异氟醚通过miR-206/BDNF轴调控脂多糖诱导的人星形胶质细胞的增殖、凋亡和炎症反应

抽象

客观的. 探讨异氟醚（ISO）对脂多糖（LPS）诱导的正常人星形胶质细胞（NHAs）增殖、凋亡及炎症反应的影响。方法。NHA增殖活性通过MTT测定;NHA凋亡率通过膜联蛋白V-FITC / PI测定物;Western印迹被用于测量的BDNF表达;用ELISA法测定IL-6，IL-1β和TNFα在nha表达式;采用qPCR检测与NHAs增殖和凋亡相关的mirna的表达;构建双荧光素酶报告基因，验证miR-206与BDNF的靶向关系。结果。LPS增加增殖活性和降低的n已凋亡率，其被有效由ISO（反转 ）;LPS显著抑制NHAs中与增殖和凋亡相关的miRNAs的表达( , ）而ISO显著增加miR-206的表达( )通过下调BDNF的表达，从而抑制NHA增殖和炎症应答和增强的凋亡。结论. ISO通过上调miR-206的表达抑制BDNF的表达，从而抑制NHAs的增殖和炎症反应，促进其凋亡。

1.介绍

最近，神经变性疾病如肌萎缩侧索硬化症（ALS），脊髓损伤（SCI）的发病率在不断增加，和中枢神经系统的炎症反应是关于各种神经变性疾病[一个潜在的机制1]。已报道的是，正常的人星形胶质细胞（n已）可以最小化初级损伤和修复受损的组织。然而，在某些病理条件下，n已可以改变成为反应性n已[2]，和反应性n已是促炎细胞因子在脑的主要来源之一[3.]。非甾体抗炎药与多种神经退行性疾病的发生有关[4]因此，研究反应性NHAs的作用机制有助于制定中枢神经系统炎症性神经退行性疾病的保护策略。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性内毒素的主要成分[5，是一种有效的免疫系统活化因子，通常用于研究与炎症有关的疾病[6]. 因此，本研究采用LPS治疗NHAs，建立体外LPS诱导的NHA损伤模型。异氟醚（ISO）是一种常用的吸入麻醉剂，通过抑制炎症反应具有神经保护作用[7]但其对反应性NHAs的调节作用尚未报道。已经证明miR-206能够抑制炎症反应以减轻神经痛[8]并且还调节神经细胞的增殖和细胞凋亡[9]，但在NHA细胞的作用是未知的。生物信息学研究表明，脑源性神经营养因子（BDNF）是miR-206的靶蛋白，并已被证明是用于治疗神经变性疾病的治疗[一个重要目标10]。因此，本研究旨在调查ISO对增殖，细胞凋亡和炎症通过所述miR-206 / BDNF轴感应脂多糖NPS细胞的反应的影响。

2。材料和方法

2.1。细胞系和试剂

nha(猫。号1800)，购自上海富蒙基因生物科技有限公司。DMEM全培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、Lipofectamine 2000转染试剂、一步反转录试剂盒、TRIzol试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒购自Thermo Fisher。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海生物技术生物工程有限公司。ELISA试剂盒购自上海嘉兴生物科技有限公司。RIPA细胞裂解液购自北京索来宝科技有限公司LPS收购自上海固辰生物科技有限公司。异氟醚购自济南惠丰达化工有限公司BDNF一抗、二抗购自武汉爱美捷科技有限公司

2.2。细胞培养

n已中培养并在含有10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素的DMEM的培养基中培养，并培养在37℃，5％CO₂孵化器。培养基每天都在更换。传代在70 - 80%的汇合处进行，第3 - 4代细胞用于后续实验。

药物治疗。在对数生长期n已被采取，并用不同浓度的LPS（0处理过的 μ0.2 g / mL,μ克/毫升，0.5 μ克/毫升，和1 μg/mL）24小时，选择合适的LPS浓度。脂多糖治疗24小时后（0.5 ）μ克/毫升）中，n已被放置在封闭的麻醉箱。入口端连接到一个ISO气体挥发，和95％空气和5％CO₂在获得通过该出口端被连接到麻醉气体监视器为ISO浓度检查。Different concentrations of ISO (0.7%, 1.4%, and 2.1%) were passed in for 2 h, and then cell proliferation, apoptosis, and inflammatory factors were measured.

2.3。细胞转染

n已在对数生长期拍摄，接种到6孔板中，并培养在37℃，5％CO₂孵化器。当细胞融合达到70~80%时，将miR-206 mimics、anti-miR-206、NC-mimics和si-BDNF转染到NHAs中，在5% CO中培养₂使用前在37°C下培养48小时。

2.4。NHA增殖活性测定采用MTT

取对数生长期每组NHAs进行检测，接种于96孔板，密度为 细胞/。10μ培养0、24、48、72、96 h后，加入L MTT溶液，再培养4 h，吸取培养上清，100 μ加入二甲基亚砜(DMSO) L;最后，使用微平板阅读器在450nm处测量吸光度(OD)。

2.5。NHA凋亡率通过膜联蛋白V-FITC / PI双染色检测

NHAs to be tested in each group were collected and cultured for 48 h and digested with 0.25% trypsin and centrifuged at 1000 r/min for 5 min. After that, the cells were adjusted to a concentration of 细胞/ mL，和5 μ大号的膜联蛋白V-FITC溶液中加入并充分混合。After homogenization, the cells were incubated at room temperature for 15 min in the dark, then 5 μ加入PI染色液L，混匀，孵育5 min;最后用流式细胞术检测NHAs的凋亡水平。

2.6。IL-6的表达，IL-1β和TNFαELISA法测定NHAs

各组n已的收集和制备成细胞悬浮液进行测试，和IL-6的表达，IL-1β和TNFα在n已被根据相应的ELISA试剂盒的说明书来确定。

2.7。通过qPCR测量n已表达的miRNA

使用TRIzol法提取总RNA，根据miRNA逆转录试剂盒的指令逆转录到cDNA中。qPCR按照miRNA qPCR试剂盒上的说明使用。以U6为内参，引物序列见表1。相对表达，使用2计算^-ΔΔCt。

2.8。通过检测免疫印迹在n已表达BDNF

取对数生长期各组NHAs, PBS洗涤2次。总共是0.5μg/mL LPS were added to the experimental group, and cells were rinsed with PBS twice after 24 h of culture. After that, 1 mL of PBS was added before centrifugation (3000 r/min) for 5 min. After centrifugation, the supernatant was discarded, and the cells were washed three times by adding icy PBS before the addition of the RIPA lysis buffer. The BCA protein quantification kit was used to determine the protein concentration. An equal amount of protein samples was then taken from each group for the SDS-PAGE electrophoresis. After electrophoresis, the SDS-PAGE gel was transferred to a PVDF membrane and placed in a 5% skim milk powder for blockage for 1.5 h. A primary antibody (1 : 1000) was added and incubated at 4°C overnight. On the next day, after washing the membrane once with TBST, an HRP-labeled secondary antibody (1 : 5000) was added to the sample and incubated for 1.5 h at room temperature. After that, the membrane was washed three times with TBST, and the ECL kit was used for the development of the protein bands. The ImageJ software was then used to analyze the grayscale of the bands and calculate the relative expression.

2.9。针对双荧光素酶报告基因验证的miR-206与BDNF的关系

利用StarBase数据库预测miR-206与BDNF的结合位点。构建BDNF野生型载体（WT-BDNF），利用基因突变技术改变miR-206与BDNF的结合位点，用同样的方法构建BDNF突变载体（MUT-BDNF）。将WT-BDNF或MUT-BDNF与miR-206-mimics或miR-NC共转染NHAs培养48小时，用荧光素酶双报告基因试剂盒测定各组的荧光素酶活性[8]。

2.10。统计分析

在这项研究中所有实验重复三次，数据表示为 。采用GraphPad 7.0软件进行统计分析和相关图形绘制。 -两组间比较采用检验，多组间比较采用单因素方差分析。 和 表示在统计上有显著差异。

3.结果

3.1。ISO对脂多糖诱导的NHAs增殖、凋亡和炎症反应的影响

MTT结果表明，不同浓度LPS（0.0 ）处理NHAs后，细胞增殖能力呈剂量依赖性增加μ0.2 g / mL,μ克/毫升，0.5 μ1.0 g / mL,μg / mL)(图1(一), ）LPS浓度为0.5时，细胞增殖活性无显著差异μ克/毫升和1 μ克/毫升。后n已首先用0.5处理过的 μ加入g/mL LPS、不同浓度的ISO(0.7%、1.4%、2.1%)，发现NHAs的增殖活性在2h后最低，为1.4%(图2)1 (b), ）。采用MTT法、Annexin V-FITC/PI法、ELISA法检测细胞增殖活性、凋亡率、IL-6、IL-1β和TNFαNC组，LPS组，和LPS + ISO组中n已表达。显示的结果表明，与NC组，增殖活性和IL-6的表达，IL-1相比β和TNFα均显著增加，细胞凋亡速率的LPS组中显著降低，而LPS + ISO组颠倒上NHA增殖，细胞凋亡和炎症反应的LPS的附图中的效果（1 (c)- - - - - -1 (e)所有 ）。因此，综合考虑，ISO可以逆转LPS对NHAs增殖和炎症反应的促进作用以及对凋亡的抑制作用。

3.2。ISO上调的的miR-206表达n已

qPCR结果显示LPS可显著抑制mirna的表达[2,11- - - - - -13]与增殖相关和n已凋亡（ , ）和加法ISO的扭转这些抑制效果在一定程度上。特别是，所有检查的miRNA中，的miR-206是最显著逆转一个（图2, ）。因此，可以得出结论，在ISO上调n已的miR-206的表达。

3.3。mir - 206表达下调脑源性神经营养因子

生物信息学数据库母星被用于预测BDNF为的miR-206（图的潜在靶基因图3（a））。双荧光素酶报告基因的结果显示了miR-206的过表达显著降低了WT-BDNF质粒的荧光素酶活性（ ）;但对MUT-BDNF质粒的荧光素酶活性无明显影响( ）。Western印迹结果（图图3（c）)也证实过表达miR-206可显著抑制NHAs ( ）。这些结果表明了miR-206的针对性和下调BDNF表达。

3.4。ISO规定的LPS诱导的增殖，凋亡，和经由所述miR-206 / BDNF轴n已的炎症反应

Western印迹法检测表达BDNF在n已用LPS处理后，结果表明，撞倒BDNF后，在n已BDNF表达显著降低（ ）;此外，BDNF和miR-206的同时敲弱后，BDNF表达显著单独用BDNF的敲低相比增加（ ）并有与NC组相比无显著差异。n已用LPS，MTT处理后，膜联蛋白V-FITC / PI，和ELISA用于检测增殖活性，凋亡率，IL-6，IL-1βNHAs在NC组、ISO组、ISO+anti-miR-206组、ISO+si-BDNF组、ISO+anti-miR-206+si-BDNF组中的表达。结果表明，与NC组相比，IL-6、IL-1的增殖活性均有显著提高β和TNFαn已在ISO组的表达显著减少，而凋亡率显著增加，而另外的抗miR-206有效地扭转上n已增殖，细胞凋亡和炎症反应的ISO的影响。然而，ISO + SI-BDNF组中，上n已增殖，细胞凋亡和炎症反应中的ISO组的效果进一步提高。与ISO +抗miR-206组，增殖活性和ISO +抗miR-206 + SI-BDNF组中n已细胞的炎症反应相比被减少，而凋亡速率增加。

与ISO + SI-BDNF基，增殖活性，并在ISO +抗miR-206 + SI-BDNF组升高n已的炎症反应，而凋亡率降低相比，示于图4（b）- - - - - -4（d）(所有 ）。综上所述，ISO可能通过调节miR-206/BDNF轴来逆转LPS对NHAs的影响，包括促进增殖、炎症反应和抑制凋亡。

4.讨论

正常人NHAs是中枢神经系统中含量最丰富的细胞类型，为神经元提供营养支持，维持中枢神经系统的功能[14]。研究表明，NHAs的功能受小胶质细胞、微生物和内部环境的调节[15]和炎症环境的刺激下，n已可以失去大部分的正常星形细胞机能，并获得新的神经毒性函数[16]。还已经报道，NHA细胞来源的炎症是急性或慢性的损伤的中枢神经系统中的常见成分[17]在神经炎症引起的各种神经退行性变的发病机制中起着关键的调节作用[18]。在我们的研究结果发现，LPS能促进细胞增殖和细胞NHA炎症反应并抑制其凋亡。

ISO是一种常用的吸入性麻醉剂，广泛应用于各类手术中维持全身麻醉。此外，ISO还具有抗炎、抗氧化和凋亡作用[1]。据报道，ISO可以通过减少中性粒细胞功能和抑制细胞因子调节免疫和炎症反应被巨噬细胞释放并减弱自然杀伤细胞对干扰素的反应α4，最后通过降低全身性炎症和抑制细胞因子发挥抗炎作用由单核细胞和巨噬细胞释放[释放19]. 此外，研究表明ISO能够保护脑损伤。例如，瑞士[7等研究发现，ISO显著降低了oxophosphate致大鼠癫痫状态模型的晚期脑损伤。然而，ISO是否调节NHA细胞来源的反应性炎症尚未见报道。我们的结果发现，ISO可以抑制lps诱导的NHAs细胞的增殖和炎症反应，促进NHAs细胞的凋亡。

miR-206已被证明与神经元激活和神经炎症有关[20]和异常低慢性神经病的大鼠的血清中表达[21]。此外，的miR-206可以调节炎症反应。例如，的miR-206的过表达可通过抑制神经炎症[降低由大鼠小胶质细胞ZEB2的过表达神经性疼痛22]。BDNF产生和由神经元分泌的，它可以促进轴突以自分泌的方式发展，并且它是在脑电路的发展[必不可少3.]。此外，BDNF，如神经营养蛋白，起着中枢神经系统的可塑性中起重要作用并且还参与神经系统疾病的发病机制[23，成为神经退行性疾病治疗的重要靶点。本研究结果表明，ISO可以上调miR-206的表达，而miR-206可以通过下调BDNF的表达，抑制lps诱导的胶质细胞增殖、炎症，促进其凋亡。

综上所述，ISO可通过上调miR-206的抑制作用，抑制LPS诱导的NHAs增殖，促进细胞凋亡，减轻病理条件下的炎症反应。

数据可用性

所有数据可在我们的实验室记录的手写笔记本电脑。

的利益冲突

作者宣称，有兴趣就本文发表任何冲突。

致谢

这项工作是由浙江省科技厅项目（编号2013C33216）的支持。

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