抗原。双CD68组织化学染色和cxcr anti-CD68抗体和加工的部分最先孵化PO-Envision和轻拍。相同的部分被孵化与AP-Envision anti-CXCR-4抗体和加工和新洋红。所有这些准备工作都是与苏木精复染色,安装与Neo-Mount(默克),并与Axiophot2光学显微镜检查配备AxioCam CCD相机(卡尔蔡司,Hallbergmoos,德国)。

2.6。rt - pcr Ephrin-B1和EphB2外周血单核细胞

人外周血单核细胞(PBMC)准备从前臂静脉血液的健康成人志愿者通过密度梯度离心Lymphoprep (Axis-Shield PoC,奥斯陆,挪威)。从人类PBMC,总RNA分离等基因试剂,清除污染的基因组DNA,相对地转录的互补使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒、希尔登,德国)。rt - pcr,正向和反向引物设计在一个外显子的ephrin-B1(外显子5)或EphB2(外显子6):ephrin-B1, 5′-GTCCTACTACTGAAGCTACG-3′/ 5′-CTCTTGGACGATGTAGACAG-3′; EphB2 5′-GCAGTGTCCATCATGCATC-3′/ 5′-AGTACTGCAGCTCATAGTCC-3′。

正面和负面的控制,DNA-cleared RNA逆转录和人类基因组DNA (50 nM;Clontech,帕洛阿尔托,分别使用CA)。反应混合物是组装的总量10μL如下:6.65μL水,1.0μ0.8 L 10×Taq缓冲区,交货μL核苷酸混合物(包括每个核苷酸的2.5毫米),1.0μ正向和反向引物混合物(5μ每个引物),0.5μL模板,和0.05μL Taq交货(豆类、东京、日本)。的PCR进行预热2分钟(94°C)和35周期放大(94°C 20年代,60°C 30年代和40年代72°C)。PCR产品受到丙烯酰胺凝胶电泳和溴化乙锭染色。实验进行至少三次,代表数据显示。

2.7。细胞迁移试验

Boyden室细胞迁移试验使用执行24-well Transwell板块,包含在每个好,5室μ米多孔聚碳酸酯膜分离到上下部分(康宁,康宁,纽约)。室膜与ephrin-B1-Fc预镀、EphB2-Fc或IgG-Fc控制(5μ一夜之间,g / mL)。然后钱伯斯插入Transwell包含600个盘子μL分析缓冲区(RPMI1640介质heat-inactivated 0.1% BSA)有或没有趋化因子(SDF-1或MCP-1为0.1μg / mL)。人类PBMC (1×10⁵细胞在100年μ分析缓冲区的L)加载到室和允许迁移的下部为2小时湿润孵化器(37°C;5%的公司₂)。在迁移期间,通过了穿过细胞膜的PBMC收集和统计使用Z2库尔特计数器(贝克曼库尔特,富勒顿,CA)。在同等条件下,我们也试图利用可溶性重组ephrin-B1 EphB2稀释到媒介评估细胞迁移,因为有一些报道,展示了不同的细胞迁移的结果(12]。

2.8。统计分析

定量rt - pcr和Boyden室试验结果表示为均值±SEM的两个独立的实验一式三份。所有统计分析用StatView Ver.5.0软件(SAS研究所有限公司、卡里、数控)。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。表达Ephrin-B1和EphB2人类AAA

AAA或控制的所有总RNA分离主动脉保持健壮的完整性在琼脂糖凝胶电泳,确保可靠的基因表达分析。实时定量rt - pcr表明ephrin-B1 AAA的显著调节比控制(图1)。至于EphB2, AAA观察高表达的趋势,尽管数据没有达到统计学意义。

3.2。免疫组织化学分析Ephrin-B1和人类AAA EphB2病变

每个组织标本用于这项研究显示AAA的典型结构。主动脉受到影响的所有层和膜媒体严重受损(图2(一个))。著名的脂质条纹和炎性细胞浸润在内膜(图观察2 (b))。在这种情况下,这些炎症细胞的存在显然是更大的在AAA组织比控制。我们执行双重免疫组织化学染色澄清精确的细胞类型表达ephrin-B1或EphB2在其中,因为我们发现ephrin-B1和EphB2表示各种类型的细胞在人类AAA与单一的疣状。

免疫反应性ephrin-B1被发现的细胞类型:巨噬细胞阳性CD68 (13)(图2 (c));淋巴细胞CD8阳性(14)(图2 (d));内皮细胞阳性vWF [15)(图2 (e))。同样,EphB2 CD68阳性巨噬细胞(图中发现3(一个)),淋巴细胞CD8阳性(图3 (b))和内皮细胞阳性vWF(图3 (c))。

调查ephrin-B1的功能意义,EphB2巨噬细胞或淋巴细胞趋化作用,这些分子和趋化因子受体CXCR4的我们检查了coexpression SDF-1受体(16由双免疫组织化学)。发现许多巨噬细胞——或lymphocyte-like细胞表达ephrin-B1和趋化因子受体CXCR4(图2 (f))或EphB2和趋化因子受体CXCR4(图3 (d))。

3.3。功能表达Ephrin-B1和EphB2外周血单核细胞

确认的表达在mRNA水平ephrin-B1 EphB2成人炎症细胞,我们进行rt - pcr。在人类PBMC, ephrin-B1and EphB2强劲表示(图4)。然后我们测试是否ephrin-B1和EphB2功能人类PBMC中的重要性,通过检查ephrin-B1和EphB2趋化作用的影响。在Boyden室试验,membrane-coated ephrin-B1-Fc或EphB2-Fc嵌合蛋白质并不影响PBMC的自发迁移(图5(一个))。然而,SDF-1诱导PBMC的趋化作用显著抑制ephrin-B1-IgG-Fc和EphB2-IgG-Fc降至54.7±12.7% ()和50.7±13.1% (),分别(图5 (b))。同时,MCP-1-induced PBMC的趋化作用显著抑制ephrin-B1-IgG-Fc和EphB2-IgG-Fc降至53.8±10.9% ()和51.3±11.6% (分别),尽管没有明显的增加或减少的细胞迁移在可溶性ephrin-B1和EphB2病例观察。

4所示。讨论

我们发现ephrin-B1和EphB2表现出更高的表达在人类AAA和巨噬细胞表达,T淋巴细胞,内皮细胞。此外,我们发现膜结合ephrin-B1和EphB2抑制趋化性的人类PBMC Boyden室试验。Ephrins及其同源受体弗是众所周知的监管者在胚胎发生7,8AAA)但是他们的表情和致病作用仍不清楚。因此,本研究的结果会给我们一个新的线索调查人类AAA的分子发病机制。

主要原因之一ephrin-B1和EphB2 AAA的高表达可能是渗透在其中的巨噬细胞和淋巴细胞表达这两种基因。然而,基因表达水平的ephrin-B1 EphB2单核细胞/巨噬细胞,淋巴细胞,内皮细胞在AAA可能调节,还有待阐明。结合ephrin-A5是调节人类AAA (17),大范围的ephrins和弗7可能是调节人类AAA。我们进一步测试是否ephrin-B1和EphB2功能性或非功能性成人炎症细胞。为此,我们检查ephrin-B1和EphB2趋化作用的影响,因为这些分子是众所周知的调节胚胎细胞的迁移。Boyden室试验,membrane-fixed ephrin-B1抑制趋化作用引起的人类PBMC SDF-1或MCP-1,这符合之前的报道,ephrin-B1抑制SDF-1-induced趋化作用的Jurkat T-lymphocytic [18)和THP-1单核细胞的细胞系(6]。

人类PBMC的趋化作用引起SDF-1或MCP-1也抑制membrane-fixed EphB2,通常作为受体。这EphB2 ligand-like行动被认为是所谓的反向信号(8),像EphB2抑制SDF-1-dependent小脑颗粒细胞的小鼠胚胎迁移19]。此外,有几个报告显示ephrin信号与炎性分子如ρ家庭gtpase [20.]和VCAM-1 [21]。Boyden室测定的因此,我们的研究结果显示,ephrin-B1和人类PBMC EphB2功能。

重要的是,这些抑制性的影响ephrin-B1 EphB2并不清楚地观察到当我们使用可溶性代理。这可能部分解释了依赖的弗在横向运动穿过细胞膜受体激活完成活动(12]。普法夫et al。22]证明了横向运动的内皮ephrinB2顶端表面信息连接前退化。此外,人们可能会推测ephrins /弗transwell膜受体固定不得诱导趋化性的counter-receptors /配体的空间分布。然而,目前的数据证明至少SDF-1引起的抑制细胞迁移的影响在体外。

包括细胞因子和趋化因子,大部分已知的因素调节巨噬细胞或t淋巴球可溶性分子的活动广泛传播(23]。相比之下,ephrins和弗在本地膜结合分子发挥其功能通过与邻近细胞(细胞间的相互作用24]。在许多炎症性疾病的病理课程包括AAA (25- - - - - -29日),各种类型的细胞间相互作用发生:macrophages-to-macrophages, macrophages-to-T-lymphocytes macrophages-to-endothelial细胞等等。Ephrin-B1 EphB2,或者更一般的ephrins弗,可能在本地和精确调节巨噬细胞和淋巴细胞的活动受制于扩散因素,如细胞因子和趋化因子。理解ephrinB1或EphB2激活炎症的影响条件,或许MMP的表达或功能,明确的角色ephrinB1或EphB2在这种情况下(30.]。有趣的是,我们最近发现ephrin和弗家庭atherosclerosis-related细胞中广泛表达在人类31日]。进一步的研究将阐明在活的有机体内角色ephrins和弗的动脉粥样硬化的发展,扩张和闭塞的,和其他炎症性疾病。

5。结论

这项研究表明,ephrin-B1 EphB2,关键胚胎发生的监管机构,可能参与了人类AAA的分子和细胞机制。通过细胞间的相互作用,ephrin-B1 EphB2可能局部调节炎症细胞活动受制于可溶性细胞因子等介质。Ephrin /弗系统,最大的受体酪氨酸激酶系统在人类基因组中,可能会给我们一个线索解开未知AAA发病机理,设计新颖的AAA和其他炎症性疾病的治疗策略,尽管这些分子的特定角色AAA应该寻求进一步的发展。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。